Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples
February 3rd, 2017
Problemen bij de verwerking van biologische monsters voor waarneming door middel van rasterelektronenmicroscopie omvatten celimplosie, behandeling van monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Goedkope en relatief snelle protocollen die geschikt zijn voor het voorbereiden van uitdagende monsters zoals bloemtoppen, oömyceten cysten en schimmels (Agaricales) zijn hier samengesteld en gedetailleerd.
Het doel van deze methodologie is om delicate weefsels van planten, oomyceten en schimmels te behandelen voor hun optimale observatie onder een Rasterelektronenmicroscoop, of SEM. Deze methode kan ons helpen vragen te beantwoorden met betrekking tot praktisch elke schimmel, microbe, morfologie en hoe ze hun gastheer infecteren, koloniseren en zich eraan hechten. De techniek in onze verbeterde methodologie is voor het fixeren van monsters, voor waar de mitochondriën in aquatische ecosystemen zijn.
Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons toestaat om belangrijke aspecten van infectie te visualiseren met behulp van dure en gemakkelijk beschikbare middelen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen sterk zijn aangepast van traditionele protocollen. En gepubliceerde methoden beschrijven algemene procedures zonder details.
Om te beginnen, bereid de formol en azijnalcohol, of FAA fixatief in een afzuigkap uitgerust met een aldehydefilter. Bij 85 delen van 70% gedenatureerde ethanol, 10 delen van 60% formaldehydeoplossing en vijf delen van glazuur azijnzuur. Onder de afzuigkap, giet de voorraad FAA in individuele containers.
Selecteer de bloem- of vegetatieve meristemen om te fixeren, zorg ervoor dat ze niet beschadigd zijn door insecten, schimmels of extreme weersomstandigheden. Snijd de takken, verwijder ongewenst materiaal en dep het monster onmiddellijk in de FAA-oplossing. Na 72 tot 96 uur, giet de FAA in een plastic container voor chemische verwijdering.
Was de monsters onmiddellijk drie keer met vers 70% ethanol om eventueel resterend FAA te verwijderen. Gefixeerd materiaal kan onbeperkt worden bewaard in 70% ethanol. Ontleed de monsters in een petrischaal bedekt met ethanol om te voorkomen dat de weefsels uitdrogen.
Gebruik een petrischaal met de basis bedekt met een droge, zwarte siliconen om het contrasterende witte weefsel beter te zien. Breng het weefsel over in afzonderlijke containers en dompel deze vervolgens in een petrischaal met 70% ethanol. Doe de deksels op de containers en dep ze in een plastic centrifugebuis met veel 70% ethanol.
Breng het ontleed materiaal over via een ethanolreeks in hermetische potten of centrifugeerbuizen. Laat de monsters minimaal een uur in elke oplossing. Houd de monsters vervolgens een nacht in een 100% ethanoloplossing.
Na de ethanolreeks, breng de containers met materiaal over naar de CPD. Schrijf het monsteridentificatienummer onder de SEM-monsterhouders. Bedek vervolgens de bovenkant van de stubs met dubbelzijdig plakband.
Plaats de stubs in een monsterhouder. Onder een stereomicroscoop, open voorzichtig de containers die de jonge en delicate monsters dragen die al in de CPD zijn gedroogd. Houd er rekening mee dat na de CPD-behandeling de monsters lichter worden en gevoelig zijn voor elektrostatiek.
Sluit de containers zodra de monsters eruit zijn gehaald om stof of onzuiverheden te voorkomen. Leg de monsters op het plakkerige oppervlak van de stubs, met het oog op de gewenste positie. Zodra de monsters het oppervlak raken, is het erg moeilijk om ze te verwijderen.
Probeer op dit punt geen grote dissectie uit te voeren. Verwijder alleen het ongewenste weefsel dat gemakkelijk te verwijderen is. Voor palynologische studies, ontleed de meeldraden en open ze om het stuifmeel op de stubs bloot te leggen.
Bewaar de monsters 's nachts beschermd in een hermetisch vat met silicagel om herhydratatie te voorkomen. Bekleed de monsters met behulp van de spotter-coater en breng ze over naar de SEM zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de differentiële groei van de stekels van de cysten op afzonderlijke petrischalen te testen, doe 0,5 milliliter van de secundaire cyste-suspensie op verschillende oppervlakken.
Oppervlakken kunnen koolstof, goud en koper transmissie-elektronenmicroscopie roosters omvatten. Eerder gebleekte zalm- en heekvisschubben, en glazen dekglasjes. Incubeer de cysten bij 20 graden Celsius gedurende 70 minuten, wat de hechting van de cysten aan het oppervlak bevordert.
Verwijder de vloeistof en voeg 0,5 milliliter 2% glutaaraldehyde toe aan elk oppervlak voor het fixeren van de cysten. Bewaar de monsters op kamertemperatuur onder een afzuigkap gedurende een uur. Verwijder de glutaaraldehyde en dehydrateer de monsters via een ethanolreeks, waarbij vijf milliliter van elk van de ethanoloplossingen gedurende 15 minuten wordt toegevoegd.
Eenmaal in de laatste 100% ethanoloplossing, kan het monster worden bewaard tot een maand in een verzegeld petrischaal. Breng de roosters en schalen voorzichtig over van het petrischaal naar een houder die geschikt is voor de CPD die de monsters van elkaar gescheiden houdt, zoals een CPD-roosterhouder of een gestapelde monstershouder. Neem het rooster en de schalen met pincetten, houd er rekening mee dat de cysten altijd naar boven moeten wijzen op de roosters.
Ga door met het drogen van het materiaal met behulp van de CPD voordat u de SEM-monstervoorbereiding van de eicellen uitvoert om hun gedrag op verschillende oppervlakken te observeren, zoals beschreven in het tekstprotocol. Wikkel elk monster voorzichtig met filterpapier en vorm enveloppen van ongeveer 0,5 tot één vierkante centimeter potlood. Zorg ervoor dat de monsters niet worden verpletterd.
Versluit het filterpapier met paperclips. Breng vervolgens de verpakte monsters over naar een petrischaal en dompel ze in 10 milliliter water om het weefsel rond de sporen te rehydrateren. Doe de monsters onmiddellijk in een magnetron.
Verwijder het materiaal zodra het water begint te verdampen en laat het afkoelen op kamertemperatuur. Laat vervolgens het monster door een ethanolreeks gaan. Gebruik afhankelijk van de hoeveelheid monster een beker of centrifugeerbuis voor deze stap.
Laat de monsters 15 minuten in elke oplossing. Plaats vervolgens de monsters in de CPD zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de sporen voor SEM-observatie te monteren, open de enveloppen.
Verzamel vervolgens de sporen met het plakkerige oppervlak van de stubs, zorg ervoor dat ze niet worden verpletterd. Voer ten slotte een goudcoating van de monsters en SEM-observatie uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het voorbereiden van delicate biologische monsters van planten, oomyceten en schimmels voor observatie met rasterelektronenmicroscopie (REM). De focus ligt op het aanpakken van veelvoorkomende uitdagingen zoals celcollaps en vernietiging tijdens de monsterbewerking.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Microbiologie
Achtergrond
- Rasterelektronenmicroscopie is cruciaal voor het observeren van fijne details van biologische monsters.
- Traditionele monstervoorbereidingsmethoden leiden vaak tot aanzienlijke monsterschade.
- Verbeterde protocollen zijn noodzakelijk voor het bestuderen van delicate weefsels.
- Bestaande methoden missen gedetailleerde instructies voor uitdagende monsters.
Doel van het onderzoek
- Om goedkope en snelle protocollen te ontwikkelen voor het voorbereiden van moeilijke biologische monsters.
- Om de visualisatie van belangrijke aspecten van infectie in schimmels en microben te verbeteren.
- Om gedetailleerde methodologie te bieden voor onderzoekers op het gebied.
Gebruikte methoden
- Fixatietechnieken afgestemd op delicate weefsels.
- Protocollen ontworpen voor florale meristemen, oomycetencysten en schimmels.
- Visuele demonstraties van gewijzigde stappen uit traditionele protocollen.
- Gebruik van toegankelijke bronnen voor monstervoorbereiding.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle voorbereiding van uitdagende monsters voor SEM-observatie.
- Verbeterde visualisatie van infectieprocessen in schimmels en microben.
- Gedetailleerde methodologie maakt reproduceerbaarheid in onderzoek mogelijk.
- Aangetoonde effectiviteit van de nieuwe protocollen vergeleken met traditionele methoden.
Conclusies
- De ontwikkelde protocollen verbeteren de monstervoorbereiding voor SEM aanzienlijk.
- Onderzoekers kunnen nu de interacties van schimmels en microben beter bestuderen.
- Toekomstige studies kunnen op deze methoden voortborduren voor verschillende biologische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robust SEM sample preparation protocols for delicate plant, oomycete, and fungal tissues address a critical bottleneck in morphological and infection biology studies. By minimizing cell collapse and preserving diagnostic features, these methods enhance the predictive confidence of early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. Reliable imaging of infection structures supports translational continuity from basic research to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity visualization of infection and colonization structures in plant-pathogen interactions.
- Supports mechanistic de-risking by preserving delicate cellular features for hypothesis testing.
- Facilitates functional validation of morphological biomarkers relevant to disease progression.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible SEM-based phenotypic screening.
- Ensures quantitative assessment of morphological traits across substrates and conditions.
- Improves assay readiness for evaluating compound effects on pathogen attachment and growth.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological observations with disease-relevant systems for translational biomarker studies.
- Enables continuity from in vitro infection models to preclinical validation of antifungal or anti-oomycete strategies.
- Reduces risk of artifactual findings by maintaining structural integrity in challenging sample types.
Pipeline & Workflow Integration
These SEM protocols integrate into the discovery-to-preclinical continuum by providing reliable morphological endpoints for target validation, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of infection mechanisms and host-pathogen interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative morphological outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables measurement of diagnostic features such as cyst spines and spore structures across substrates.
- Translational Research: Bridges basic morphological findings to preclinical model systems for antifungal development.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost protocol adaptable across diverse biological sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in morphological and infection biology studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of SEM sample preparation workflows.
- Strategic Value: Reduces risk of false negatives in target validation and phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of antifungal and anti-oomycete candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in SEM operation and delicate sample handling.
- Needs access to critical point drying and coating instrumentation.
- Demands strict adherence to safety protocols for hazardous fixatives.
- Standardization across teams is essential for reproducibility and data comparability.
- Limitations include surface-only imaging and potential adaptation for non-plant/fungal systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Collection and Fixation of Developing and Fully Formed Plant Structures
2:04
Dissection and Dehydration of Developing and Fully Formed Plant Structures
3:02
Mounting and Preparing Plant Tissues for SEM Observation of Developing and Fully Formed Plant Structures
4:20
Study of Cyst Behavior of Saprolegnia (Oomycetes) on Different Surfaces
6:04
Study of Herbarium Fungal Spores of Phellorinia herculanea under SEM
7:20
Results: Recovery of Plant Development, Differential Spine Growth of Saprolegnia parasitica, and Nurse Cells in Spores of Phellorinia herculanea f. stellata
9:01
Conclusion
