Name: Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer het verzamelen van serum- en feeder-vrij mESC-geconditioneerd medium voor anti-verouderingsonderzoek. Deze methode helpt onderzoekers veilige, celvrije therapieën voor leeftijdsgerelateerde ziekten te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door de Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) en de Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT, en Toekomst Planning. Dit onderzoek wordt ook ondersteund door een Start-up exploitatiesubsidie ​​van de Hospital for Sick Children (HK Sung). We willen graag Laura Barwell en Sarah JS Kim bedanken voor hun uitstekende hulp bij het bewerken van dit manuscript en Dr. Andras Nagy voor het verstrekken van de G4 mES lijn.

OPMERKING: Een schema van de serum- en voedingsvrije CM collectie protocol wordt weergegeven in figuur 1. 1. Materialen (Voorbereiding van de MEF, Medium, platen, en oplossingen) <ol><li> Bereid 500 ml van medium tot de cultuur van de MEF. Aangevuld Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) met 10% FBS (ESC kwaliteit), 50 eenheden / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine. </li><li> Isoleer MEF uit embryo&#39;s na een vaste routine protocol 13 en te onderhouden in MEF medium. </li><li> Bereid 500 ml van medium tot de cultuur van de mESCs. DMEM aangevuld met 15% FBS en 2 mM L-glutamine, 100 uM niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100 uM β-mercaptoethanol, 100 eenheden / ml leukemie remmende factor (LIF), 50 eenheden / ml penicilline, en 50 mg / ml streptomycine. </li><li> Bereid de gegelatineerd platen (5 verstijfseld platen / 1 mES plaat) door bekleding 10 cm celkweekschalen met 5 ml 0,1% gelatineoplossing. Incubeer gedurende ten minste 10 min<html> op kamertemperatuur. </li><li> Bereid 500 ml Verlaagde Serum Medium voor een serumvrije toestand van mESCs. Supplement Verlaagde serum medium met 1,2 g natriumbicarbonaat (pH 7,0). Filteren door middel van een 0,2 micrometer bottle-top filter. </li><li> Bereid de senescentie geassocieerde β-galactosidase (SA β-gal) kleuroplossing voor de detectie van verouderde cellen: 1 mg / ml X-gal (opgelost in dimethylformamide, DMF), 40 mM citroenzuur / natriumfosfaatbuffer (pH 6,0) , 5 mM kalium ferricyanide, 5 mM kaliumferrocyanide, 150 mM NaCl en 2 mM MgCl2 14. LET OP: (gevaarlijke) DMF is een giftige en bijtende oplossing. Draag persoonlijke beschermende kleding (bijvoorbeeld, nitril of latex handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril) bij het hanteren oplossing. Gebruik een zuurkast. </li><li> Bereid 500 ml van medium tot cultuur humane huidfibroblasten (HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast). DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Cultuur van de muis embryonale stamcellen (Figuur 1A en 2A) OPMERKING: Voer alle stappen in een celkweek biologische veiligheid kap. <ol><li> Behandel de MEF met 20 ml van MEF medium dat 10 ug / ml mitomycine C in een 15 cm kweekschaal cel. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Zuig het medium van MEF. Was de cellen met PBS driemaal. Voeg 3 ml trypsine-EDTA (TE, 1x) en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. Na 3 min, neutraliseren TE met 6 ml van MEF medium en centrifugeer gedurende 3 min bij 300 x g. </li><li> Hersuspenderen in 5 ml MEF medium. Bepaal het aantal cellen in de verkregen celsuspensie gebruikt trypan blauw kleuring en een hemocytometer. Plaat geïnactiveerde MEF (feeder) bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen per 10 cm celkweek schotel in MEF medium. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Vervang de MEF medium met mES medium 24 uur na plating de feeder (op dede volgende dag). </li><li> De plaat mESCs (G4 F1 hybride ES cel) bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen op de feeder met mES medium. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2. LET OP: De anti-aging effect van mES-CM is waarschijnlijk sterker als lager passage nummer mESCs worden gebruikt 15-17. Verwierven we een G4 mES lijn van Dr. Andras Nagy in Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. </li><li> Houd de cellen bij een betrekkelijk hoge dichtheid en doorgang aan een 70-80% subconfluente toestand. Vervang het medium met verse mES medium dagelijks. </li></ol> 3. Inning van serum en Feeder-vrij geconditioneerd medium (Figuur 1B en 2B) OPMERKING: Voer alle stappen in een celkweek biologische veiligheid kap. <ol><li> Spoel de mES plaat met 5 ml PBS. Voeg 1 ml TE (2,5 x) en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. Na 3 min, neutraliseren TE met 2 ml mES medium en centrifugeer gedurende 3 min bij 300 x g. </li><li> Resuspendeer in 5 ml mES medium en plaat 1 ml in elk gelatine gecoate cultuur schotel (5 ontsloten platen / 1 mES plaat) in mES medium. Kweken bij 37 ° C en 5% CO 2 tot 80-85% confluentie bereikt. </li><li> MESCs wassen met PBS voldoende om de cellen (8 ml per 10 cm plaat) gedurende 10 min per wasbeurt dekken, voor een totaal van drie wassingen. Incubeer in Verlaagde Serum Medium gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. OPMERKING: De wasstap is belangrijk FBS verontreiniging te voorkomen. Het is belangrijk om de incubatietijd 18,19 volgen. </li><li> Verzamel mES-CM in een 50 ml conische buis en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 2500 x g. Verzamel de bovenstaande vloeistof (CM) na centrifugeren. Filteren door middel van een 0,2 micrometer bottle-top filter. </li></ol> 4. Effecten van de muis embryonale stamcel-geconditioneerd medium (mES-CM) OPMERKING: De effecten van mES-CM werden bevestigd met verschillende werkwijzen, zoalsSA β-gal-assay, celcyclus analyse en qRT-PCR. <ol><li> SA β-gal-assay (Figuur 3A) <ol><li> Zaad HDF&#39;s bij een dichtheid van 2 x 10 4 cellen per putje in 6-well platen in HDF medium. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na een nacht incubatie, verwerp de helft van de HDF medium en voeg mES-CM en controle medium. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Stuurmedium wordt afgeleid uit serum-vrij medium (Reduced Serum Media) in een gelatine-gecoate schaal in afwezigheid van mESCs. </li><li> Was de cellen met PBS voldoende om de cellen (2 ml per 6-wells plaat) gedurende 30 sec per wasbeurt dekken, voor een totaal van twee wassen. Voeg 3,7% paraformaldehyde (PFA) voor bevestiging. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. LET OP: (gevaarlijke) Paraformaldehyde is een giftige en bijtende oplossing. Draag persoonlijke beschermende kleding (bijvoorbeeld, nitril of latex handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril) bij het hanteren van de oplossing.Gebruik een zuurkast. </li><li> Zuig het fixatie-oplossing. Was de gefixeerde cellen tweemaal met PBS, zoals beschreven in stap 4.1.3. </li><li> Voeg de SA β-gal kleuroplossing (1-2 ml per putje in een 6-wells plaat). Incubeer gedurende 17,5 uur bij 37 ° C. Opmerking: Het is niet te geïncubeerd in een CO2 incubator. </li><li> Zuig het SA β-gal kleuroplossing en was de cellen tweemaal met PBS, zoals beschreven in stap 4.1.3. </li><li> Voeg de Eosine oplossing voor contra-kleuring. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen tweemaal met PBS, zoals beschreven in stap 4.1.3. </li><li> Afbeelding cellen bij 100X vergroting met behulp van een lichtmicroscoop en vast te leggen beelden met behulp van een aangesloten digitale camera voor verdere analyse. Opmerking: Het totale aantal cellen worden geteld in een blinde wijze en het percentage SA β-gal positieve blauwe cellen kunnen worden berekend. </li></ol></li><li> Cell Cycle Analysis (Figuur 3B) <ol><li> Zaad HDF&#39;s bij een dichtheid van8 x 10 4 cellen per putje in een 6 cm celkweekschaal HDF medium. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na een nacht incubatie, verwerp de helft van de HDF medium en voeg mES-CM en controle medium. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Trypsinize de cellen, zoals beschreven in stap 3.1 en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g. Was de cellen met koude PBS-oplossing (PBS met 0,5 mM CaCl2 en 2% FBS, 1 ml per 1,5 ml buisje) tweemaal en centrifugeer gedurende 3 min bij 2500 x g. Resuspendeer in 100 ul koud PBS oplossing. </li><li> Fixeer de cellen druppelsgewijs 200 ui koude ethanol terwijl vortexen. Bewaren bij 4 ° C gedurende tenminste 1 uur. </li><li> Was de cellen met koude PBS oplossing tweemaal, zoals beschreven in stap 4.2.3. </li><li> Resuspendeer de cellen in 250 ui natriumcitraat buffer (1,12%, pH 8,5) bevattende 50 ug / ml RNase. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 250 ul natriumcitraatbuffer bevattende 50 ug / ml propidiumjodide. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Meet de 10.000 cellen per monster via flowcytometrie 20. </li></ol></li><li> qRT-PCR (Figuur 3C) <ol><li> Seed HDF en voeg mES-CM, zoals beschreven in de stappen 4.1.1 en 4.1.2. </li><li> Isoleer totaal RNA van de HDF&#39;s met een RNA extractie kit volgens het protocol van de fabrikant. Kwantificeren geëxtraheerde totaal RNA met behulp van een spectrofotometer 21. </li><li> CDNA synthetiseren door toevoeging van 1 ug van totaal RNA een 20 ui reactiemengsel dat oligo (dT) primers en M-MLV reverse transcriptase volgens het protocol van de 20 fabrikant. </li><li> Meet de amplificatie van het cDNA met real-time PCR machine met behulp Green PCR Master Mix en specifiek gen primers (Supplement Tabel 1). Normaliseren van de data met GAPDH expressie. Gebruik de volgende PCR-protocol: de aanvankelijkenaturatie gedurende 10 min bij 95 ° C; 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C, 20 sec bij 55 ° C en 35 sec bij 72 ° C; en de smeltcurve podium voor 15 sec bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C, 30 sec bij 95 ° C en 5 sec bij 60 ° C 15. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Lavasani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+stem%2Fprogenitor+cell+dysfunction+limits+healthspan+and+lifespan+in+a+murine+progeria+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.</a> Nat Commun. 3, 608(2012).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+contribution+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+to+liver+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice.</a> Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).</li>
<li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li>
<li>Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+treating+ischemic+disease+using+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+without+direct+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation.</a> Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).</li>
<li>Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+for+critical+limb+ischemia%3A+microvascular+therapies+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age.</a> Circulation. 118, 9-16 (2008).</li>
<li>Lazarous, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+in+patients+with+intermittent+claudication%3A+results+of+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial.</a> J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).</li>
<li>Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+and+hurting%3A+molecular+mechanisms%2C+functions%2C+and+pathologies+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence.</a> Mol Cell. 36, 2-14 (2009).</li>
<li>Harrison, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+fed+late+in+life+extends+lifespan+in+genetically+heterogeneous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice.</a> Nature. 460, 392-395 (2009).</li>
<li>Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+sirtuins+viable+targets+for+improving+healthspan+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan.</a> Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).</li>
<li>Martin-Montalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+improves+healthspan+and+lifespan+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metformin improves healthspan and lifespan in mice.</a> Nat Commun. 4, 2192(2013).</li>
<li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153, 828-839 (2013).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisenescence+effect+of+mouse+embryonic+stem+cell+conditioned+medium+through+a+PDGF%2FFGF+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway.</a> FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+enrichment+and+analysis%3A+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+senescence+by+insulin-like+growth+factor+binding+protein-5+through+a+p53-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism.</a> Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor de succesvolle collectie van serum en feeder-free mES-CM, moeten de volgende suggesties in overweging worden genomen. De meest kritische factor is het gebruik van vroege passage mESCs voor het verzamelen van mES-CM. Eerder is aangetoond dat vroege passage mES-CM heeft betere anti-aging effect vergeleken met late passage mESCs. De passage aantal mESCs gemeld hun ontwikkelingspotentieel 16 en pluripotentie 17 beïnvloeden. Terwijl aanvulling behoeft de bijzondere kenm...

Het doel van dit protocol is om de muis te verzamelen embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) van serum en feeder-vrije kweekomstandigheden en zijn biologische functies te karakteriseren. In het algemeen zijn embryonale stamcellen (SER) hebben een groot potentieel voor regeneratieve geneeskunde en celtherapie als gevolg van hun pluripotentie en capaciteit voor zelf-vernieuwing 1-3. De directe transplantatie van stamcellen heeft verschillende beperkingen, zoals afstoting en tumorvorming 4,5. Daarom kan een cel-vrije benadering van een alternatieve therapeutische strategie voor de regeneratieve geneeskunde en veroudering interventies 6,7 bieden. Senescence wordt gezien als een cellulaire tegenhanger van de veroudering van weefsels en organen, gekenmerkt door een permanente staat van groeistop, veranderde cel fysiologie en gedrag. Veroudering is de belangrijkste risicofactor voor voorkomende ziekten zoals kanker, hart- en vaatziekten, tYpe 2 diabetes, en neurodegeneratie 8. Een voor de hand liggende kenmerken van veroudering is de daling van het regeneratieve vermogen van weefsels, die wordt veroorzaakt door stamcellen veroudering en uitputting 9. Veel belangrijke studies farmacologische moleculen, zoals rapamycine 9, resveratrol 10 en metformine 11, bloed overgedragen systemische factoren, namelijk GDF11 12, dat het vermogen om consequent veroudering te vertragen en verlengt de levensduur te laten geven. In de onderhavige studie werd mES-CM geoogst zonder serum (foetaal bovine serum, FBS) en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) lagen op de verontreiniging van serumfactoren en secretoire factoren uit MEFs sluiten. Deze voorwaarden zijn toegestaan ​​voor een serum en feeder-vrij CM dat bijgevolg kon de nauwkeurige identificatie van mES specifieke secretoire factoren. Deze voorgestelde protocol is zeer efficiënt, relatief kosteneffectief en eenvoudigopereren. Deze techniek geeft inzicht in de karakterisering van mES-afgeleide oplosbare factoren die een anti-veroudering effect kan bemiddelen, die kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van een veilig en potentieel voordelige celvrije therapeutische benadering van interventies voor veroudering geassocieerde ziekten en andere regeneratieve behandelingen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20%, ES cell quality</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 units/ml penicillin en 50&nbsp;mg/ml streptomycin</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>#25030</td><td>2&nbsp;mM</td></tr><tr><td>Nonessential amino acids (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&nbsp;&micro;M</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&nbsp;&micro;M</td></tr><tr><td>Leukemia inhibitory factor&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 units/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>3.70%</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&nbsp;&micro;g/ml</td></tr><tr><td>Propidium iodide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&nbsp;&micro;g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV reverse transcript-tase</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR master mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Corning</td><td>#430513</td><td>0.2 &mu;m</td></tr></tbody></table>

het verzamelen van serum en feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een cell-free approach

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

De capaciteit van embryonale stamcellen (ESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) om verschillende celtypen te genereren, heeft nieuwe wegen geopend op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Echter, ondanks hun voordelen, is het tumorigene potentieel van ESCs en iPSCs lange tijd een belemmering geweest voor klinische toepassingen. Interessant is dat aangetoond is dat ESCs verschillende oplosbare factoren produceren die weefselregeneratie kunnen bevorderen en cellulair verouderen kunnen vertragen, wat suggereert dat ESCs en iPSCs ook kunnen worden gebruikt als een celvrije interventiemethode. Daarom is er veel vraag naar de methode voor het verzamelen van muis-embryonaal stamcel (mESC)-geconditioneerd medium (mESC-CM) met minimale besmetting van serumcomponenten (foetaal bovien serum, FBS) en feedercellen (muis embryonale fibroblasten, MEFs). Hier demonstreert de huidige studie een geoptimaliseerde methode voor het verzamelen van mESC-CM onder serum- en feeder-vrije omstandigheden en voor de karakterisering van mESC-CM met behulp van verouderingsgeassocieerde meerdere uitlezingen. Dit protocol zal een methode bieden om pure mESC-specifieke secretoire factoren te verzamelen zonder serum en feeder besmetting.

Oorspronkelijk worden mESCs bijgehouden op een MEF feeder in mES medium met FBS en andere supplementen (figuren 1A en 2A). CM werd verzameld mESCs verminderd serum medium zonder voedsterlaag, FBS of andere supplementen (figuren 1B en 2B). Deze cultuur voorwaarde stelt ons in staat om te verzamelen mES-specifieke geconditioneerd medium zonder mogelijke besmetting door de factoren uit de feeder, FBS of andere supplementen....

Dit protocol verschaft een werkwijze voor het verzamelen van muis embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) verkregen uit serum (foetaal bovine serum, FBS) - en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) vrij voorwaarden voor een cel -gratis aanpak. Het kan dienstig voor de behandeling van veroudering en veroudering-geassocieerde ziekten.

Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

De algemene doelen van dit protocol zijn om geconditioneerd medium te verzamelen van muis embryonale stamcellen onder serum- en feeder-vrije kweekomstandigheden en om de biologische functies van dit medium te karakteriseren. Deze procedure biedt inzicht in de antiverouderingsactiviteit van oplosbare factoren die worden uitgescheiden door muis embryonale stamcellen voor de ontwikkeling van een veilige en cel-vrije therapeutische aanpak voor leeftijdsgerelateerde ziekten. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Dr. Yun-Ui Bae, een onderzoeksprofessor van mijn laboratorium.In een biologische veiligheidskast, behandel een muis embryonale fibroblast of MEF-celkweek met 20 milliliter MEF-medium aangevuld met mitomycin C in een 15 centimeter celkweekschaal gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer met PBS en los ze met drie milliliter trypsine EDTA gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Neutraliseer de trypsine met zes milliliter vers MEF-medium wanneer de cellen van de bodem van de plaat zijn losgekomen.Na het verzamelen van de cellen door centrifugatie, hersuspendeer de pellet in vijf

collection-serum-feeder-free-mouse-embryonic-stem-cell-conditioned

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Wij beschreven twee chemische-gebaseerde protocollen voor het kweken van muis embryonale stamcellen in detail. Deze nieuwe methode maakt gebruik van synergetische mechanismen ter bevordering van Tet-gemedieerde oxidatie (door vitamine C) en onderdrukken van DOVO synthese van 5-methylcytosine (door PD0325901) om DNA hypomethylation en pluripotent van muis embryonale stamcellen te onderhouden.

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.

CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen

Leer het verzamelen van serum- en feeder-vrij mESC-geconditioneerd medium voor anti-verouderingsonderzoek. Deze methode helpt onderzoekers veilige, celvrije therapieën voor leeftijdsgerelateerde ziekten te ontwikkelen.

Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach

Meer video's verkennen