Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

De algemene doelen van deze procedure zijn het isoleren en karakteriseren van een onconventionele intra-epitheliale cel, gamma delta T-celpopulatie uit een menselijk endocervical borstelmonster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het begrijpen van de immuunreacties binnen het endocervicale intra-epitheliale compartiment, om te helpen bij het ontwerpen van effectieve strategieën voor het voorkomen van infecties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een krachtig en efficiënt hulpmiddel biedt voor het bestuderen van endocervicale intra-epitheliale gamma delta T-lymfocyten, in vitro.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Laura Romero, een senior onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium. Plaats onmiddellijk na het verzamelen de buis met de cytoborstel op ijs. Binnen een uur na het verzamelen, vortex de buis met de cytoborstel gedurende vier pulsen van 10 seconden.

Centrifugeer vervolgens de buis en verwijder voorzichtig de borstel zonder de palette te verstoren. Voeg vervolgens een milliliter IMDM-medium toe aan de cellen en plaats de buis op ijs. Plaats de cytoborstel op een 100 millimeter celzevener in een 50 milliliter kegelbuis en was de borstel met 20 milliliter vers IMDM.

Centrifugeer de was. Resuspendeer de palette in een milliliter vers IMDM en pool de was met de cellen in de originele cytoborstel verzamelbuis. Om de endocervicale cellen te analyseren door middel van flowcytometrie, verdeel één tot drie keer 10 tot de vijfde cellen in 100 microliter fax buffer per vijf milliliter buis, en label de cellen met de antilichamen en levensvatbaarheidskleurstof van belang gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen in één milliliter van de kitbuffer. Na het centrifugeren van de cellen, decanteer de supernatant volledig. Gebruik kralen en de juiste IgG controle-antilichamen om de compensatiecontroles in te stellen.

Laad vervolgens de eerste buis en stel de poort in op de totale endocervicale celpopulatie in een voorwaartse bij zijwaartse verspreiding, gevolgd door uitsluiting van de cel dubbels. Sluit de dode cellen uit op basis van hun levensvatbaarheidskleurstofexpressie, gating op de levende CD45 positieve en CD3 positieve cellen. De gamma delta een en gamma delta twee positieve cellen worden gedefinieerd als de subpopulaties van CD3 positieve cellen die gamma delta TCR tot expressie brengen.

Om de gamma delta T-cellen te isoleren door magnetische kralenisolatie, resuspendeer maximaal één keer 10 tot de zevende vers verzamelde endocervicale cellen in 40 microliters TCR gamma delta MicroBead kitbuffer. Volg de instructies van de fabrikant voor het tweedelige kleuringsprotocol, label de cellen met anti-TCR gamma delta haptenantilichaam, gevolgd door anti-hapten FITC geconjugeerde MicroBeads gedurende 15 minuten bij vier tot acht graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in één milliliter van de kitbuffer, en decanteer de supernatant volledig.

Resuspendeer de cellen in 500 microliters kitbuffer en breng de celsuspensie direct aan op een magnetische kralenkolom in de juiste scheidingsmagneet, en verzamel de doorstroming in een nieuwe buis. Wanneer alle cellen door de kolom zijn gegaan, was de kolom drie keer met 500 microliters verse buffer en pool de was met de verzamelde cellen. Om de gamma delta T-cellen te verzamelen, breng de kolom over in een kegelbuis en gebruik de kolomplunjer om de T-cellen uit de kolom te spoelen met één milliliter verse buffer.

Om de gamma delta T-cellen te isoleren door middel van door fluorescentie geactiveerde celsortering, label de cellen met een levensvatbaarheidskleurstof, in het antilichaampaneel zoals zojuist gedemonstreerd. Sorteer vervolgens de cellen op basis van hun levensvatbare kleurstof en CD45, CD3 en gamma delta positiviteit. Een unieke populatie gamma delta V1 tot expressie brengende T-cellen kan gemakkelijk worden gedetecteerd in menselijke endocervicale celmonsters.

Gedetailleerde fenotyische analyse van de gated CD3 positieve gamma delta een positieve cellen onthult dat de meerderheid van deze cellen CD4 en CD8 negatief is. Magnetische kralenscheiding van de endocervicale cellen, zoals zojuist gedemonstreerd, resulteert in de zuivering van een bijna 98% zuivere populatie van deze TCR gamma delta cellen. Dit zuiverheidsniveau kan ook worden bereikt door middel van door fluorescentie geactiveerde celsortering, wat het gebruik van beide technieken valideert voor de isolatie van endocervicale gamma delta T-cellen.

Interessant is dat de analyse van endocervicale intra-epitheliale cellen, gamma delta T-cellen, geoogst uit vrouwelijke HIV-geïnfecteerde patiënten en gezonde donorcontroles, een lichte vermindering aantoont in het aantal en de levensvatbaarheid van deze belangrijke cellen bij HIV-geïnfecteerde individuen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee tot drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het monster snel te verwerken en de cellen gedurende de hele procedure op ijs te houden om een goede cellevensvatbaarheid te behouden.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals single-cell sorting gecombineerd met een hooggevoelige doorvoer multiplex PCR, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de inflammatoire en signaalroutes binnen het endocervicale intra-epitheliale compartiment. Na de ontwikkeling ervan heeft deze techniek de weg geopend voor onderzoekers op het gebied van HIV en infectieziekten om nieuwe celmarkers van mucosale kwetsbaarheid te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intra-epitheliale lymfocyten uit een menselijk endocervical borstelmonster kunt bereiden.