Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach

De algemene doelen van dit protocol zijn om geconditioneerd medium te verzamelen van muis embryonale stamcellen onder serum- en feeder-vrije kweekomstandigheden en om de biologische functies van dit medium te karakteriseren. Deze procedure biedt inzicht in de antiverouderingsactiviteit van oplosbare factoren die worden uitgescheiden door muis embryonale stamcellen voor de ontwikkeling van een veilige en cel-vrije therapeutische aanpak voor leeftijdsgerelateerde ziekten. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Dr. Yun-Ui Bae, een onderzoeksprofessor van mijn laboratorium.

In een biologische veiligheidskast, behandel een muis embryonale fibroblast of MEF-celkweek met 20 milliliter MEF-medium aangevuld met mitomycin C in een 15 centimeter celkweekschaal gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer met PBS en los ze met drie milliliter trypsine EDTA gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Neutraliseer de trypsine met zes milliliter vers MEF-medium wanneer de cellen van de bodem van de plaat zijn losgekomen.

Na het verzamelen van de cellen door centrifugatie, hersuspendeer de pellet in vijf milliliter MEF-medium en plateer tweemaal 10 tot de zesde geïnactiveerde MEF's per 10 centimeter kweekschaal in vers MEF-medium. Kweek de feedercellen gedurende 24 uur. Vervang vervolgens het MEF-medium met muis embryonaal stamcelmedium en zaai tweemaal 10 tot de zesde muis embryonale stamcellen op de feeders voor minimaal 48 uur co-kweek.

In een biologische veiligheidskast, spoel een plaat van muis embryonale stamcellen af met vijf milliliter PBS en los de cellen op met trypsine plus EDTA zoals net gedemonstreerd. Na het verzamelen van de cellen door centrifugatie, hersuspendeer de stamcelpellet in vijf milliliter vers stamcelmedium en plateer één milliliter cellen per schaal in vers embryonaal stamcelmedium op vijf gelatine gecoate celkweekschalen. Breng de cellen terug naar de incubator totdat de culturen 80-85% confluentie bereiken.

Spoel vervolgens de cellen in minimaal acht milliliter PBS per plaat voor drie 10 minuten wasbeurten gevolgd door een 24 uur incubatie in medium met verminderd serum. Na niet meer dan 24 uur, breng het supernatant over in een 50 milliliter conische buis voor centrifugatie. Gevolgd door filtratie door een 0,2 micrometer flesdop zeef.

Om de effecten van het embryonale stamcel geconditioneerde medium te testen door middel van een senescensie geassocieerde bèta-galactosidase assay, zaai menselijke dermale fibroblasten in een zes-wellplaat in een humaan dermale fibroblastenmedium. Na een overnachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, vervang de helft van het medium met vers muis embryonaal stamcel geconditioneerd medium voor een verdere 72 uur kweek. Op de derde dag van de kweek, spoel de cellen in twee milliliter PBS per putje voor twee 30 seconden wasbeurten.

Fixeer vervolgens de cellen in 3,7% paraformaldehyde gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een afzuigingskast. Na het fixeren, was de cellen twee keer met twee milliliter PBS, zoals net gedemonstreerd en label de cellen met één tot twee milliliter SA bèta gal oplossing gedurende 17 en een half uur bij 37 graden Celsius zonder koolstofdioxide. Aan het einde van de kleuringsperiode, was de cellen twee keer met PBS zoals net gedemonstreerd.

Kleur vervolgens tegen met Eosen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na nog een reeks PBS wasbeurten, beeld de cellen af met een 100 keer vergroting door middel van lichtmicroscopie. Voor celcyclusanalyse, zaai acht keer 10 tot de vierde menselijke dermale fibroblast per putje in een zes centimeter celkweekschaal in vers humaan dermale fibroblastenmedium voor een overnachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

De volgende ochtend, vervang de helft van het medium met muis embryonaal stamcel geconditioneerd medium en breng de cellen terug naar de incubator. Na 24 uur, oogst de cellen door trypsine EDTA dissociatie gevolgd door twee wasbeurten in één milliliter PBS oplossing. Hersuspendeer de pellet in 100 microliters koude PBS oplossing na de tweede wasbeurt.

Vervolgens fixeer de cellen met druppelsgewijze toediening van 200 microliters koude ethanol terwijl gevormd wordt. Bewaar de cellen gedurende ten minste een uur bij vier graden Celsius. Was ze vervolgens in verse PBS oplossing.

Na de tweede centrifugatie, behandel de pellet met 250 microliters natriumcitraatbuffer aangevuld met RNase gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius zonder koolstofdioxide. Aan het einde van de incubatie, label de cellen met 250 microliters natriumcitraatbuffer bevattende propidium jodide gedurende 20 minuten. Bepaal vervolgens de celcyclusfasen van elk monster door middel van flowcytometrie.

Voor kwantitatieve reverse transcriptase PCR analyse, gebruik een RNA extractiekit om het totale RNA te isoleren van muis embryonaal stamcel geconditioneerd medium behandelde menselijke dermale fibroblasten volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik een spectrofotometer om het totale geëxtraheerde RNA te kwantificeren. Formuleer vervolgens reactiemengsel bevattende de oligo deoxythymidine primers en M-MLV reverse transcriptase volgens het protocol van de fabrikant.

Voeg vervolgens één microgram van het totale RNA toe aan de PCR buis bevattende het reactiemengsel. Meet tenslotte de amplificatie van de CDNA met een real-time PCR apparaat met behulp van de groene PCR master mix en de geschikte genprimers. Muis embryonale stamcellen gekweekt onder normale muis embryonale stamcel kweekomstandigheden op een MEF feeder cel laag vertonen een ovale vorm en een glanzende verschijning.

Terwijl muis embryonale stamcellen gekweekt onder serum en feeder-vrije kweekomstandigheden een afgeplatte en onregelmatige morfologie vertonen. De behandeling van de senescerende humane dermale fibroblast met muis embryonaal stamcel geconditioneerd medium vermindert het aantal senescensie geassocieerde bètagalactosidase positieve cellen. Verder, celcyclusanalyse van deze cellen onthult dat muis embryonaal stamcel geconditioneerd medium behandeling dramatisch het aantal cellen in de S en G2/M fasen verhoogt terwijl het aantal cellen in de G0/G1 fase wordt