Name: Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer hoe je proliferatieve tetraploïde cellen opzet uit humane fibroblasten zonder diploïde populatie. Deze methode met demecolcine en shake-off helpt bij onderzoek naar chromosomale instabiliteit en carcinogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij bedanken Mevrouw Matsumoto voor de technische assistentie.

1. Cultuur van de Cel <ol><li> Het verkrijgen van de cellen om tetraploidy induceren. Tot op heden is het bevestigd dat deze techniek kan worden toegepast op de humane fibroblast cellijnen TIG-1, BJ, IMR-90 en telomerase-geïmmortaliseerde TIG-1 (TIG-HT). </li><li> Groeien cellen in minimaal essentieel medium met α wijziging of enig ander celkweekmedium geschikt voor het celtype te onderzoeken aangevuld met 10% (v / v) hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) door incubatie in een 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Passage cellen elke 3 of 4 dagen niet subconfluente dichtheid overschrijden. OPMERKING: populatieverdubbelingstijd level (PDL) wordt berekend telkens bij passage om celgroei en leeftijd evalueren. PDL kan worden berekend uit het aantal cellen gezaaid in een schaal (N1) en het aantal cellen geoogst bij de volgende passage (N2) met de volgende formule (X is de eerste PDL). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2 </li></ol> 2. Inductie en Establishment van Tetraploïde Cellen uit diploïde fibroblasten <ol><li> Induceren tetraploidy zonder shake-off. LET OP: Sommige mobiele stammen (bijv TIG-1) kan bijna volledig tetraploïde door continue behandeling worden met demecolcine (DC) als volgt. <ol><li> Passage cellen in één of twee 100 mm schalen op de dag vóór de behandeling induceren tetraploidy. Meestal, voor te bereiden 5 x 10 5 tot 1 x 10 6 cellen per schotel voor inductie van tetraploïde cellen. </li><li> Behandel exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 ug / ml DC voor 4 dagen. </li><li> Vervang DC-bevattend medium met drug-vrij medium en incubeer cellen in een 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Cellen meestal hervatten proliferatie binnen 1 week. </li></ol></li><li> Induceren tetraploidy met shake-off. OPMERKING: De meeste cellen een mengsel van diploïde en tetraploïde populaties als gevolg van de eenvoudige behandeling met DC hierboven (2.1) beschreven. Daarom enkele wijzigingen in de pROCEDURE te elimineren diploïde populatie nodig als volgt (figuur 1). <ol><li> Passage cellen in meerdere T75 kolven op de dag vóór de behandeling te tetraploidy induceren. Meestal, voor te bereiden van ten minste 5 x 10 6 cellen (1 x 10 6 cellen per fles) voor de inductie van tetraploïde cellen. </li><li> Behandel exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 ug / ml DC voor 16-18 uur om cellen te arresteren in mitose. De tijd die nodig is om cellen in mitose arrestatie kan afhangen van doelcellen en worden bepaald door voorafgaande experimenten zoveel mitotische cellen te krijgen. Zo zou langzamer groeiende cellen worden behandeld met gelijkstroom gedurende langere tijd dan sneller groeiende cellen. OPMERKING: als cellen behandeld te lang in deze stap, kunnen ze mitotische slippen ondergaan en zich aan de schotel oppervlak, waardoor het onmogelijk mitotische cellen door opschudding op te vangen in de volgende stap. </li><li> Verzamel DC-gearresteerd mitotische cellen door de shake-off methode, in which losjes aangehouden mitotische cellen worden verzameld door zacht schudden kolven en wassen met medium, gevolgd door centrifugeren (300 x g, 5 min). Tellen aantal cellen in geschikte omstandigheden in deze stap. </li><li> Reseed verzameld mitotische cellen in 60 mm kweekschalen en behandelen cellen met 0,1 ug / ml DC gedurende nog 3 dagen. Zaad meer dan 1 x 10 6 mitotische cellen per schaal, omdat minder dan 10% van de cellen deze behandeling kan overleven. </li><li> Vervang DC-bevattend medium met een drug-vrij medium en wacht tot cellen proliferatie, die meestal optreedt binnen 1 week te hervatten. </li></ol></li><li> Passage cellen vergelijkbaar met originele diploïde cellen. </li></ol> 3. Onderzoek van DNA Ploïdie LET OP: Dit is een gevestigde procedure en een technische handleiding moet voor gedetailleerde procedures en technische tips worden aangeduid. <ol><li> Harvest-cellen (5 x 05-01 oktober x 10 6) door incubatie van cellen met een oplossing conbevattende 0,05% trypsine en 0,02% EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C en trypsine te neutraliseren door medium dat 10% FBS. </li><li> Centrifugeer cellen in medium en wassen door resuspenderen in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door centrifugatie (300 x g, 5 min). </li><li> Bereid cellen voor DNA-analyse met één van de volgende twee methoden <ol><li> Werkwijze voor het analyseren van niet gefixeerde cellen 10 Opmerking: Deze methode kan worden uitgevoerd met een commercieel verkrijgbare kit voor celcyclusanalyse. Monsters bereid met deze methode moeten onmiddellijk worden geanalyseerd, omdat de cellen niet in de procedure worden gefixeerd en gekleurd kernen zal beschadigd na verloop van tijd. <ol><li> Was de cellen met 40 mM citraatbuffer met 250 mM sucrose. Vervolgens cellen te behandelen met 250 pl 0,1% (v / v) Nonidet P40 en 30 ug / ml trypsine in 200 ui 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 200 pl 0,5 ug / ml trypsine inwibitor en 0,1 ug / ml RNase A in 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose en incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 200 ul van 0,4 mg / ml propidiumjodide (PI) in 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose en incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur celkernen vlek. </li></ol></li><li> Werkwijze voor de analyse van gefixeerde cellen <ol><li> Fix cellen met 80% ethanol door het suspenderen van cellen in 1 ml PBS, het toevoegen van 4 ml 100% EtOH druppelsgewijs onder mengen de celsuspensie en laat het bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Cellen in dit fixeermiddel kan meerdere weken bewaard bij -20 ° C. </li><li> Was de cellen door ze te resuspenderen in 5 ml PBS, gevolgd door centrifugatie (300 x g, 5 min). Behandel de cellen met 0,5 mg / ml RNase A en vlekken ze met 50 ug / ml propidiumjodide (PI) (475 pl 0,5 mg / ml RNase A en 25 ui 1 mg / ml PI) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li></ol></li><li> Analyseer DNA-gehalte van thij cellen met behulp van een flowcytometer met een 488 nm laser en rode kanaal emissie-filter (lange pass&gt; 610 nm). Analyseren van een referentiemonster bereid uit echte diploïde cellen tegelijk te ploïdie van de doelcellen te beoordelen. <ol><li> Alternatief voeg fluorescentie standaard kralen om de fluorescentie-intensiteit verhouding van diploïde cellen versus de korrels beoordelen. Gebruik de &#39;pulse hoogte versus pulsbreedte&#39; optie van de flowcytometer om onderscheid te maken tussen enkele tetraploïde cellen en massa&#39;s van diploïde cellen 11. </li></ol></li></ol> 4. Onderzoek van chromosoom Telt en Karyotype Analyse LET OP: Dit zijn allemaal gevestigde procedures en een technische handleiding of protocollen van de fabrikant moet voor gedetailleerde procedures en technische tips worden aangeduid. <ol><li> Behandel exponentieel groeiende cellen met 0,1 ug / ml DC 4 uur om cellen te arresteren in metafase. </li><li> Bereid chromosoom slides. <ol><li&gt; Oogst cellen (tenminste 5 x 10 5 cellen) door behandeling met trypsine en op te schorten in medium met FBS. </li><li> Centrifugeer cellen in medium (300 xg, 5 min) en behandel met hypotone oplossing (5 ml 0,075 M KCl) bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Fix en te schorten cellen in fixatief Carnoy&#39;s (methanol: azijnzuur = 3: 1). </li><li> Cellen uitgespreid op een glasplaatje druppelsgewijs een klein volume (25-35 pi) van celsuspensie. Aanvullende stappen zoals blootstelling aan hete stoom kan nodig zijn chromosoom verbeteren verspreiden. </li></ol></li><li> Stain cellen voor chromosoom tellingen of karyotype analyse of multicolor fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH). <ol><li> Chromosoom telt. <ol><li> Stain cellen met 5% Giemsa-oplossing (of 5 ug / ml PI bevattende 0,5 mg / ml RNase A fluorescentiemicroscopie) gedurende 15 - 20 min. </li><li> Digitaal fotograferen ten minste 50 metafase. </li><li> Tellen aantal chromosomen per cel met behulp van een beeldanalyse Software na handmatige scheiding van het aanraken en overlappende chromosomen met behulp van een foto-editing software. Hoewel chromosoom nummer handmatig kan worden gescoord, wordt geautomatiseerd scoren aanbevolen. </li></ol></li><li> karyotype analyse LET OP: Deze analyse moet worden uitgevoerd door een vakman of een professioneel bedrijf. <ol><li> Stain cellen volgens een standaard G-banding techniek 12. </li><li> Analyseer chromosomen standaard karyograms 12 te maken. </li></ol></li><li> mFISH OPMERKING: Deze stap is optioneel en moet worden uitgevoerd indien nodig. <ol><li> Vlek cellen met behulp multicolor FISH probes voor menselijke chromosomen volgens het protocol van de 13 fabrikant. </li><li> Analyseer chromosomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met geschikte filters en software voor mFISH analyse 13. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rabinovitch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+progression+in+Barrett%27s+esophagus+III%3A+baseline+flow+cytometric+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables.</a> Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).</li>
<li>Galipeau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+modulate+CDKN2A%2C+TP53%2C+and+DNA+content+risk+for+progression+to+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma.</a> PLoS Med. 4 (2), e67(2007).</li>
<li>Olaharski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploidy+and+chromosomal+instability+are+early+events+during+cervical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-independent+abrogation+of+a+postmitotic+checkpoint+contributes+to+human+papillomavirus+E6-induced+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy.</a> Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).</li>
<li>Davoli, T., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+and+consequences+of+polyploidy+in+normal+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).</li>
<li>Fox, D., Duronio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreplication+and+polyploidy%3A+insights+into+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease.</a> Development. 140, 3-12 (2013).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437, 1043-1047 (2005).</li>
<li>Ganem, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+triggers+hippo+tumor+suppressor+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation.</a> Cell. 158 (4), 833-848 (2014).</li>
<li>Kuznetsova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability%2C+tolerance+of+mitotic+errors+and+multidrug+resistance+are+promoted+by+tetraploidization+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells.</a> Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).</li>
<li>Vindeløv, L., Christensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+and+proteolytic+enzyme-based+techniques+for+nuclear+isolation+and+DNA+content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Juan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+measurement+for+DNA+ploidy+and+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis.</a> Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).</li>
<li>Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+analysis+guidelines+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Chromosome analysis guidelines preliminary report.</a> Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).</li>
<li>Liehr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+FISH+probe+sets+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Multicolor FISH probe sets and their applications.</a> Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bipolar+spindles+with+two+centrosomes+in+tetraploid+cells+established+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts.</a> Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts.</a> Front. Oncol. 3, 198(2013).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+telomerase-immortalized+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosome+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts.</a> Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).</li>
<li>Di Leonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rereplication+in+the+presence+of+mitotic+spindle+inhibitors+in+human+and+mouse+fibroblasts+lacking+either+p53+or+pRb+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function.</a> Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).</li>
<li>Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+state+induces+p53-dependent+arrest+of+nontransformed+mammalian+cells+in+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+of+the+mitotic+spindle+assembly+checkpoint+with+p53+to+prevent+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy.</a> Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).</li>
<li>Aylon, Y., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+Guardian+of+ploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">p53: Guardian of ploidy.</a> Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).</li>
<li>Uetake, Y., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+progression+after+cleavage+failure+%3A+mammalian+somatic+cells+do+not+possess+a+%26%2334%3Btetraploidy+checkpoint%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a &#34;tetraploidy checkpoint&#34.</a> J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).</li>
<li>Ganem, N., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+the+proliferation+of+polyploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting the proliferation of polyploid cells.</a> Cell. 131, 437-440 (2007).</li>
<li>Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+of+p53+for+maintaining+chromosomal+stability+during+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization.</a> Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financieel belang.

Een groot probleem bij inductie van tetraploidy uit diploïde cellen door chemische middelen, door cytokinese remmers of spindel remmers, is dat cellen vaak een mengsel van diploïde en tetraploïde bevolkingen en tetraploïde cellen moeten worden gescheiden van diploïde cellen. De meest voorkomende methoden voor het isoleren van een tetraploïde bevolking vrij van diploïde cellen gebruiken FACS of het klonen door beperkende verdunning. Echter, deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren. In dit rapport...

Polyploïdie waargenomen niet alleen in gespecialiseerde weefsels van zoogdieren maar ook in een verscheidenheid van pathologische aandoeningen, zoals kanker en degeneratieve ziekten. Polyploïde (meestal tetraploïde) cellen worden vaak waargenomen in preneoplastische laesies van menselijke weefsels, zoals de oesophagus of 1,2 squameuze intra-epitheliale laesies van de cervix 3,4 Barrett&#39;s en werden beschouwd als de bron van kwaadaardige aneuploïde cellen in deze weefsels 5 , 6. Ofschoon wordt voorgesteld omzetting van tetraploïde tot aneuploïde cellen een belangrijke gebeurtenis in de vroege stadia van tumorigenese kan zijn, worden de hierbij betrokken mechanisme niet volledig begrepen. Dit komt deels omdat er geen in vitro model beschikbaar is geweest, waar niet-getransformeerde polyploïde menselijke cellen kunnen voortplanten. Sommige onderzoekers hebben veroorzaakt tetraploidy in niet-getransformeerde humane epitheelcellen door de generatie van binucleaire cellen door inhibiting cytokinese 7-9. Bij deze werkwijze echter onnodig diploïde cellen geëlimineerd worden door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 7,8 of kloneren door beperkende verdunning 9. Omdat deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren, eenvoudigere methoden voor het vaststellen getransformeerde tetraploïde cellen gewenst voor onderzoek op dit gebied. In dit rapport beschrijven we een protocol om proliferatieve tetraploïde cellen uit normale menselijke fibroblasten of-telomerase onsterfelijk gemaakte humane fibroblasten vast te stellen door een relatief eenvoudige procedures. De procedures spil poison demecolcine (DC) aan diploïde cellen in mitose, en mitotische cellen door afschudden worden verder behandeld met DC verzameld arresteren. Diploïde mitotische cellen behandeld met DC voor langere tijd om te zetten in tetraploïde G1 cellen en deze cellen zich vermenigvuldigen als tetraploïde cellen na groeistop voor enkele dagen na verwijdering drug. Dit protocol biedteen efficiënte methode voor het maken van een bruikbaar model om de relatie tussen chromosomale instabiliteit en het oncogene potentieel van polyploïde menselijke cellen te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>MEM-&alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Demecolcine solution (10 &mu;g/mL in HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1925-10ML</td><td></td></tr><tr><td>BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits</td><td>BD Biosciences</td><td>#340242</td><td>Voor onderzoek van DNA-ploïdie door flowcytometrie</td></tr><tr><td>Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte</td><td>MetaSystems</td><td>#D-0125-060-DI</td><td>Gespecialiseerde filterset en software voor mFISH-analyse zijn noodzakelijk</td></tr><tr><td>Isis imaging system met mFISH&nbsp; software&nbsp;</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>Gespecialiseerde sondekit is noodzakelijk</td></tr></tbody></table>

oprichting van proliferatieve tetraploïde cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploïde (meestal tetraploïde) cellen worden vaak waargenomen in preneoplastische laesies van menselijke weefsels en hun chromosomale instabiliteit wordt beschouwd als verantwoordelijk voor carcinogenese in dergelijke weefsels. Hoewel prolifererende polyploïde cellen noodzakelijk zijn voor het analyseren van chromosomale instabiliteit van polyploïde cellen, is het creëren van dergelijke cellen uit niet-getransformeerde menselijke cellen vrij uitdagend. Inductie van tetraploïdie door chemische agentia resulteert meestal in een mix van diploïde en tetraploïde populaties, en de meeste studies maakten gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering of klonen door beperkte verdunning om tetraploïde van diploïde cellen te scheiden. Deze procedures zijn echter tijdrovend en arbeidsintensief. Het huidige rapport beschrijft een relatief eenvoudig protocol om prolifererende tetraploïde cellen te induceren uit normale menselijke fibroblasten met minimale besmetting door diploïde cellen. In het kort bestaat het protocol uit de volgende stappen: het arresteren van cellen in mitose door demecolcine (DC), het verzamelen van mitotische cellen na afshakelen, het incuberen van verzamelde cellen met DC gedurende nog eens 3 dagen, en het incuberen van cellen in geneesmiddelvrij medium (Ze hervatten de proliferatie als tetraploïde cellen binnen enkele dagen). Afhankelijk van het celtype kan het verzamelen van mitotische cellen door afshakelen worden weggelaten. Dit protocol biedt een eenvoudige en haalbare methode om prolifererende tetraploïde cellen uit normale menselijke fibroblasten te etaleren. Tetraploïde cellen die met deze methode zijn opgezet, kunnen een nuttig model zijn voor het bestuderen van chromosoom-instabiliteit en het oncogeen potentieel van polyploïde menselijke cellen.

In onze ervaring, kunnen TIG-1-cellen bijna volledig tetraploïde worden gemaakt door eenvoudige continue behandeling met 0,1 ug / ml DC voor 4 dagen (Figuur 2A). Daarentegen andere fibroblast stammen, zoals BJ of IMR-90 en TIG-HT cellen, werd een mengsel van diploïde en tetraploïde populaties na dezelfde behandeling, en isolatie van mitotische cellen door de schok uit staat moet in de loop DC behandeling (gewoonlijk 16-18 uur na de start van de behandeling) (figu...

Hoewel prolifererende polyploïde cellen noodzakelijk zijn om chromosomale instabiliteit van polyploïde cellen te analyseren, is het niet eenvoudig om dergelijke cellen te creëren vanuit niet-getransformeerde menselijke cellen. Het huidige rapport beschrijft relatief eenvoudige procedures om proliferatieve tetraploïde cellen te vestigen, vrij van een diploïde populatie, afkomstig van normale menselijke fibroblasten.

Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Het algemene doel van deze procedure is om proliferatieve tetraploïde cellen, vrij van een diploïde populatie, te kweken uit normale menselijke fibroblasten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het onderzoeksgebied van carcinogenese te beantwoorden, zoals hoe aneuploïde cellen zich ontwikkelen in de vroege stadia van carcinogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat proliferatieve tetraploïde cellen, vrij van een diploïde populatie, kunnen worden gevestigd door relatief eenvoudige procedures.Terwijl sommige stammen volledig tetraploïde worden door eenvoudige behandeling met spindle poison, demecolcine, moet de meeste worden behandeld met de shake-off methode tijdens die behandeling om een diploïde populatie te simuleren. Om de inductie van tetraploïdie te beginnen zonder de shake-off methode, pas ongeveer vijf keer 10 tot de 1/5 gekweekte cellen over in een 100-millimeter schaal. Incubeer de schaal in een 5% koolstofdioxide atmosfeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.Behandel daarna de exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 microgram per milliliter DC bevat. Incubeer in een 5% koolstofdioxide atmosfeer bij 37 graden Celsius gedurende vier dagen. Vervolgens vervang het DC-bevattend medium met geneesmiddelvrij medium. Incubeer in 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius tot de proliferatie hervat.Om tetraploïdie te induceren met behulp van de shake-off methode, pas de gekweekte cellen over in T-75 flacons, zorg ervoor dat elke flacon minstens een keer 10 tot de 1/6 cellen bevat. Incubeer de flacons in een 5% koolstofdioxide atmosfeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag behandel de cellen met medium dat DC bevat gedurende 16 tot 18 uur om ze te arresteren in mitose zoals beschreven in het tekstprotocol.Na incubatie, controleer de cellen in een flacon onder de omgekeerde fasecontrastmicroscoop. En schud vervolgens voorzichtig elke flacon om de verzameling van losjes aangehechte mitotische cellen te beginnen. Onzorgvuldige behandeling, zoals gewelddadig schudden of het aanraken van het oppervlak van de flacon door de pipettepunt, moet worden vermeden.Besmet de mitotische cellen niet met aangehechte interfacecellen. Was de flacons voorzichtig met warm medium, en breng de cellen over naar centrifugeerbuizen. Gebruik een atomische celteller om het aantal cellen te tellen.Na het tellen van cellen, centrifugeer bij 300 keer g gedurende vijf minuten. Zaai de verzamelde mitotische cellen opnieuw in 16-millimeter kweekschalen. Behandel vervolgens de geplateerde cellen met medium dat 0,1 microgram per milliliter DC bevat. Incubeer in 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen.Vervang daarna het DC-bevattend medium met geneesmiddelvrij medium. Incubeer in een 5% koolstofdioxide atmosfeer bij 37 graden Celsius tot de proliferatie hervat. Voor analyse van DNA-ploïdie, was de cellen met PBS.Voeg vervolgens een oplossing toe die 0,05% trypsine en 0,02% EDTA bevat aan de cellen. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Transfer daarna de celsuspensie naar een centrifugeerbuis.En neutraliseer het trypsine door medium toe te voegen dat 10% foetaal bovien serum bevat. Centrifugeer de cellen in medium bij 300 keer g gedurende vijf minuten. Resuspendeer de cellen in vijf milliliter PBS.Centrifugeer vervolgens opnieuw bij 300 keer g gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens de cellen in één milliliter PBS. Voeg vier milliliter 100% ethanol druppelsgewijs toe met mengen.Laat de suspensie gedurende 30 minuten op kamertemperatuur rusten om de cellen te fixeren. Centrifugeer daarna de cellen in fixeeroplossing bij 300 keer g gedurende vijf minuten. En resuspendeer de cellen in vijf milliliter PBS.Centrifugeer de suspensie bij 300 keer g gedurende vijf minuten. Behandel vervolgens de cellen met 475 microliter 0,5 milligram per milliliter RNA-oplossing. Voeg 25 microliter van een een milligram per milliliter propidium jodium oplossing toe om de cellen te kleuren.Meng vervolgens. Laat de suspensie gedurende 30 minuten op kamertemperatuur rusten. Gebruik vervolgens een flow cytometer met een 488 nanometer laser en rood kanaal emissiefilter om de DNA-inhoud van de cellen te analyseren.Analyseer ook een referentiemonster dat is bereid uit echte diploïde cellen om de ploïdie van doelcellen te beoordelen. Om te beginnen, behandel exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 microgram per milliliter DC bevat gedurende vier uur om de cellen in metafase te arresteren. Verzamel daarna minstens vijf keer 10 tot de 1/5 cellen door trypsinisatie.Suspendeer de geoogste cellen in medium dat FBS bevat. Centrifugeer de suspensie bij 300 keer g gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens vijf milliliter van een 0,075 molaire kaliumchloride oplossing toe.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na voltooiing van de incubatie, centrifugeer de suspensie bij 300 keer g gedurende vijf minuten. Resuspendeer de cellen in vijf milliliter Carnoy's fixatief.En centrifugeer vervolgens de suspensie bij 300 keer g gedurende vijf minuten. Aspibeer vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in 0,5 milliliter Carnoy's fixatief. Laat 30 microliter van de celsuspensie vallen op een glasplaat.Verkleed en analyseer tenslotte de cellen via chromosoomtelling of karyotype-analyse. In deze studie worden proliferatieve tetraploïde cellen, vrij van een diploïde populatie, gekweekt uit normale menselijke fibroblasten. Hoewel sommige celstammen volledig tetraploïde kunnen worden door continue behandeling met DC, moet de meeste cellen worden behandeld met de shake-off methode tijdens het behandelingsproces om een diploïde populatie te elimineren.Een chromosoomtelling wordt uitgevoerd in de gevestigde tetraploïde cellen. Zoals te zien is, is het modale chromosoomnummer 92 voor zowel TIG-1 als BJ cellen, en 91 voor TIG-hT cellen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee weken worden uitgevoerd als het goed wordt uitg

establishment-proliferative-tetraploid-cells-from-nontransformed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe's), rijk aan myofibroblasten aanwezig in de tumor stroma, spelen een belangrijke rol in het besturen van tumorprogressie. We ontwikkelden een coimplantation tumor xengraft model voor het genereren van experimenteel CAFS uit humane fibroblasten borstklieren. Het protocol beschrijft hoe om vast te stellen CAF myofibroblasten dat het vermogen om tumorgenese bevorderen verwerven.

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Leer hoe je proliferatieve tetraploïde cellen opzet uit humane fibroblasten zonder diploïde populatie. Deze methode met demecolcine en shake-off helpt bij onderzoek naar chromosomale instabiliteit en carcinogenese.

Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten

Meer video's verkennen