Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

De algemene doelen van deze procedure zijn het isoleren en karakteriseren van een onconventionele intra-epitheliale celpopulatie, namelijk gamma delta T-cellen, uit een menselijk endocervicaal borstelmonster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de immuunprocessen binnen het endocervicale intra-epitheliale compartiment, om zo te helpen bij het ontwerpen van effectieve strategieën voor het voorkomen van infecties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een krachtig en efficiënt hulpmiddel biedt voor het in vitro bestuderen van endocervicale intra-epitheliale gamma delta T-lymfocyten.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Laura Romero, een senior research associate uit mijn laboratorium. Plaats de buis met de cytoborstel direct na afname op ijs. Vortex de buis met de cytoborstel binnen één uur na afname gedurende vier pulsen van 10 seconden.

Centrifuge vervolgens de buis en verwijder voorzichtig de borstel zonder het pallet te verstoren. Voeg daarna één milliliter IMDM-medium toe aan de cellen en plaats de buis op ijs. Plaats de cytobrush bovenop een cellzeef van 100 millimeter in een conische buis van 50 milliliter en spoel de borstel met 20 milliliter vers IMDM.

Centrifugeer het wassel. Resuspendeer de pellet in één milliliter vers IMDM en voeg dit wassel samen met de cellen in de oorspronkelijke cytobrush-opvangbuis. Om de endocervixcellen via flowcytometrie te analyseren, verdeelt u 1 tot 3 × 10⁵ cellen in 100 µL fax-buffer per buis van vijf milliliter, en labelt u de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker met de gewenste antilichamen en levendheidsverf.

Was aan het einde van de incubatie de cellen in één milliliter van de kitbuffer. Decanteer na het centrifugeren de supernatant volledig. Gebruik beads en de bijbehorende IgG-controleantilichamen om de compensatiecontroles in te stellen.

Laad vervolgens de eerste buis en stel de gate in op de totale endocervicale celpopulatie in een forward- en side-scatterplot, gevolgd door de uitsluiting van celdoubletten. Sluit de dode cellen uit op basis van hun expressie van de viabiliteitskleurstof, door te gaten op de levende CD45-positieve en CD3-positieve cellen. De gamma delta een en gamma delta twee positieve cellen worden gedefinieerd als de subpopulaties van CD3-positieve cellen die gamma delta TCR tot expressie brengen.

Om de gamma delta T-cellen te isoleren via magnetische bead-isolatie, resuspendeert u tot 1x10⁷ vers geoogste endocervicale cellen in 40 µL van de TCR gamma delta MicroBead kitbuffer. Label de cellen volgens de instructies van de fabrikant voor het tweestaps kleuringsprotocol met anti-TCR gamma delta hapteen-antilichamen, gevolgd door anti-hapteen FITC-geconjugeerde MicroBeads gedurende 15 minuten bij 4 tot 8 °C. Was de cellen aan het einde van de incubatie in 1 mL van de kitbuffer en schenk het supernatant volledig af.

Resuspendeer de cellen in 500 µL kitbuffer en breng de celsuspensie direct aan op een magnetische beadkolom die is geplaatst in de juiste scheidingsmagneet, waarbij de doorstroom in een nieuwe buis wordt opgevangen. Wanneer alle cellen door de kolom zijn gelopen, wordt de kolom drie keer gewassen met 500 µL verse buffer; voeg deze wasstappen samen met de opgevangen cellen. Om de gamma delta T-cellen te verzamelen, wordt de kolom overgebracht naar een conische buis, waarna de T-cellen met de zuiger van de kolom met 1 mL verse buffer uit de kolom worden gespoeld.

Om de gamma delta T-cellen te isoleren via fluorescence-geactiveerde cel sortering, labelt u de cellen met een levensvatbaarheidskleurstof, zoals zojuist gedemonstreerd in het antilichaampanel. Sorteer vervolgens de cellen op basis van de levensvatbaarheidskleurstof en de positiviteit voor CD45, CD3 en gamma delta. Een unieke populatie gamma delta V1-expresserende T-cellen kan eenvoudig worden gedetecteerd in menselijke endocervicale celmonsters.

Gedetailleerde fenotypische analyse van de geselecteerde CD3-positieve gamma delta 1-positieve cellen onthult dat de meerderheid van deze cellen CD4- en CD8-negatief is. Magnetische bead-separatie van de endocervicale cellen, zoals zojuist gedemonstreerd, resulteert in de zuivering van een populatie TCR gamma delta-cellen met een zuiverheid van bijna 98%. Dit zuiverheidsniveau kan ook worden bereikt via fluorescence activated cell sorting, wat het gebruik van beide technieken valideert voor de isolatie van endocervicale gamma delta T-cellen.

Interessant genoeg laat de analyse van endocervicale intraepitheliale cellen, gamma delta T-cellen, geoogst van hiv-geïnfecteerde vrouwelijke patiënten en gezonde donorkontrollen, een lichte afname zien in het aantal en de levensvatbaarheid van deze belangrijke cellen bij hiv-geïnfecteerde personen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee tot drie uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het monster snel te verwerken en de cellen gedurende de gehele procedure op ijs te houden om een goede cellevensvatbaarheid te behouden.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals single-cell sorting in combinatie met een multiplex PCR met hoge gevoeligheid en doorvoersnelheid, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de inflammatoire en signaleringspaden binnen het endocervicale intraepitheliale compartiment. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van hiv en infectieziekten om nieuwe celmarkers voor mucosale kwetsbaarheid te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intraepitheliale lymfocyten voorbereidt uit een menselijk endocervicaal borstelsample.