Name: Dissectie en observatie van Honey Bee Dorsale Vessel voor Studies van de hartfunctie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Leer een eenvoudige dissectiemethode om het dorsale vaatstelsel van honingbijen bloot te leggen en hartfrequentieveranderingen te observeren na toepassing van cardiomodulerende stoffen. Deze techniek biedt waardevolle inzichten in de insectenfysiologie en de gezondheid van bestuivers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Drs. Jeffrey Bloomquist en Daniel Swale voor hun technische opmerkingen en suggesties. Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door het Department of Entomology en het College of Agriculture and Life Sciences van Virginia Tech.

1. Verzameling en bereiding van Proefpersonen <ol><li> Verzamel het juiste aantal bijen uit de kolonie. OPMERKING: Het aantal benodigde afhankelijk van niet alleen de omvang en reikwijdte van het experiment, maar ook de vaardigheid van de onderzoeker. Bijvoorbeeld, als er 2 behandelgroepen met een gewenste steekproefomvang van 10 bijen per groep, kan een redelijk bekwame onderzoeker laat tenminste 30 bijen te verantwoorden mislukte ontledingen en eindigen met 20 nuttige video te scoren. </li><li> Het minimaliseren van de hoeveelheid tijd die verstrijkt tussen het verzamelen en dissectie. Opmerking Hoewel bijen kunnen worden ondergebracht in het lab dagen voorafgaand aan dissectie het slagingspercentage van dissecties (dwz, de waarschijnlijkheid van een stabiel hartritme in een ontleed dorsale vat) waargenomen relatieve dalen tot de hoeveelheid tijd die bijen zijn weg uit de kolonie gevestigd. <ol><li> Zorg voor bijen met een bron van water en voedsel, terwijl gehuisvest in het lab. voor EXAmple ten minste toegang tot een 50% (w / v) oplossing van sucrose in water (voldoende voor een duur van minder dan 6 uur). Voor langere periodes, leveren bijen toegang tot honing. </li><li> Huis bijen in het lab nacht bij een temperatuur van ongeveer 32 ° C en 60-80% relatieve vochtigheid te verminderen stress en uitdroging te voorkomen. </li></ol></li><li> Voorafgaand aan de dissectie, verdoven bijen kort om te helpen bij de behandeling. LET OP: Dit kan het slagingspercentage van ontledingen verminderen en throughput te verminderen. <ol><li> Koel de bijen ofwel door ze op ijs of in een koelkast net lang genoeg om beweging om te helpen bij de behandeling verminderen. </li><li> Als alternatief kort bloot bijen om de CO 2 om te helpen bij de behandeling. LET OP: Langdurige blootstelling aan koude kan de slaagkans van dissecties te verminderen. Verlengde of herhaalde blootstelling aan CO 2 kan verminderen ook de slaagkans van dissecties. </li></ol></li></ol> 2. Dissectiondorsale buikwand OPMERKING: bijen opengehouden ten tijde van dissectie. <ol><li> Gebruik pincet en / of microdissectie schaar, verwijder poten en vleugels dissectie van de buik te vergemakkelijken. Houd een kleine beker of dergelijke bak met gedestilleerd water omgeving ten behoeve van het spoelen tussen instrumenten dissecties. </li><li> Terwijl de beteugeling bij met forceps, gebruik de microdissectie schaar lateraal snijden langs de dorsale buikwand tussen de eerste en tweede tergieten (zie figuur 1). </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig1.jpg" /> Figuur 1: Dorsal weergave van bee buik. De eerste snede moet worden gemaakt tussen de eerste en tweede tergieten, zoals aangegeven door de rode lijn. Schaal bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig1large.jpg" target="_blank">Klik op haar</a>e voor een grotere versie van deze figuur te bekijken. <ol start="3"><li> Terwijl licht vastgrijpen van de achterrand van de tweede tergiet met de tang, snijden lengterichting langs elke kant van de bij de eerste insnijding op de stinger (zie figuur 2). Wees voorzichtig bij het snijden om te voorkomen dat aanprikken van het maag-darmkanaal. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig2.jpg" /> Figuur 2: Zij mening van bijen buik. De tweede en derde insnijdingen moeten worden aangebracht ter weerszijden van de buik, zoals aangegeven door de rode lijn. Schaal bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="4"><li> Vervang de schaar voor een tweede set van fijne pincet en ze gebruiken om de dorsale buikwand zorgvuldig te scheiden van de rest of de buik. Verwijder de stinger en een gedeelte van het maagdarmkanaal dat voor het dorsale buikwand bevestigd blijft. Voorkomen scheuren de darm, de inhoud visualisatie van de dorsale vacht vaartuig de buikwand en belemmeren. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig3.jpg" /> Figuur 3: Uitzicht op de dorsale vat. Zodra de darm en stinger zijn verwijderd, de dorsale vat zichtbaar langs de middellijn van het ontlede dorsale buikwand. Schaal bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="5"><li> Rangschik de dorsale buikwand in de gewenste oriëntatie onder de camera zodat de dorsale vaartuig toegankelijk (zie figuur 3). Gebruik maken van de microdissectie schaar om weg te trimmen overtollige abdominal muur die visualisatie van de dorsale vat belemmert. De vorm van de dorsale buikwand moet een ondiepe beker of kom lijken op de juiste wijze gelegen. <ol><li> Omdat de dorsale schip niet uit te breiden naar de achterste abdominale segment van de bij, verwijder de laatste tergiet om visualisatie van de dorsale schip te verbeteren. </li></ol></li><li> Gebruik makend van een regelbaar volume micropipet, bedek de dorsale vat met 10 gl van een isotone oplossing van fysiologische omstandigheden te handhaven en een constante hartslag vergemakkelijken. OPMERKING: De voorgestelde oplossing is H sterkte Ringers oplossing (0,120 g / l calciumchloride, 0,105 g / L kaliumchloride, 0,050 g / l natriumbicarbonaat en 2,250 g / l natriumchloride), waarvan bij een stabiele vergemakkelijken, continue hartslag. </li></ol> 3. observatie en Modulatie van Heart Rate <ol><li> Laat de dorsale vat te zitten ongestoord tot een stabiele, continue hartslag wordt bereikt(Meestal binnen 300 sec). LET OP: Heartbeat wordt gevisualiseerd als ritmische samentrekkingen van de dorsale vat. Aanvankelijk kan er blijken geen hartslag, vooral als de bijen werd verdoofd, maar het hart meestal weer slaan na rust in een isotone oplossing gedurende enkele minuten en kan blijven kloppen uren, mits blijft gebaad in oplossing. </li><li> Meet de hartslag in termen van het aantal beats per minuut (BPM). <ol><li> Noteer het aantal contracties waargenomen tijdens een 60 sec periode. Gebruik een hand telapparaat en een timer om dit proces te vergemakkelijken. </li></ol></li><li> Meet de verandering van de hartfrequentie door registratie van de BPM waargenomen voor en na behandeling met een verbinding cardiomodulatory. LET OP: Hoewel de tijd die nodig is om een ​​effect op de hartslag te observeren kan variëren afhankelijk van de verbinding die wordt getest, kunnen veranderingen in de hartslag doorgaans worden waargenomen binnen enkele minuten. <ol><li> Bepaal de basislijn hartslag onmiddellijk voorafgaand aantoevoeging van een testverbinding. OPMERKING: Post-behandeling hartslag kan doorgaans worden bepaald na 90 tot 120 sec. </li><li> Bereid potentiële cardiomodulators (bijvoorbeeld octopamine) door de verbinding in dezelfde isotone oplossing gebruikt om de dorsale vat baden. </li><li> Voeg de testverbindingen om de oplossing rond de dorsale vat met behulp van een micropipet. </li></ol></li><li> Voor een grotere nauwkeurigheid en hogere doorvoersnelheid, maak een video-opname van elke proefpersoon en vervolgens gebruik maken van de video&#39;s om de hartslag te scoren op een later tijdstip. LET OP: Dit maakt het mogelijk een enkele onderzoeker dissecties wankelen om bijna continue productie van video&#39;s te vergemakkelijken. Bij het opnemen van video&#39;s, de minimaal aanbevolen lengte is ongeveer 240 sec bij elke testverbinding bij de 60 seconden merk wordt toegevoegd. Dit zorgt ervoor dat de onderzoeker een 60 sec venster voor het maken van de uitgangswaarde hartfrequentie en dan nog 60 sec venster voor het maken nabehandeling hartslag 120 secna de behandeling. </li></ol>

<ol><li>Klowden, M. J. Circulatory Systems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlowden%2C+MJ+%22Physiological+Systems+in+Insects%2C+3rd+Edition%22">Physiological Systems in Insects, 3rd Edition</a>. , 3rd, 365-413 (2013).</li>
<li>League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structural+and+functional+analysis+of+the+larval+and+adult+dorsal+vessel+and+its+role+in+hemolymph+circulation+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).</li>
<li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+Hemolymph+Circulation+in+the+Butterfly+Papilio-Machaon+L+Revealed+by+Contact+Thermography+and+Photocell+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements.</a> J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).</li>
<li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+circulation+and+tracheal+ventilation+in+holometabolous+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects.</a> Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).</li>
<li>Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heartbeat+Rate+Modulation+Mediated+by+the+Ventral+Nerve+Cord+in+the+Honey-Bee%2C+Apis-Mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B-Biochem+Syst+Environ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera.</a> J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).</li>
<li>Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+supply+of+the+heart+and+electrocardiogram+potentials+with+reversed+polarity+in+sleeping+and+resting+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees.</a> Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).</li>
<li>Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine--a+single+modulator+with+double+action+on+the+heart+of+two+insect+species+%28Apis+mellifera+macedonica+and+Bactrocera+oleae%29%3A+Acceleration+vs.+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).</li>
<li>Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral-Effects+of+Vehicles+-+Dmso%2C+Ethanol%2C+Tween-20%2C+Tween-80%2C+and+Emulphor-620%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620.</a> Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).</li>
<li>Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+responses+of+the+honeybee+heart+to+nanomolar+concentrations+of+amitraz%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz.</a> Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).</li>
<li>Roeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Octopamine in invertebrates.</a> Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).</li>
<li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een eenvoudige en effectieve aanpak voor het testen van farmacologische verbindingen op hun effecten op de hartslag van honingbijen. Zoals waargenomen in eerdere experimenten waarbij de ventrale zenuwstreng van een levend insect wordt doorsneden5 of de ventrale zenuwstreng wordt geïsoleerd bij het blootleggen van het dorsale vat7, resulteert het verlies van regeling door het centrale zenuwstelsel in een stabiele, lage frequentie hartslag. De lage frequentie van...

Het algemene doel van deze methode is om de onderzoeker om snel en gemakkelijk te observeren en het effect dat een farmacologisch middel heeft op de hartslag van de honingbijen te kwantificeren. Bijen, zoals andere insecten, hebben een open bloedsomloop dat hemolymfe, het insect equivalent van bloed verspreidt gehele lichaamsholte, zogenaamde hemocoel. De circulatie van hemolymfe is essentieel voor het transport van voedingsstoffen, immuunfactoren, afvalproducten, en neurohormonen en andere signaalmoleculen 1. Circulatie wordt vergemakkelijkt door de dorsale vat, die zich langs de dorsale middellijn van het insect, en pulsatiele accessoire organen. De dorsale vat is verdeeld in twee functioneel verschillende secties, aangeduid als het hart in de buik en de aorta in de borst en het hoofd. Gepropageerd contracties in het hart pomp hemolymfe in de richting van de borstkas en hoofd, terwijl het accessoire pulserende organen te garanderen hemolymfe stroom naar de extremiteiten. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Insect hartfunctie kan worden waargenomen met behulp van verschillende methoden, afhankelijk van de grootte, fysiologie of levensstadium van het insect. Een gemeenschappelijke aanpak voor het observeren van de hartslag in larven of kleinere insecten is het gebruik van intravitale beeldvorming 2. Deze methode is minder nuttig bij volwassen bijen, echter, aangezien het moeilijk kan zijn om duidelijk te zien de dorsale vat via de buikwand. Een gevestigde benadering voor het opnemen hartslag diverse insecten zoals bijen, is het gebruik van contact thermografie, die thermistors toegepast op de buitenkant van het insect cardiale pulsaties 3,4 detecteren gebruikt. Hartslag bij volwassen bijen is ook opgenomen met behulp van een elektrofysiologische techniek om een elektrisch impedantiesignaal 4,5 meten. Deze techniek vereist het inbrengen van de elektroden in het dier naast het hart en het gebruik van een impedantie converter hartslagen 4 opnemen. Zo hebben elektrocardiogrammen gebruikt om DETECt elektrische signalen die door het hart en gecombineerd met video-opname van de bij veranderingen in hartactiviteit 6 observeren. Een duidelijk voordeel van deze aanpak is dat de hartslag wordt geëvalueerd in een intacte, levende bij, in plaats van in een ontlede monster, waardoor de beschikbaarheid van het volledige spectrum van fysiologische reacties in het onderwerp te verzekeren. De uitdagingen van deze benaderingen zijn onder verantwoording van immobilisatie of verdoving van het onderwerp, de behoefte om buiten variabelen en prikkels die de hartslag kunnen veranderen, evenals het bepalen van een geschikte levering methode bij het testen van farmacologische middelen te beperken. Een andere aanpak die is gebruikt voor het bestuderen bij hartactiviteit is het insect gedeeltelijk ontleden om het hart bloot te leggen, meet dorsale vat contracties bij een kracht verplaatsingstransductor 7. In dit protocol wordt het hart voortdurend gebaad met hardlopen fysiologische zoutoplossing en test compounds kunnen worden opgelost in deze oplossing voor toepassing aan de patiënt 7. Een belangrijk verschil tussen deze methode en de eerder beschreven is dat de ventrale zenuwkoord wordt verwijderd, waardoor de rol van het centrale zenuwstelsel is aangetoond spelen bij het moduleren hartfrequentie 5. Het resultaat is dat de basislijn hartslag, die meestal zeer grillig, stabiliseert op een veel lagere frequentie en amplitude dan wordt meestal waargenomen bij een levende insecten 5,7. Wat al deze werkwijzen hebben gemeen dat ze zeer gespecialiseerde en vaak dure apparatuur vereisen, naast een bepaald niveau van deskundigheid, om te worden uitgevoerd. Misschien wel het grootste nadeel is dat geen van deze benaderingen zijn bijzonder goed geschikt voor experimenten die omvatten het testen van een groot aantal onderwerpen, zoals het screenen van een bibliotheek van potentieel cardiomodulatory verbindingen. De grootste kracht van de hier beschreven benaderingis de eenvoud. Het protocol is relatief eenvoudig te beheersen, de installatie vereist weinig ruimte, en slechts een minimale financiële inspanning nodig. De werkwijze is meer nodig dan sommige bijen, een paar chirurgische instrumenten, een isotone oplossing en ofwel een digitale microscoop of een traditionele microscoop met een digitale camera. Bijen worden ontleed aan de dorsale vat visualiseren en digitale video&#39;s worden gebruikt om de hartslag op te nemen voor en na de behandeling met farmacologische middelen. Hoewel de video-opname is eigenlijk niet nodig is om veranderingen in de hartslag te observeren, zal het throughput sterk toenemen (dat wil zeggen, het aantal onderwerpen die in een bepaalde hoeveelheid tijd kan worden verwerkt). De onderzoeker kan de efficiëntie te maximaliseren door het opnemen van een groot aantal video&#39;s in een keer en dan later scoren deze video&#39;s op een meer geschikte tijd. Een ander voordeel van deze benadering is dat video kan de onderzoeker beginnen, moet het scoren onderbroken, en maakt het gemakkelijker voor de viewer worden blind voor de behandeling om vertekening te verminderen.

<table><tbody><tr><td>Dino-Lite Edge digital USB microscope</td><td>Dino-Lite</td><td>AM4815ZT</td><td>Elk digitaal microscoop of soortgelijke opstelling zal volstaan</td></tr><tr><td>Microscope stand</td><td>Dino-Lite</td><td>RK-10</td><td>Elke standaard geschikt voor het digitale microscoop</td></tr><tr><td>Laptop of PC</td><td></td><td></td><td>Noodzakelijk voor digitale microscoop</td></tr><tr><td>Microdissectiescharen (Vannas, 8 cm, Recht, 5 mm Bladen)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>Elke soortgelijke schaar geschikt voor microdissectie zal volstaan</td></tr><tr><td>Microdissectiepincetten, 10,2 cm, Gevangen (2 paar)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504482</td><td>Elke soortgelijke pincetten geschikt voor microdissectie zal volstaan</td></tr><tr><td>Ringers oplossing 1/4 sterkte tabletten&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96724-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Dissectielade</td><td></td><td></td><td>Elk oppervlak geschikt voor microdissectie</td></tr><tr><td>Eenkanaals 10 &micro;l pipette</td><td></td><td></td><td>Elk apparaat in staat om nauwkeurig te leveren 10 &micro;l volume</td></tr><tr><td>Pipettips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine beker of container met water</td><td></td><td></td><td>Gebruikt om instrumenten te spoelen tussen proefpersonen</td></tr><tr><td>Handteller</td><td>Office Depot</td><td>295033</td><td>Elk soortgelijk product zal volstaan</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Office Depot</td><td>644219</td><td>Elk soortgelijk product zal volstaan</td></tr><tr><td>De-ioniseerd water</td><td></td><td></td><td>Bereiding van Ringers oplossing en spoelen van instrumenten</td></tr></tbody></table>

dissectie en observatie van honey bee dorsale vessel voor studies van de hartfunctie

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

De Europese honingbij, Apis mellifera L., is een waardevolle landbouw- en commerciële hulpbron die bekend staat om het produceren van honing en het verlenen van bestuivingsdiensten voor gewassen, evenals een belangrijk model voor sociaal insect dat wordt gebruikt om geheugen en leren, veroudering en meer te bestuderen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de dissectie van de dorsale buikwand van een bij om zijn dorsale vat te visualiseren, dat de rol van het hart in het insect vervult. Een succesvolle dissectie zal een functioneel hart blootleggen dat, onder de juiste omstandigheden, een gestage hartslag gedurende een langere periode kan handhaven. Dit stelt de onderzoeker in staat om de hartslag te manipuleren door cardiomodulerende verbindingen op het dorsale vat aan te brengen. Door gebruik te maken van een digitaal microscoop of een microscoop uitgerust met een digitale camera, kan de onderzoeker video-opnamen maken van het dorsale vat voor en na behandeling met testverbindingen. De video's kunnen vervolgens worden gewaardeerd op een tijdstip dat gunstig is voor de gebruiker om veranderingen in hartsnelheid, evenals veranderingen in het hartslagpatroon, na behandeling te bepalen. De voordelen van dit protocol zijn dat het relatief goedkoop is om op te zetten, gemakkelijk te leren is, weinig ruimte of apparatuur vereist en zeer weinig tijd kost om uit te voeren.

Aangezien veel van de farmacologisch actieve verbindingen die kunnen worden getest met dit protocol niet oplosbaar in water, is het noodzakelijk om een ​​betrouwbare oplosmiddel waarmee testverbindingen via de isotone oplossing gebruikt om de dorsale vat baden te bezorgen. Dimethylsulfoxide (DMSO) is een oplosmiddel dat gewoonlijk wordt toegepast als een vehikel voor het afleveren experimentele geneesmiddelen en andere verbindingen bij dieren 8, en is met succes gebruikt voor ...

Het abdominale dorsale vat van de honingbij en andere insecten dient als het functionele equivalent van het zoogdierhart en speelt een belangrijke rol bij het transport van voedingsstoffen, afvalverwijdering, immuunfunctie en meer. Hier beschrijven we een protocol voor de visualisatie en farmacologische manipulatie van de hartslag van bijen.

Dissectie en observatie van Honey Bee Dorsale Vessel voor Studies van de hartfunctie

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Het algemene doel van dit protocol is om veranderingen in de hartslag van bijen te observeren, die het gevolg zijn van de directe toepassing van cardiomodulerende middelen op het dorsale vat. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over de fysiologie van insecten, vooral die welke betrekking hebben op de gezondheid van bestuivers. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud ervan, wat het kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren maakt.Verzamel het juiste aantal bijen uit de kolonie. Een verstandige maatregel zou zijn om een overschot van 50 procent in te sluiten om rekening te houden met mislukte dissecties, waarop zelfs ervaren onderzoekers moeten plannen. Zorg voor de bijen voor een water- en voedselbron terwijl ze in het laboratorium zijn gehuisvest.Voor huisvestingsduur die minder dan zes uur is, zorg minimaal voor toegang tot een 50 procent suikeroplossing. Voor langere periodes, zorg ook voor toegang tot honing. Huis de bijen 's nachts op ongeveer 32 graden Celsius met 60 tot 80 procent relatieve luchtvochtigheid.Frisse verzamelde bijen zijn gemakkelijker te dissecteren, dus ga zo snel mogelijk verder met dissecteren. Voorafgaand aan de dissecties, verdoven de bijen net genoeg om hun beweging te verminderen door ze kortstondig bloot te stellen aan koolstofdioxide. De diepte van de verdoving kan de dissectie moeilijker maken, dus gebruik zo min mogelijk gas.De bijen moeten levend zijn op het moment van dissectie. Om te beginnen, gebruik forceps of micro-dissectie schaar om de poten en vleugels te verwijderen. Na elke manipulatie, spoel de gereedschappen af in gedistilleerd water.Vervolgens, houd de bij vast met forceps en gebruik de schaar om lateraal langs de dorsale buikwand te snijden, tussen de eerste en tweede tergieten. Grijp vervolgens lichtjes de achterste rand van het tweede tergiet met de forceps en snijd voorzichtig langs elke kant van de bij van de initiële incisie tot de angel. Prik niet in het spijsverteringskanaal.Gebruik vervolgens fijne forceps om voorzichtig de dorsale buikwand te scheiden van de rest van de buik. Verwijder vervolgens voorzichtig de angel en verwijder voorzichtig elk deel van het spijsverteringskanaal dat aan de dorsale buikwand blijft vastzitten. Laat de inhoud van de darm niet vrij, aangezien deze de visualisatie van het dorsale vat kan belemmeren.Verwijder nu de laatste turgiet om de visualisatie van het dorsale vat te verbeteren. De volgende stap is om het stadium aan te passen om het dorsale vat te bekijken en eventuele overtollige buikwand weg te knippen die het zicht belemmert. De vorm van de dorsale buikwand moet lijken op een ondiepe kom of schaal wanneer deze correct geplaatst is.Bedek het dorsale vat met 10 microliter van de aanbevolen isotone oplossing om zijn fysiologische omstandigheden te behouden, en verwijder eventuele resterende membraan die de visualisatie van het dorsale vat belemmert. Toevoeging van de isotone oplossing kan ervoor zorgen dat los membraan drijft en het zicht op het dorsale vat belemmert. Deze membraan stukken kunnen worden verwijderd met fijne forceps, maar wees voorzichtig om het dorsale vat niet te beschadigen.Aanvankelijk lijkt er geen hartslag te zijn, maar binnen enkele minuten in isotone oplossing zal het hart meestal weer beginnen te slaan. Als het in oplossing wordt gehouden, kan het hart urenlang blijven kloppen. Laat het dorsale vat ongestoord zitten totdat een stabiele, continue hartslag is bereikt.Dit gebeurt meestal binnen vijf minuten. Meet de baseline hartslag met een handtellingteller, of voor meer nauwkeurigheid, maak een video-opname van het experiment en neem de metingen later. Neem minimaal een minuut van stabiele hartslagen op voorafgaand aan de eerste behandeling.Nu bereidt u zich voor om de potentiële cardiomodulatoren toe te passen, die idealiter zijn opgelost in dezelfde isotone oplossing als het bad. Om deze reden bevat de aanbevolen oplossing wat DMSO, wat het mogelijk maakt dat de meeste verbindingen worden opgelost. Wacht na het toevoegen van een testverbinding minimaal een minuut voordat u de verandering in hartslag meet.Om een nauwkeurige maat van de hartslag te krijgen, is minimaal een minuut aan gegevens nodig, en meestal zijn enkele minuten aan gegevens vereist. Er werden verschillende isotone oplossingen getest met een reeks DMSO-concentraties op hun effect op de hartslag. Vijf procent en tien procent DMSO verlaagden de hartslag significant, terwijl een een procent DMSO isotone oplossing dat niet deed.Dus de een procent oplossing werd gebruikt voor experimenten. Octopamine, een goed gekarakteriseerd demodulator in ongewervelde dieren, werd getest tegen het voertuig. Hogere concentraties van octopamine verhoogden de hartslag significant, wat de bruikbaarheid van de assay aantoont.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een dissectie kunt uitvoeren om het dorsale vat te visualiseren, evenals hoe u de effecten van potentiële cardiomodulatoren op de hartslag van bijen kunt testen. Zodra deze techniek is beheerst, kan een dissectie in enkele minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

dissection-observation-honey-bee-dorsal-vessel-for-studies-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Techniek die nodig is voor het visualiseren van het kloppend hart in de larven en...

Het visualiseren van de Beating Heart in Drosophila</em

We presenten verschillende manieren om de hartfunctie in de larve van Drosophila te monitoren voor het beantwoorden van vragen over de functie van gap junctions, ionkanaalmutaties, modulatie van pacemakeractiviteit en farmacologische studies.

Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies

Deze video beschrijft het volwassen hart van de vlieg, of anders het Drosophila dorsale vat genoemd. Het aanbevolen protocol demonstreert een dissectieprocedure voor levende hartpreparaten.

Voorbereiding van Drosophila Heart: een techniek om hartfysiologie in de volwassen vlieg te bestuderen

Deze video beschrijft een techniek om het hart te isoleren van een zebravis in meerdere ontwikkelingsstadia om hartontwikkeling, rijping en veroudering te bestuderen.

Hartdissectie: een methode om zebravis hartontwikkeling te observeren

Geïsoleerde werkende hartmodellen kunnen worden gebruikt om het effect van belastingsomstandigheden, hartslag en medicijnen op de myocardprestaties en zuurstofverbruik te meten. We beschrijven methoden voor de voorbereiding van een werkende linker hartmodel van knaagdieren dat de studie van systolische en diastolische prestaties en zuurstofverbruik onder verschillende omstandigheden mogelijk maakt.

Knaagdier Werken Heart Model voor de Studie van hartspierprestatie en Oxygen Consumption

We presenteren een protocol voor de analyse van coronairvaten geheel muriene embryonale hart tot E15.5, met behulp van standaard immunologische werkwijzen kleuring gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van bloedvaten door het gehele hart zonder dat tijdrovende analyse van seriële secties.

Analyse van de coronaire vaten in Gewist Embryonale Hearts

Hier worden de experimentele protocollen beschreven voor het voorbereiden van Drosophila in verschillende ontwikkelingsstadia en het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van Drosophila hartslagen met behulp van een aangepast systeem voor optische coherentiemicroscopie (OCM). De morfologische en dynamische veranderingen in het hart kunnen kwantitatief worden gekenmerkt door het analyseren van de structurele en functionele parameters van het hart uit OCM-beelden.

Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

Echocardiographic onderzoek wordt vaak gebruikt in muizen. Dure high-resolution echografie apparaten zijn ontwikkeld voor dit doel. Dit protocol beschrijft een betaalbare echocardiographic procedure gecombineerd met histologische Morfometrische analyses om te bepalen van cardiale morfologie.

Echocardiographic en histologisch onderzoek van cardiale morfologie in de muis

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

Vanwege de complexe anatomie kan een consistent reproduceerbaar dissectie- en oogstprotocol voor hartmonsters een uitdaging zijn om te implementeren. Dit manuscript presenteert de belangrijkste elementen van enkele standaard cardiale dissectieprotocollen, waarbij zowel de grove onderzoeksbenaderingen als de bemonsteringslocaties die vaak worden gebruikt voor histopathologisch onderzoek worden benadrukt.

Dissectietechnieken en histologische bemonstering van het hart in grote diermodellen voor hart- en vaatziekten

Het Drosophila-protocol voor hartdoorsnede en fluorescentiebeeldvorming vereenvoudigt het bestuderen van de hartstructuur en pathologieën. Deze aanpak omvat eenvoudige secties, kleuringen en beeldvorming, waarbij de technische expertise die nodig is voor traditionele dissectie wordt omzeild. Het verbetert de toegankelijkheid, waardoor Drosophila een breder bruikbaar model wordt voor hartgerelateerd onderzoek binnen de bredere wetenschappelijke gemeenschap.

Nieuwe en efficiënte methode voor Drosophila-hartfluorescentiekleuring met cryosectie

Leer een eenvoudige dissectiemethode om het dorsale vaatstelsel van honingbijen bloot te leggen en hartfrequentieveranderingen te observeren na toepassing van cardiomodulerende stoffen. Deze techniek biedt waardevolle inzichten in de insectenfysiologie en de gezondheid van bestuivers.

Dissectie en observatie van Honey Bee Dorsale Vessel voor Studies van de hartfunctie

Meer video's verkennen