Engineering Moleculaire herkenning met Bio-mimetische Polymers op enkelwandige koolstof nanobuisjes

Het algemene doel van deze procedure is om nabij-infrarood fluorescente single-walled koolstofnanobuizen voor moleculair sensing voor te bereiden die gefunctionaliseerd zijn met behulp van biomimetische polymeren. Deze nanosensoren kunnen tijdsafhankelijke beeldvorming in levend weefsel mogelijk maken. Ze kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om dopamine in de hersenen te detecteren.

Het belangrijkste voordeel van deze sensoren is hun inherente nabij-infrarood fluorescentie, die beeldvorming dieper in het weefsel mogelijk maakt. Synthetische sensoren maken de detectie van moleculen mogelijk zonder natuurlijke moleculaire herkenningselementen, waardoor deze generieke methode van sensorontwikkeling vooral nuttig is voor detectie van kleine moleculen. Om een nucleïnezuursuspensie van SWNT's voor te bereiden, lost u eerst nucleïnezuren op in 0,1 molaire natriumchloride tot een concentratie van 100 milligram per milliliter.

In een afzuigkast verwijdert u statische elektriciteit van de wegwerpspatel, microcentrifugebuisjes en de SWMT-voorraad met behulp van een antistatische pistool. Voeg vervolgens 20 microliter van de nucleïnezuuroplossing toe aan 980 microliter 0,1 molaire natriumchloride. Voeg vervolgens 1 milligram gewassen SWNT's toe aan de resulterende nucleïnezuuroplossing voordat u het mengsel sonicereert.

Het positioneren van de sondev-tip tijdens sonicatie is cruciaal. Als er schuim ontstaat, herpositioneert u de sondev-tip en probeert u de amplitude te verlagen. U kunt ook pulsen van sonicatie of bad-sonicatie proberen als de suspensie slecht blijft.

Gebruik een ultrasoon apparaat met een sondev-tip van 3 millimeter diameter om de oplossing 10 minuten te soniceren bij 40% amplitude in een ijsbad. Centrifugeer de DNA SWNT-oplossing tweemaal gedurende 90 minuten bij 16.100 xg. Verzamel en bewaar het supernatant, wees voorzichtig om het pellet met koolstofnanobuisjesbundels en aggregaten niet te verstoren.

Gooi het pellet weg volgens de institutionele procedures voor gevaarlijk afval die geschikt zijn voor nanomaterialen. Meet de oplossingsabsorptie bij 632 nanometer met behulp van een UV-vis spectrofotometer om de geschatte concentratie van gesuspendeerde SWNT's te bepalen, in overeenstemming met de wet van Lambert-Beer, en de juiste verdunningsfactor. Voor amfifiele polymeersuspensies verwijdert u eerst de statische elektriciteit van de wegwerpspatel, microcentrifugebuisjes en SWNT-voorraad.

In een afzuigkast voegt u vijf milligram SWNT's toe aan vijf milliliter 2% natriumcholaat oplossing. Gebruik een ultrasoon apparaat met een sondev-tip van zes millimeter diameter om de oplossing gedurende een uur te soniceren bij 40% amplitude in een ijsbad. Centrifugeer het monster gedurende vier uur bij 150.000 xg met behulp van een ultracentrifuge, voordat u voorzichtig het supernatant verzamelt.

Los vervolgens 1% gewicht van amfifiel polymeer op in de scSWNT-oplossing. Dialyseer vervolgens de polymeer scSWNT-oplossing met behulp van een 3,5 kilodalton dialysemembraan tegen één liter gedeïoniseerd water of buffer gedurende vijf dagen. Ververs het water of buffer om de twee uur en om de vier uur.

Meet de oplossingsabsorptie bij 632 nanometer met behulp van een UV-Vis spectrofotometer om de geschatte concentratie van gesuspendeerde SWNT's te bepalen. Om de BSA-biotine gecoate glazen plaatjes voor te bereiden, maakt u een microscoopglasplaatje en 0,17 millimeter dekglas schoon met gedeïoniseerd water, gevolgd door methanol, aceton en een laatste spoeling met gedeïoniseerd water. Maak kanalen door verschillende stukjes dubbelzijdig plakband ongeveer vijf millimeter uit elkaar op het schone microscoopglas te plaatsen.

Versluit de kanalen door een lang glasdekglas op de bovenkant van het dubbelzijdige plakband te drukken. Zorg ervoor dat u het centrum op het microscoopglas plakt, zodat de randen van het dekglas en het glas niet vlak zijn. Voeg vervolgens 100 microliter BSA-biotine stockoplossing toe aan 900 microliter 1x Tris buffer tot een eindconcentratie van één milligram per milliliter.

Laat 50 microliter van de BSA-biotine oplossing in het kanaal stromen door de oplossing aan het ene uiteinde in te pipetten en de oplossing aan het andere uiteinde met een tissue weg te vegen. Na vijf minuten incubatie voert u drie tot vijf spoelingen uit met 50 microliter 0,1 molaire natriumchloride. Verdun vervolgens 40 microliter van vijf milligram per milliliter NAV stockoplossing in 960 microliter 1x Tris buffer tot een eindconcentratie van 0,2 milligram per milliliter.

Laat 50 microliter van de NAV-oplossing in het kanaal stromen door de oplossing aan het ene uiteinde in te pipetten en de oplossing aan het andere uiteinde met een tissue weg te vegen. Na twee tot vijf minuten incubatie voert u drie tot vijf spoelingen uit met 50 microliter 0,1 molaire natriumchloride. Verdun vervolgens de stockoplossingen van gesuspendeerde SWNT's en beeldvormingsbuffer tot een concentratie van 1 tot 10 milligram per liter.

Laat 50 microliter van deze oplossing in het kanaal stromen en incubeer gedurende vijf minuten. Spoel voorzichtig overtollig SWNT's weg met 50 microliter beeldvormingsbuffer. Om de omkeerbare respons van GT15 DNA-SWNT's op dopamine te meten, monteert u eerst de sensor gecoate kanalen op het vloerplaatje van de fluorescentiemicroscoop.

Breng de kanalen scherp met behulp van een 100X Olie Objectief en indium gallium arsenide camera. Voeg vervolgens 50 microliter 100 micromolaire dopamine oplossing in fosfaat gebufferd zoutwater toe aan het stromende kanaal en registreer de verandering in fluorescentie-intensiteit. Was de dopamine oplossing weg met fosfaat gebufferd zoutwater en observeer de verandering in fluorescentie van de individuele SWNT sensoren.

Om de welplaat screening voor analytrespons van biomimetische polymeer SWNT's uit te voeren, pipetteer gelijke volumes van de gesuspendeerde SWNT sensor in elk putje. Gebruik voldoende volume om de bodem van het putje uniform te bedekken. Pipetteer vervolgens analyten van de screeningbibliotheek in de welplaten.