Name: In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Leer een methode voor in situ detectie en kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes in menselijke cellen met behulp van nucleaire microprobe analyse. Deze techniek biedt waardevolle inzichten voor nanotoxicologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Serge Borderes voor regie en bewerken van de video. Van het Franse nationale agentschap onderzoek ondersteunt het onderzoeksprogramma TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). Het CNRS en de Europese Gemeenschap als een activiteit gericht op het integreren verstrekt de "steun voor openbare en industriële onderzoek met behulp van Ion Beam technologie (SPIRIT)" onder de EG contract n ° 227012. Dit werk werd ondersteund door Marie Curie-acties - Initial Training Networks (ITN) als een "integratie van activiteiten ter ondersteuning van postdoctorale onderzoek met stages in industrie en opleiding Excellence" (SPRITE, D1.3) onder EG contract nr. 317169. De C'NANO Grand Sud Ouest en de regio Aquitaine ondersteunen het onderzoeksprogramma TOX-NANO (n ° 20111201003) en het onderzoeksprogramma POPRA (n ° 14006636-034).

1. houder monstervoorbereiding
<ol><li>
Monster houder ontwerp en voorbereiding
	<ol>
<li>Een monsterhouder vervaardigen door het boren van een 5 x 5 mm vierkant in een 1 mm dikke PEEK frame.</li>
		<li>Schoon door spoelen met ethanol 70% (v/v) en bewaar in steriele platen tot klaar voor gebruik. Opmerking. Een monsterhouder geschikt is voor de cultuur van de cel en de cel behandeling is vereist. Het moet worden ontworpen voor cel kweken, in vitro waarnemingen met optische microscopie, en nucleaire microprobe analyse en beeldvorming. Deze houder is gemaakt van een frame PEEK13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van de houder van de monsters<ol>
<li>Bereid de oplossing van de Formvar door de ontbinding van 1 mg van Formvar poeder in 100 mL chloroform.</li>
		<li>Rekken de polycarbonaat folie op een metalen frame, zodat het geen vouwen presenteert.</li>
		<li>Een steriele tip gebruiken om de oplossing van de Formvar rond het monster houder gat.</li>
		<li>Fijn de monsterhouder met lijm op de uitgerekte polycarbonaat folie (een 5 x 5 mm vierkant) neergezet.</li>
		<li>Herhaal de vorige reeks een monsterhouder om voor te bereiden elke repliceren. Opmerking. De film van polycarbonaat (PC) is biocompatibel, dik genoeg en resistent zijn tegen de verschillende protocollen en analytische beperkingen. Let op- Chloroform is giftig. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast en passende filters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monster houder sterilisatie<ol>
<li>Plaats het gemonteerde monsterhouder in een conische kolf van 50 mL ethanol 70% (v/v) bij agitatie bij 180 rpm en +37 ° C's nachts, met behulp van een incubator/roerder.</li>
		<li>Spoel de houder meerdere malen in steriel gedistilleerd water.</li>
		<li>Lucht droog ze onder steriele omstandigheden en hen blootstellen aan het ultraviolette licht (kiemdodende lamp van bioveiligheid Bank, klasse II) gedurende 30 minuten aan elke kant.</li>
		<li>Houd de monsters in steriele 12-Wells-platen (een monsterhouder per putje) tot klaar voor gebruik. Opmerking: Meerdere houders van de steekproef kunnen worden achtergelaten bij kamertemperatuur in steriele en droge 12-Wells-platen verzegeld met parafilm voor meerdere dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. groei van cellen in de passende monsterhouder.
Let op: Protocol moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid laminaire flow bankje (klasse II) uit te sluiten van contaminerende micro-organismen. Omgaan met antibiotica (bijvoorbeeld penicilline, streptomycine) met handschoenen. Respecteren van beste praktijken bij de verwerking van biologische materialen (cellijnen, genetisch gemodificeerde afgeleid menselijke cellen).
Kritische: de cellijnen die gebruikt moeten worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat zij niet zijn besmet met Mycoplasma.
<ol><li>Transfect U2OS cellijn met plasmide rekening houdend met Matrix-roGFP 17,18,19 met behulp van een methode van de transfectie in overeenstemming met protocol vastgesteld door fabrikant.</li>
	<li>Om te bevestigen van transfectie met de plasmide-uitvoering de biosensor en plasmide om verlies te voorkomen, selecteer en handhaven van transfected cellen op de juiste voedingsbodem.</li>
	<li>Visualiseer transfected cellen door fluorescentie microscopie om ervoor te zorgen dat de transfectie is opgetreden en om de uitdrukking van de fluorescentie en de weergave van een netwerk van reticulaire en tubulaire mitochondriale19te bevestigen. Punt onderbreken: Cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof voor meerdere jaren.</li>
	<li>Gebruik de transfected celpopulatie door het kweken van de cellen in een geschikte voedingsbodem om sub confluente cel populaties. Het groeien van cellen bij 37 ° C, 5% (v/v) CO2 in de sfeer van een verzadigde water.</li>
	<li>Zaad cellen in een concentratie, zoals ze zijn aan 80% samenvloeiing de dag van fixatie. Typisch, kan een concentratie van 500 cellen per µL worden gebruikt. Oogsten van cellen met behulp van 400 µL trypsine-EDTA 0,25% (v/v) en houden gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Stop trypsine actie met 1 mL gestolde voedingsbodem. Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min op 230 x g en + 4 ° C, dan de bovendrijvende vloeistof verwijderen, en voeg de gewenste hoeveelheid verse kweekmedium. Opmerking. Het protocol is van toepassing op alle cellulaire typen en het aantal cellen die uitgezaaid is afhankelijk van de grootte van de cel en van cel tijd te verdubbelen. Let op: Vermijd onderwerpen trypsine, antibiotica en serum aan herhaalde bevriezen-ontdooien cycli. Houd ze steriel. De stockoplossing in aliquots verdelen en bevriezen ze bij −20 ° C. Bewaren de aliquots tot de vervaldatum. Spoel zorgvuldig de pellet cel om de trypsine volledig te verwijderen. Sporen van residuele trypsine zal vertragen en afname van de efficiëntie van de beplating.</li>
	<li>Cellen tellen en het uitvoeren van een verdunning met verse volledige kweekmedium bewaard bij 37 ° C om het verkrijgen van een celsuspensie met 500 cellen per µL. Opmerking: De concentratie van de celsuspensie moet worden aangepast als een functie van het celtype, om een daling van 40 µL plaat.</li>
	<li>Een daling van de 40 µL in het midden van de folie van polycarbonaat plaat. Breng de monsterhoeveelheid 2 h bij +37 ° C, 5% (v/v) CO2 zorgvuldig in de sfeer van een verzadigde water. Kritisch: Zodra het monster is geplaatst in de incubator, zo veel mogelijk mechanische beweging om het voordeel van snelle cel bijlage beperken. Volgens het celtype zou het nodig zijn om te broeden cellen langer dan 2 uur voor optimale platting efficiëntie. Controleer verzadigd dat de incubator sfeer goed is om te voorkomen dat druppels verdampen.</li>
	<li>Controleer of de cellen goed aangesloten op de folie van polycarbonaat met behulp van een optische Microscoop zijn. Zachtjes, voeg 2 mL verse compleet medium en houden gedurende 24 uur.</li>
</ol>3. nanodeeltjes voorbereiding en blootstelling
Opmerking: Fluorescerende kleurstof gemodificeerde TiO2 NPs werden ontworpen, gesynthetiseerd en chemisch gewijzigd met tetramethyl rhodamine isothiocyanaat (TRITC). 20 , 21 deze oppervlakte wijziging kunt nanoparticle detectie, bijhouden en localisatie in situ en in gnudles in zowel bij levende als vaste cellen of in meercellige organismen. 12 , 13 , 18
Let op: Nanomaterialen en nanodeeltjes moeten met zorg worden behandeld. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Voorkom verspreiding in lucht en worden nanodeeltjes bijgehouden in de oplossing (ultrazuiver water).
<ol><li>Maak een suspensie van 1 mg.mL−1 vanTiO2 NPs in ultrazuiver water. De TiO2 NPs met behulp van intensieve 1-min ultrasoonapparaat pulsen op RT verspreiden (750 W, 20 kHz, amplitude: 30%) met behulp van een ultra klankbron en een toegewijde conische microprobe.</li>
	<li>Verdun TiO2 NPs op de gewenste concentratie in het kweekmedium teneinde een opschorting van de blootstelling van de 4 µg.cm−2 (eindconcentratie). Medium vervangen door het juiste volume van middellange met NPs op cellen en meng zachtjes voor homogene verdeling van de TiO2 NPs. voorbereiden cellen ook zonder de toevoeging van TiO2 NPs.</li>
	<li>Incubeer de cel bevolking gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en de sfeer van een verzadigde water.</li>
</ol>4. paraformaldehyde fixatie en fluorescentie microscopie.
<ol><li>Bereid een verse oplossing van paraformaldehyde oplossing (PFA, 4% w/v) is gebufferd in fosfaat Buffer zoutoplossing (PBS, pH 7.4).<ol>
<li>Los 4 g PFA poeder in 100 mL PBS. Verwarm de oplossing tot 65 ° C tijdens het roeren met behulp van een magneet en een magneetroerder in een zuurkast. Het verhogen van de pH door toevoeging van 1 M NaOH één druppel tegelijk, totdat de oplossing heeft geleegd. Koel de oplossing tot kamertemperatuur en breng de pH op 7.4. De vers bereide oplossing direct gebruiken of bij + 4 ° C houden en beschermen tegen licht. Opmerking: Pre-en-klare PFA oplossingen kunnen worden gebruikt maar een vuist voorbereiding van PFA betere fixatie kwaliteit en instandhouding op lange termijn van de vaste monsters garandeert. Let op: PFA is giftig; Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast en passende filters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eens, de incubatietijd is verstreken, verwijdert u de cel-kweekmedium dat de TiO2 NPs. Rinse de cel populaties eenmaal met verse kweekmedium en een keer met PBS (2 mL). Verwijderen van PBS, snel afspoelen met een aliquoot gedeelte van het vers en koud PFA (4% w/v, + 4 ° C).<ol>
<li>Voeg PFA (2 mL, 4% w/v, + 4 ° C). Laat 15 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>Verwijder de PFA, spoel de cellen met PBS (2 mL 3 keer, 5 min) onder agitatie. Punt onderbreken: Deze chemisch vaste monsters kunnen worden gebruikt voor de "duik-freeze" procedure na fluorescentie imaging (go om stap 5) of alleen gebruikt voor fluorescentie imaging (go om stap 4.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vlek de kern met Hoechst33342 broeden de cellen gedurende 10 minuten in PBS. Hoescht33342 wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 500 nM. Na incubatie het verwijderen van de oplossing en spoel met PBS. Let op: Hoechst33342 cel permeant en kan worden giftig. Vermijd direct contact, en het gebruik van handschoenen tijdens het bereiden en gebruiken van Hoechst33342. Kritische: ervoor zorgen dat de Hoechst33342 kleurstofoplossing vers bereid en onder steriele omstandigheden onderhouden.</li>
	<li>Proces vaste monsters voor in situ en eencellige geschikt zijn met behulp van fluorescentie microscopie (Figuur 1).</li>
</ol>5. "duik-bevriezing" fixatie en uitdroging
<ol><li>Bereid een aluminiumplaat van de overdracht door het in vloeibare stikstof koeling. Winkel de plaat in een doos gevuld met vloeibare stikstof en handhaven van het oppervlak van de plaat boven de vloeistof in de koude stikstof damp. Opmerking: De overdracht plaat kan bestaan uit een metalen plaat (hier, wij gebruikten aluminium) dat kon worden afgekoeld tot de temperatuur van vloeibare stikstof, en die de freeze-dryer monsterkamer kunt invoeren. Kritisch: Het vak moet worden gehouden gesloten zo veel mogelijk om te voorkomen dat water vapor deposition op de koude plaat oppervlak. Het monster opgeslagen op de plaat tijdens de voorbereiding moet niet worden gedekt door de vloeibare stikstof.</li>
	<li>Spoel cellen eenmaal in cultuurmedium en vervolgens tweemaal meer, kort, in steriele en ultrazuiver water om ontdoen van elk spoor van resterende extracellulaire zouten. Kritisch: Ervoor zorgen dat de media vers bereid en onder steriele omstandigheden onderhouden. Alle media bij 37 ° C verhit voordat zij worden gebruikt. Het spoelen moet heel kort (enkele seconden) en de overmaat vloeistof op de monsters zo snel mogelijk verwijderd.</li>
	<li>Duik-freeze de cellen bij-150 ° C in vloeibare stikstof-gekoelde 2-methylbutane tijdens 30 s en plaats ze op de aluminium plaat overbrengen. Opslaan van monsters hier tijdens de voorbereiding van alle overige monsters. Wanneer monsters zijn alle cryofixed, transfer all-at-once door het plaatsen van de plaat van de overdracht in een freeze-droger. Kritisch: Het totale proces van de Cryofixatie moet niet meer dan 20 minuten duren om te voorkomen dat structurele wijzigingen in de monsters tijdelijk opgeslagen in het vak van de overdracht wordt weergegeven.</li>
	<li>Freeze-Dry van de monsters met behulp van de volgende reeksen: 1) het uitvoeren van een primaire uitdroging voor 12 tot 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) bij lage druk en lage temperatuur, dan 2) Voer een secundaire uitdroging fase gedurende ten minste 24 uur, verhoging van de temperatuur van de plaat aan + 40 ° C terwijl de lage druk (+ 40 ° C, 10-3 mbar). Let op: Vloeibare stikstof is extreem koude en kan leiden tot ernstige bevriezing of oog schade bij contact. Gebruik aangepast Bank top containers voor vervoer en veiligheidsuitrusting (cryogene handschoenen, bescherming van ogen en gezicht) dragen. Let op: 2-Methylbutane is zeer licht ontvlambaar. Een schadelijke vervuiling van de lucht kan vrij snel worden bereikt over de verdamping van deze stof bij + 20 ° C. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Ademhaling en oogbescherming en beschermende handschoenen gebruiken. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast. Kunnen worden opgeslagen bij + 4 ° C. Kritisch: Gebruik een geschikte thermometer (-150 ° C) om te controleren de 2-Methylbutane temperaturen tijdens de "Duik-freeze"-sessie. De 2-methylbutane moet cool in een vloeibare fase worden bewaard. Overdracht van cryofixed monsters naar de omringende atmosfeer kan veroorzaken cellulaire schade als gevolg van de temperatuurstijging of waterdamp condenserend op het oppervlak van de steekproef. Bijgevolg moet worden overgeboekt zo snel als redelijkerwijs mogelijk (30 s) Punt onderbreken: Na Cryofixatie, kunnen de monsters bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor meerdere dagen in steriele en droge omstandigheden (beschermd tegen stof en vocht). Zorgvuldig omgaan met de monsters met een fijne Tang en plaats ze in een steriele 12-well plaat verzegeld met parafilm. Droogmiddel kan worden gebruikt voor het drogen van de atmosfeer.</li>
</ol>6. nucleaire Microprobe analyse
Opmerking: Nucleaire Microprobe-analyse werd uitgevoerd op de lijn van de microbeam van AIFIRA (toepassingen Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions nl Région Aquitaine) via de aanvullende ion beam analytische technieken Particle geïnduceerde X-ray emissie (µ- PIXE) en Scanning transmissie Ion microscopie (µ-STIM). De faciliteit is gebaseerd op een 3,5 MV deeltjesversneller lichte ion balken leveren in het energiebereik MeV. 22 , 23
Punt onderbreken: AIFIRA is een ion beam faciliteit gehost door de Universiteit van Bordeaux, dat een toegang tot nationale en internationale teams na wetenschappelijke evaluatie van het voorgestelde experiment biedt.
<ol><li>Monteer de PEEK monster houders op een apertured plaat met behulp van dubbelzijdige tape.</li>
	<li>Plaats de plaat ter ondersteuning van monster in een verticaal vlak loodrecht op de richting van de lichtbundel.</li>
	<li>Sluit de analyse kamer en Stofzuig de kamer van de analyse.</li>
	<li>Scanning transmissie Ion microscopie (µ-STIM) Opmerking: STIM wordt gebruikt voor het opnemen van oppervlaktedichtheid kaarten van cellen na de conversie van energieverlies tot cellulaire massa, profiteren van het feit dat het energieverlies evenredig aan de oppervlaktedichtheid van monster is (uitgedrukt in µg.cm-2).<ol>
<li>Gebruik een 2 MeV Helium (He+) microbeam als een sonde met een grootte in het brandvlak van rond 300 nm in diameter en bij lage spreekvaardigheid (2000 ions.s-1). Maatregel de energie van de verzonden ionen met een vlakke silicium-detector (pitten detector, 25 mm2, 11 keV energie resolutie @ 5.4 MeV), achter het monster in de as van de lichtbundel is geplaatst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deeltje geïnduceerde X-ray emissie (µ-PIXE) en Rutherford Backscattering spectrometrie (µ-RBS). Opmerking: µ-Pixe en µ-RBS analyses bieden de ruimtelijke verdeling en kwantificering van chemische elementen met een resolutie van sub micrometer.<ol>
<li>Gebruik een 1.5 MeV proton (H+) microbeam (50-150 pA), gericht tot een diameter van 1 µm en scan over dezelfde cellen van belang gespot door STIM van 4 tot 8 uur en ongeveer 100 x 100 µm2.</li>
		<li>Geïnduceerde X-ray fotonen uitgezonden van atomen aanwezig in het monster (zwaarder dan nb) door een hoge resolutie Si(Li) solid-state detector (145 eV energie resolutie, @Mn-Kα) geplaatst op 45 ° uit de inkomende as van de lichtbundel te verzamelen. Gebruik de gedetecteerde foton-energie om de aard van de vervuilers (bijvoorbeeld Z van element) en X-ray intensiteit te bepalen van de concentratie van het element te identificeren.</li>
		<li>Achterwaarts-verstrooid protonen bij-135 ° gelijktijdig te verzamelen met een silicium-detector (gedeeltelijk verarmd detector, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5.4 MeV) voor het meten van het totale aantal inkomende deeltjes en om te normaliseren X-ray intensiteiten. Kritisch: Een collectie van gecertificeerde kalibratie normen voor de kwantificering van de atomaire concentratie wordt gebruikt om het kalibreren van de detectorresponsie X-ray. Referentiematerialen zijn een collectie van dun atomaire films gestort op 6.3 µm dik Mylar-folie. X-Ray energieën variëren van 0.6 (Li, K line) tot 20,2 uitgestoten keV (Rh, K-lijn).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. de gegevensanalyse
<ol><li>Chemische elemental kaarten met behulp van de IBA-J-plugin voor ImageJreconstrueren. 24 Opmerking: Speciale software in de vorm van een plugin voor ImageJ is ontwikkeld om ruwe nucleaire microprobe analysegegevens te verwerken. Ruwe gegevens komen overeen met een lijst van evenementen die voortvloeien uit de particle beam interactie met cellen die samen met de positie van de bundel als een chronologische volgorde zijn opgenomen.<ol>
<li>Gebruik de IBA-J plugin om gebeurtenissen volgens hun type sorteren: ion energie (STIM) overgebracht, terugverstrooide ion energie (RBS) of X-ray foton-energie (PIXE). Vervolgens verwerken afzonderlijk elk type gegevens.</li>
		<li>Berekenen van de dichtheid van de STIM selecteur</li>
		<li>Berekent gemiddelde X-ray foton energie spectra en definiëren voor elk scheikundig element van belang een energie-venster om op te halen van de ruimtelijke elementdistributie.</li>
		<li>Definiëren van de regio's van belang (ROI) (bijvoorbeeld afzonderlijke cellen, dichte structuur, aggregaten, enz.) en bereken de bijbehorende x-ray spectra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De overeenkomstige RBS spectra analyseren om te berekenen van het totale aantal incident deeltjes25.</li>
	<li>Passen X-ray spectra met behulp van de Gupix software26 om te bepalen van de concentratie van het element voor elke ROI. Opmerking: Typische detectiegrens (LOD) voor de methode is in het bereik 1 tot en met 10 µg.g-1 in drooggewicht afhankelijk van het atoomnummer van elementen (LOD afneemt met Z).</li>
</ol>

<ol><li>Krug, H. F., Wick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology%3A+An+Interdisciplinary+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).</li>
<li>Van Hove, M. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0920586105008783">From surface science to nanotechnology.</a> Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).</li>
<li>Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/ntrev.2013.2.issue-2/ntrev-2012-0080/ntrev-2012-0080.xml">Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches.</a> Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).</li>
<li>Oberdorster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+assessment+for+nanotechnology+and+nanomedicine%3A+concepts+of+nanotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Int.+Med%22%5BJournal%5D)">Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology.</a> J. Int. Med. , 89-105 (2009).</li>
<li>Savolainen, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925753510000767">Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review.</a> Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).</li>
<li>Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+assessment+of+engineered+nanomaterials+and+nanotechnologies+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol%22%5BJournal%5D)">Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review.</a> Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).</li>
<li>Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology+and+in+vitro+studies%3A+The+need+of+the+hour%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour.</a> Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).</li>
<li>Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+nanoparticles+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med%22%5BJournal%5D)">Resolving the nanoparticles paradox.</a> Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).</li>
<li>Schaumann, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969714014739">Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts.</a> Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).</li>
<li>Olesik, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlesik%2C+JW+%22Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometers.+Treatise+on+Geochemistry%22">Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry</a>. , Elsevier Ltd. (2014).</li>
<li>Krystek, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0026265X12000422">A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12154-015-0133-5">Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology.</a> J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+in+situ+detection+and+quantification+of+metal+oxide+nanoparticles+using+multimodal+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy.</a> Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).</li>
<li>Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Methods+for+Imaging+Metals+in+Biology%3A+From+Transition+Metal+Metabolism+to+Transition+Metal+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling.</a> Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).</li>
<li>Legin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/sc/c3sc53426j#!divAbstract">NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs.</a> Chem. Sci. 5, 3135(2014).</li>
<li>Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and profiling of single cells.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).</li>
<li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Dynamic+Redox+Changes+in+Mammalian+Cells+with+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Mitochondrial+Redox+Potential+with+Redox-sensitive+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Chen, X., Mao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+dioxide+nanomaterials%3A+Synthesis%2C+properties%2C+modifications+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications.</a> Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).</li>
<li>Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21425910">Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity.</a> Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).</li>
<li>Sorieul, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X14002894">An ion beam facility for multidisciplinary research.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).</li>
<li>Barberet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X11002199">First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications.</a> Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).</li>
<li>Devès, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X15000373">An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).</li>
<li>Mayer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMayer%2C+M+%22SIMNRA+User%27s+Guide%2C+Report+IPP+9%2F113%22">SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113</a>. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).</li>
<li>Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X10006452">The Guelph PIXE software package IV.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).</li>
<li>Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+Dioxide+Nanoparticles+Induce+Endoplasmic+Reticulum+Stress-Mediated+Autophagic+Cell+Death+via+Mitochondria-+Associated+Endoplasmic+Reticulum+Membrane+Disruption+in+Normal+Lung+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells.</a> PLoS ONE. , 1-17 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Beschrijven we een methode verstrekken van nuttige informatie dan wat mogelijk met andere beeldvormingstechnieken, met name op de subcellular niveau is. Naast haar imaging vermogen biedt nucleaire microprobe analyse ook mogelijkheden voor kwantificering van chemische elementen in te voeren in de samenstelling van een biologische steekproef. In het huidige werk, we onderzocht menselijke cel populaties en gericht tot de analyse van een gekozen gebied van belang op basis van een enkele cel blootgesteld aan TiO2 N...

Cellulaire homeostase wordt bepaald door de controle van de opname, assimilatie en intracellulaire lokalisatie van verschillende sporenelementen (ionen, metalen, exogene anorganische verbindingen). Deze onderdelen zijn vaak in de vorm van sporen, maar toch een aanzienlijke impact kunnen hebben in de Fysiologie van het systeem. De studie van biochemie van de cel in zowel normale als pathologische/benadrukt situaties is dus een sleutel-stap op weg naar een allesomvattend begrip van cellulaire metabole mechanismen. Daarom wordt de ontwikkeling van beeldvorming en analytische technieken waardoor het onderzoek van intracellulaire chemische abundanties, structurele organisatie en hun bijbehorende metabolische functies nodig. Er zijn zeer weinig methoden kunnen bieden van een in situ kwantitatieve stuk van gegevens betreffende de algemene chemische aard van een monster. Naast het analyseren van monsters in de vorm van bulk, analyses- in situ overwegen biologische monsters in hun volledigheid zonder verlies van massale en structurele informatie, waardoor het behoud van hun samenstellende chemische stoffen (sporenelementen en ionen) en eiwitten. Daarnaast, aangezien de nanowetenschappen ontwikkelen blijven, verbeterde beeldvorming en analysemethoden voor milieubewaking cellulaire duurzaame zullen nodig zijn om te observeren en te kwantificeren van nano-object gedrag en interacties. 1
Nanodeeltjes (NPs) zijn gedefinieerd als objecten tentoonstellen van ten minste één gezicht dimensie in het bereik 1 en 100 nm. 2 vanwege hun specifieke fysisch-chemische eigenschappen, NPs worden uitgebreid gebruikt in de industrie. NPs werkzaam zijn in de bio-toepassingen en in de nanogeneeskunde. 3 , 4 ondanks de talrijke fysisch-chemische eigenschappen van de NPs, kunnen ze genereren sommige risico's van nadelige effecten op de menselijke gezondheid en milieu. Deze risico's kunnen worden veroorzaakt door zowel langdurige en herhaalde blootstelling op verschillende concentratieniveaus en dit is nog niet duidelijk vastgesteld. 5 , 6 , 7 , 8 In het bijzonder, het lot van NPs binnen cellen en de bijbehorende cellulaire reacties zijn, tot op heden niet volledig beschreven. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de schaarste van methoden waarmee de opsporing en kwantificering van verinnerlijkte NPs in één cel. 9
De klassieke analytische instrumenten gebruikt om te schatten de cellulaire dosis van nanodeeltjes zijn microscopies, massaspectrometrie (MS), met inductief gekoppeld plasma (ICP-MS) MS10,11 en vloeistofchromatografie die MS (LC-MS), maar ze alleen bieden nuttige informatie op de macroscopische schaal. Geen enkel van hen kan een precieze evaluatie van de subcellular NPs-inhoud, noch de verdeling van de NPs zonder het gebruik van fractionering methoden aan. Een systematische evaluatie van de dosis-respons is dus onmogelijk met deze methoden, in tegenstelling tot methoden die gebaseerd zijn op atomaire spectroscopie zoals nucleaire microprobe analyse12,13, synchrotron Röntgen fluorescentie microscopie14 , en secundaire Ion massaspectrometrie (SIMS). 15 , 16 deze methoden zijn bijzonder interessant, aangezien ze als aanvulling op de opmerkingen die zijn gemaakt met behulp van fluorescentie microscopie, vooral wanneer NPs niet kunnen worden aangeduid met fluorescerende moleculen en dus in hun oorspronkelijke staat worden bestudeerd. Tot op zekere hoogte zelfs wanneer NPs zijn geënt met fluorophores, blijft (i) kwantificering moeilijk omdat de tagging niveau per NP onbekend is en (ii) de chemische modificatie van het oppervlak van NP de cellulaire verdeling kan wijzigen.
In dit artikel, we concentreren op een methode gebaseerd op een combinatie van nucleaire microprobe technieken die gericht zijn op de morfologie en de elementaire samenstelling van biologische monsters in majeur, mineur, imaging en concentraties te traceren.
Nucleaire microprobe analyse blijkt te zijn met name geschikt voor het meten van chemische sporenelementen in biologische weefsels. Zowel de lichtbundel laterale resolutie (0.3-1 µm) en de gevoeligheid in scheikundig element detectie (van 1 tot 10 µg.g-1 droge massa) zijn geschikt voor studies op cellulair niveau. Nucleaire microprobe technieken zijn gebaseerd op deeltjes detectie (fotonen, elektronen, ionen) uitgezonden nadat de ion beam (meestal uitgevoerd bij MeV energieën) met atomen aanwezig in het monster interageert. Het gaat hoofdzakelijk om interacties in cellen: 1) excitatie/ionisatie van atomen, gevolgd door een emissie van fotonen nadat atomen terug naar hun fundamentele staat; en 2) diffusie van inkomende deeltjes leiden tot veranderingen in hun energie en richting. De meting van allowsthe identificatie van de energie van de uitgestoten deeltjes van atomen betrokken bij de interactie. Voor het uitvoeren van elementen in kaart te brengen, is de ion-microbeam herhaaldelijk gescand over het monster oppervlak, vaak over een oppervlakte van ongeveer 100 per 100 µm-2 met verschillende cellen. Uitgestoten deeltjes worden gedetecteerd en hun energie wordt vastgelegd voor de positie van elke balk. Sorteren van de deeltjes volgens het standpunt van de bundel, is dus het identificeren van de structuur die verantwoordelijk is voor de uitstoot van deze deeltjes het doel van gegevensverwerking. Hier beschrijven we juist een aanpak op basis van fluorescentie microscopie en nucleaire microprobe analyse om te ontdekken, alsmede te kwantificeren van exogene NPs op de cellulaire en sub cellulaire schalen, om te onderzoeken van de gevolgen van NP interacties met levende systemen. We zullen met name richten op de mogelijkheden van deze methode in termen van in situ kwantificering van titaandioxide nanodeeltjes (TiO2 van NPs) aggregaten subcellular niveau.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC, LGC STANDARDS</td><td>ATCC HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Medium MCCOY 5A zonder L-Glutamine</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>L0211-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>500105U</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;L-Glutamine 200 mM, 100 mL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin,&nbsp; 20 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10092772</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)&nbsp; 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Red</td><td>Lipocalyx</td><td>VR-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-roGFP Plasmid</td><td>AddGene</td><td>#49437</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Voorzichtig handelen</td></tr><tr><td>NP's voorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TiO2 P25 AEROXIDE</td><td>Degussa/Evonik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T3163</td><td>Oppervlaktemodificatie van NP's</td></tr><tr><td>Steekproefvoorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaat folie</td><td>Goodfellow</td><td>CT301020</td><td></td></tr><tr><td>Polyether ether ketone ondersteuning (PEEK)</td><td>Matechplast</td><td>A-239-4047</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, ACS absoluut</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>02860-6x1L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorvorm, Anhydrous, 99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>372978-1L&nbsp;</td><td>Let op giftig</td></tr><tr><td>Formvar 100 g</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1201</td><td>Schadelijk. Gebruik in een concentratie van 10 &micro;g per mL chloroform</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Steekproeffixatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poeder, 95% Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500G</td><td>Let op giftig. Gebruik als een 4% oplossing in PBS</td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, zonder Ca2+ en Mg2+)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>93443</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>Steekproef cryofixatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibaar stikstof</td><td>air liquids sante</td><td></td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>Methylbutaan >=99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>&nbsp;M32631-1L</td><td>Let op giftig</td></tr><tr><td>Aluminium overdrachtsplaat</td><td>Home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gedistilleerd en gedeïoniseerd water</td><td>Home-made</td><td></td><td>Geproduceerd in het laboratorium met behulp van het Barnstead Smart2Pure-systeem</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barnstead Smart2Pure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50129870</td><td></td></tr><tr><td>Bioveiligheidsbench, klasse II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MSC-Advantage</td><td></td></tr><tr><td>TC20 geautomatiseerde celteller</td><td>Biorad</td><td>145-0102SP</td><td></td></tr><tr><td>Tellende glijbanen 2 welzen</td><td>Biorad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energieresolutie @5.5 MeV</td><td>Canberra&nbsp;</td><td>PD25-12-100AM</td><td></td></tr><tr><td>Hoge resolutie Si (Li) vaste-toestanddetector, 145-eV energieresolutie, @Mn-K&alpha;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Everhart-Thornley type secundaire elektronendetector (SED)&nbsp;</td><td>Orsay Physics</td><td>1-SED</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard natrium of Chloor als NaCl</td><td>Micromatter</td><td>34381</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard Magnesium als MgF2</td><td>Micromatter</td><td>34382</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard Aluminium als Al metaal</td><td>Micromatter</td><td>34383</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard Silicium als SiO</td><td>Micromatter</td><td>34384</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard Zwavel als CuSx</td><td>Micromatter</td><td>34385</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard Calcium als CaF2</td><td>Micromatter</td><td>34387</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard Titanium als Ti metaal</td><td>Micromatter</td><td>34388</td><td></td></tr><tr><td>XRF kalibratie standaard IJzer als Fe metaal</td><td>Micromatter</td><td>34389</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 750W</td><td>Sonics Materials</td><td>11743619</td><td></td></tr><tr><td>3MM microprobe</td><td>Bioblock scientific</td><td>220-05</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisator in vacuüm</td><td>Elexience</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>Optische microscoop Zeiss AxioObserver Z1</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>431006-9901</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde stage xy</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>432031-9902</td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objectief</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420351-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objectief</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420781-9910</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 02</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>488002-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 38HE</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>489038-9901</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 31</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>000000-1031-350</td><td></td></tr><tr><td>Chemische dampkap</td><td>Erlab</td><td>Captair SD321</td><td></td></tr><tr><td>Deeltjesversneller</td><td>HVEE</td><td>singletron</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National

in situ detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire microprobe analyse

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Micro-analytische technieken gebaseerd op scheikundig element imaging inschakelen de lokalisatie en de kwantificering van chemische samenstelling op cellulair niveau. Ze bieden nieuwe mogelijkheden voor de karakterisatie van levende systemen en zijn met name geschikt voor het detecteren, lokaliseren en kwantificeren van de aanwezigheid van metaaloxide nanodeeltjes zowel in biologische monsters en het milieu. Inderdaad, deze technieken die alle voldoen aan desbetreffende eisen wat betreft (i) gevoeligheid (van 1 tot 10 µg.g-1 van droge massa), (ii) micrometer bereik ruimtelijke resolutie, en (iii) multi element detectie. Gegeven deze kenmerken, microbeam scheikundig element imaging kan krachtig aanvullen routine beeldvormingstechnieken zoals optische en fluorescentie microscopie. Dit protocol wordt beschreven hoe een nucleaire microprobe-analyses uit te voeren op gekweekte cellen (U2OS) blootgesteld aan titaandioxide nanodeeltjes. Cellen moeten groeien op en direct in een speciaal ontworpen monsterhouder gebruikt op de optische Microscoop en de nucleaire microprobe analyse fasen worden blootgesteld. Duik-freeze cryogene fixatie van de monsters behoudt de cellulaire organisatie zowel de chemische elementdistributie. Gelijktijdige nucleaire microprobe analyse (scanning transmissie ion microscopie, Rutherford backscattering spectrometrie en deeltje geïnduceerde X-ray emissie) uitgevoerd op het monster bevat informatie over de cellulaire dichtheid, de lokale distributie van de chemische elementen, evenals de cellulaire inhoud van nanodeeltjes. Er is een groeiende behoefte aan dergelijke analytische instrumenten binnen de biologie, met name in de nieuwe context van Nanotoxicologie en nanogeneeskunde waarvoor ons begrip van de interacties tussen nanodeeltjes en biologische monsters moet worden verdiept. In het bijzonder, zoals nucleaire microprobe analyse geen nanodeeltjes worden geëtiketteerd vereist, zijn nanoparticle abundanties kwantificeerbaar zodat ze tot op het niveau van de afzonderlijke cel in een celpopulatie, onafhankelijk van hun oppervlakte staat.

Celkweek en fluorescentie beeldvorming van fluorescently geëtiketteerde TiO 2 NPs
We ontwierpen een monsterhouder aangepast voor cultuur van de cel, cel behandeling alsmede multimodale analyse. Het was in het bijzonder belangrijk dat de houder routine optische microscopie toegestaan als goed als nucleaire microprobe analyse en beeldvorming. Deze monsterhouder is gebas...

Beschrijven we een procedure voor de opsporing van chemische elementen aanwezig in situ in menselijke cellen, alsmede hun kwantificering in vitro . De methode is geschikt voor elk celtype en is vooral nuttig voor de kwantitatieve chemische analyses in afzonderlijke cellen na in vitro metaaloxide nanodeeltjes blootstelling.

In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Nanodeeltjes worden steeds vaker gebruikt in de industrie en de geneeskunde vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Er blijven echter zorgen bestaan over de menselijke gezondheid in verband met langdurige blootstelling aan nanodeeltjes. Deze risico's kunnen worden gekwantificeerd door het gedrag van nanodeeltjes binnen cellen en de daaropvolgende metabole respons van cellen op nanodeeltjes te bestuderen.Dit is gedeeltelijk te wijten aan het gebrek aan methoden die de detectie en kwantificering van geïnternaliseerde nanodeeltjes in één enkele cel mogelijk maken. Hoewel talrijke analytische instrumenten, waaronder microscopie en massaspectrometrie, kunnen worden gebruikt om de cellulaire opname van nanodeeltjes te schatten, bieden deze enkel kwalitatieve informatie op microscopisch niveau. In tegenstelling hiermee kunnen in situ-methoden op basis van atoomspectroscopie de hoeveelheid beeldartifacten die ontstaan door monstervoorbereiding verminderen en kunnen ze directe observatie van nanodeeltjes opleveren.Om hiervan te profiteren, presenteren wij een correlatieve benadering waarmee we nanodeeltjes kunnen bestuderen, zowel in de natuurlijke staat als in een laboratoriumbed met een fluorescente tag. Hier beschrijven we een methode gebaseerd op de combinatie van fluorescentiemicroscopie en nucleaire microprobe-analyse. Dit levert beelden op van de cellulaire dichtheid, de ruimtelijke distributie van chemische elementen en het aantal nanodeeltjes per cel.Ter demonstratie zullen we onderzoek doen naar cellen die gedurende 24 uur zijn blootgesteld aan titaniumdioxide-nanodeeltjes, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel fluorescentiemicroscopie als nucleaire microprobe-analyse. Voor dit protocol is een op maat gemaakte monsterhouder van het polymeer PEEK nodig. Deze moet geschikt zijn voor celkweek en in vitro observaties.Bedek de houder met een twee micron dikke polycarbonaatfolie. De polycarbonaatfolie wordt met een dunne laag Formvar-oplossing op de PEEK-schaal gelijmd. Eenmaal gemonteerd, moet de monsterhouder worden gesteriliseerd.Meerdere steriele monsterhouders kunnen worden bewaard, één per putje, in een steriele plaat met twaalf putjes totdat ze nodig zijn voor gebruik. Cellen die zijn getransfecteerd met matrix row GFP-plasmiden worden gecontroleerd via fluorescentiemicroscopie om te bevestigen dat de transfectie succesvol is verlopen en dat ze het fluorescerende eiwit tot expressie brengen. Oogst de cellen met trypsine en incubeer ze gedurende drie minuten bij 37 °C.Stop de werking van trypsine door vers kweekmedium toe te voegen. Pelletiseer de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 1200 omwentelingen per minuut bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg een passend volume vers kweekmedium toe.Tel de cellen en voer een verdunning uit met vers en gethermostateerd compleet kweekmedium om een celsuspensie van 500 cellen per µL te verkrijgen. Pipetteer een druppel van 40 µL in het midden van de polycarbonaatfolie. Plaats het monster voorzichtig gedurende twee uur in de celincubator.Voeg voorzichtig twee milliliters vers kweekmedium toe en laat dit 24 uur staan. Fluorescente dimodificeerde titaniumoxide-nanodeeltjes werden ontworpen, gesynthetiseerd en gegraft met veelgebruikte fluoroforen om nanodeeltjes in vitro te detecteren, te volgen en te lokaliseren. Voor deze stap dient reeds een suspensie van titaniumdioxide-nanodeeltjes in ultrapuur water met een concentratie van één milligram per milliliter te zijn bereid.Dispergeer de nanodeeltjes door middel van intense sonicatiepulsen van één minuut bij kamertemperatuur. Verdun de nanodeeltjes in een geschikt kweekmedium om een expositiesuspensie van 4 µg/cm² te verkrijgen. Vervang het vorige celkweekmedium door dit nieuwe medium met nanodeeltjes en meng dit voorzichtig om een homogene distributie van de nanodeeltjes te bereiken.Bereid op dezelfde wijze een set controlecellen voor zonder toevoeging van titaandioxide-nanodeeltjes. Incubeer de celpopulaties gedurende 24 uur. Met behulp van paraformaldehyde kunnen deze monsters worden gefixeerd en verwerkt voor in situ- en single-cell imaging middels fluorescentiemicroscopie.Cryogene fysieke fixatie behoudt echter de ultrastructuur en biochemische integriteit van de cel. Fixatie door plunge freezing stopt de cellulaire activiteit binnen milliseconden en voorkomt het gebruik van fixatieve verbindingen. Om de cellen cryogeen te fixeren, voeren we het volgende uit.Bereid een aluminium overbrengingsplaat voor door deze te koelen in vloeibare stikstof. Bewaar de plaat in een doos gevuld met vloeibare stikstof, waarbij het oppervlak van de plaat boven de vloeistof in de koude stikstofdamp wordt gehouden. Koel een voldoende hoeveelheid 2-methylbutaan af tot 150 graden Celsius.Bereid één Falcon-buis van 50 milliliter voor met kweekmedium en twee Falcon-buizen met ultrapuur water. Zorg dat er absorberend papier in de buurt is om het monster te drogen voordat het wordt ingevroren. Spoel de cellen eenmaal met kweekmedium en daarna nog twee keer met steriel, ultrapuur water om overtollige zouten die in het kweekmedium achterblijven te verwijderen.Droog het monster snel op het absorptiepapier. Plunge-freeze de cellen gedurende 30 seconden in het gekoelde 2-methylbutaan en plaats ze op de gekoelde aluminium overdrachtplaat. Het is van essentieel belang dat de doos zo veel mogelijk gesloten blijft om te voorkomen dat waterdamp condenseert op het oppervlak van de koude plaat.Nadat alle monsters zijn ingevroren, wordt vriesdrogen uitgevoerd via de volgende methode om eventueel water te sublimeren. Voer eerst een primaire desiccatie uit gedurende 12 tot 24 uur bij lage druk en lage temperatuur. Voer vervolgens, terwijl de druk laag blijft, een secundaire desiccatiefase uit van ten minste 24 uur, waarbij de plaattemperatuur wordt verhoogd naar 40 °C.Na cryofixatie kunnen monsters gedurende enkele dagen bij kamertemperatuur worden bewaard onder steriele en droge omstandigheden, beschermd tegen stof en vocht. De nucleaire microprobe-analyse werd uitgevoerd bij de Ifera-faciliteit in Bordeaux, Frankrijk. Een 3,5 megavolt singletron-deeltjesversneller levert een lichte ionenbundel in het mega-elektronvolt energiebereik.Chemische elementimaging werd uitgevoerd op de microprobe-beamline met behulp van complementaire ionenbundelanalysetechnieken. De gebruikte technieken waren micro-PIXE (particle-induced X-ray emission), STIM (scanning transmission ion microscopy) en micro-RBS (rutherford backscattering spectrometry). Monsters worden in de analysekamer geplaatst en onder vacuüm bestraald met verschillende deeltjes om diverse ionenbundelanalyses uit te voeren.STIM wordt gebruikt om luchtdichtheidskaarten van cellen vast te leggen op basis van energieparticles die passeren door celregio's met verschillende dichtheden. Micro-PIXE- en micro-RBS-analyse zorgen voor de ruimtelijke distributie en kwantificering van chemische elementen op enkelcelniveau. Een protonenmicrobundel van 1,5 megaelectron volt wordt gefocust tot een diameter van ongeveer 1 micrometer en gescand over de betreffende cellen, die door STIM zijn geïdentificeerd.Röntgenstraling die wordt uitgezonden door atomen in het monster, variërend van natrium tot titanium, maakt het mogelijk om de elementaire concentraties te bepalen. Terugverstrooide protonen worden verzameld om het totale aantal binnenkomende deeltjes te meten, wat nodig is om de röntgenintensiteiten te normaliseren. Het is essentieel om gecertificeerde kalibratiestandaarden te hebben voor de kwantificering van elementaire concentraties om de respons van de röntgendetector te kalibreren.Om de gegevens van de ionenbundel te analyseren, hebben we een nieuwe plugin voor ImageJ ontwikkeld. Eerst werden STIM-dichtheidskaarten berekend. Het contrast in scanning transmission iron microscopy-beelden is het gevolg van lokale verschillen in dichtheid en maakt de detectie van celstructuren zoals de kern en het cytoplasma mogelijk.Meerdere kaarten kunnen tegelijk worden verwerkt. Elke kaart komt overeen met de gemiddelde overgedragen energie van inkomende deeltjes. De tweede stap in de data-analyse bestaat uit het berekenen van individuele cellspectra.Deeltjesgeïnduceerde röntgenemissieanalyse levert zowel de chemische samenstelling van het monster als de elementaire kaarten van chemische elementen op. Chemische elementkaarten worden berekend nadat fotonen zijn gesorteerd op basis van de bundelpositie op het moment van registratie en nadat een energievenster is geselecteerd dat is gecentreerd rond een specifiek element. Kaarten representeren gewoonlijk het aantal gedetecteerde gebeurtenissen op de bundelpositie en bevatten kwantitatieve gegevens.Er wordt een stapel chemische kaarten berekend, één voor elk geselecteerd element. De regio's van belang voor elke cel worden bepaald met behulp van de PIXE-gegevens voor fosfor. De spectra die overeenkomen met elke volledige cel worden vervolgens berekend door de individuele spectra over de regio van belang van elke cel op te tellen.Vanaf dit punt kunnen kwantitatieve gegevens over de chemische abundanties in elke cel worden geëxtraheerd met behulp van gespecialiseerde PIXE- en IBS-analysesoftware. Hier tonen we fluorescentiebeelden van cellen na fixatie met paraformaldehyde. De bovenste rij toont cellen die niet zijn blootgesteld aan titaniumdioxide-nanodeeltjes, terwijl de onderste rij dat wel is.Het blauwe kanaal toont de celkern, het groene kanaal toont mitochondria en het rode kanaal toont titanium. Er is duidelijk te zien dat er in de controles geen titaandioxide aanwezig is. Uit het samengevoegde kanaal aan de rechterzijde blijkt dat nanodeeltjes uitsluitend in het cytoplasma worden aangetroffen en uit de mitochondria worden uitgesloten.Wat deze methode echter mist, is kwantitatieve informatie over de nanodeeltjesconcentratie. Nucleaire microprobe-analyse kan hiervoor uitkomst bieden. Deze afbeeldingen zijn allemaal gemaakt met behulp van diverse microprobe-analysetechnieken.Opnieuw toont de bovenste rij de controlecellen en de onderste rij de cellen die titanium-nanodeeltjes bevatten. De meest linkse afbeelding toont STIM-metingen van de dichtheid van de cryogeen gefixeerde cellen. De volgende drie panelen tonen de hoeveelheid kalium, fosfor en titanium in de cellen, verkregen via PIXE.Ook hier is geen titanium zichtbaar in de controles noch in de celkernen. Om de opname van titanium per cel te kwantificeren, definiëren we interessegebieden op basis van de celgrenzen die in het meest rechtse paneel worden getoond en meten we de elementaire abundanties in deze gebieden. Op basis van deze PIXE-metingen hebben we de verdeling van de elementaire abundanties op enkelcelniveau uitgezet voor de controle- en de blootgestelde populaties.De controlegroep is in het wit weergegeven en de blootgestelde groep in het geel. De mediane hoeveelheid titanium die hier aanwezig is, is vrij laag in vergelijking met de blootstellingsdosis van 4 µg/cm². Het bereik van de titaniumopname vertoont een grote variatie binnen de populatie, van 0,2 µg/cm² tot 1,8 µg/cm².We stelden ook een toename vast van vrije intracellulaire ionen, zoals kalium en calcium, in monsters die waren blootgesteld aan nanodeeltjes, wat wijst op een verstoring van de cellulaire homeostase veroorzaakt door de aanwezigheid van titaniumdioxide-nanodeeltjes. Nucleaire microprobe-analyse kan nuttige informatie verschaft op subcellulair niveau en biedt een kwantificering van de chemische elementen waaruit een biologisch monster bestaat. Deze technieken bieden vele voordelen.Ten eerste, in monsterpreparatie waarbij geen chemische fixatie vereist is. Ten tweede, de mogelijkheid om grotere gebieden te bestuderen met de bekwaamheid om op aanvullende gebieden van interesse te focussen. Ten derde, de kwantificering van chemische elementen met een gevoeligheid van enkele microgram per gram.En vierdens, de identificatie van celcompartimenten zoals de nucleus, nucleolus en het cytoplasma. De nauwkeurige bepaling hiervan is, bij het bestuderen van de internalisering van nanodeeltjes in individuele cellen, essentieel voor kwantitatieve nanodeeltjes-toxicologie. Zoals aangetoond in de hier bestudeerde gevallen, stelt het vermogen om nanodeeltjes binnen individuele cellen waar te nemen en te kwantificeren ons in staat om de accumulatie van endogene en exogene chemische elementen, zoals metaaloxide-nanodeeltjes, beter te begrijpen.Dit protocol benadrukt de geschiktheid van nucleaire microprobe-analyse voor toekomstige studies naar de interactie van nanodeeltjes met levende cellen. De kwantitatieve benadering verschaft informatie over de impact van deze nanodeeltjes op het gebied van detectie, identificatie, lokalisatie en kwantificering, op single-cell niveau voor zowel natuurlijke als chemisch gemodificeerde nanodeeltjes.

in-situ-detection-single-cell-quantification-metal-oxide

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Laser-induced afbraak spectroscopie uitgevoerd op dunne orgaan-en tumorweefsel met succes natuurlijke elementen en kunstmatig geïnjecteerd gadolinium (Gd), die met ingang van Gd-gebaseerde nanodeeltjes aangetroffen. Afbeeldingen van chemische elementen bereikt een resolutie van 100 micrometer en kwantitatieve sub-mm gevoeligheid. De verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel om meerdere beelden van een zelfde biologisch weefsel te bieden.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: Een nieuwe aanpak voor de nanodeeltjes&#39;s Mapping en kwantificering in orgaanweefsel

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Vanwege het belang en het grootschalige gebruik van palladium, goud en kobalt   metalen in high-tech apparatuur, de terugwinning en recycling vormen een belangrijk industrieel uitdaging. Het metalen recovery systeem hierin beschreven is een eenvoudige, goedkope middelen voor de effectieve opsporing, verwijdering en herstel van deze metalen uit de stedelijke mijne.

Detectie en herstel van Palladium, Goud en Cobalt metalen uit de Urban Mine via innovatieve sensoren / Adsorbentia Aangewezen met nanoschaal Wagon-wheel-vormige poriën

Verbeterde donkerveldmicroscopie en hyperspectraal beeldvorming met spectraal mapping maken screening, lokalisatie en identificatie van nanoschalige materialen in histologische monsters mogelijk met verbeterde snelheid en nauwkeurigheid ten opzichte van traditionele methoden. Het doel van dit artikel is om methoden te bieden voor donkerveld beeldvorming en hyperspectraal mapping van metaaloxide nanodeeltjes in histologische monsters.

Identificatie van Metal Oxide Nanodeeltjes in histologische monsters door Enhanced Darkfield Microscopie en hyperspectrale Mapping

Het isoleren van elektrische en thermische effecten op elektrisch ondersteunde vervorming (EAD) is erg moeilijk met behulp van macroscopische monsters. Metaalmonster micro- en nanostructuren samen met een aangepaste testprocedure zijn ontwikkeld om de invloed van toegepaste stroom op de formatie te evalueren zonder de verwarming van de uil en de evolutie van ontwrichten op deze monsters.

Een nieuwe methode voor<em&gt; In situ</em&gt; Elektromechanische Karakterisering van Nanoscale Exemplaren

Deze paper biedt een beknopt overzicht van de inspanningen bij de Army Research Laboratory op de verwerking van bulk nanocrystalline metalen met een nadruk op de methoden voor de productie van de roman metaalpoeders.

Verwerking van Bulk Nanocrystalline metalen bij de US Army Research Laboratory

In dit werk, wordt een protocol voor signaal verhoging van de nanosonde gebaseerde biosensing gepresenteerd. Het protocol is gebaseerd op de vermindering van chloroauric zuur op het oppervlak van de bestaande nanoprobes die bestaan uit goud, zilver, siliciumdioxide of ijzer-oxide nanodeeltjes.

Snelle nanosonde signaal versterking door In Situ gouden Nanoparticle synthese

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van discrete metalen zuurstof clusters, polyoxometalates (POMs), bij de enkelvoudige molecuul limiet met behulp van een biologisch nano-gebaseerd elektronisch platform. De methode biedt een complementaire benadering van traditionele analytische chemie instrumenten die worden gebruikt in de studie van deze moleculen.

Fysische karakterisering van enkele metallische nanodeeltjes in hoge resolutie

Hier is een protocol voor celkweek op siliciumnitride membranen en Plunge-bevriezing voorafgaand aan röntgenfluorescentie Imaging met een Synchrotron cryogene X-Ray nanoprobe. Wanneer alleen kamertemperatuur nano-analyse wordt verstrekt, kunnen de bevroren monsters verder gevriesdroogd worden. Dit zijn cruciale stappen om informatie te verkrijgen over de intracellulaire Elemental Composition.

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

IJzeroxide nanodeeltjes worden gesynthetiseerd via een nonaqueous sol gel procedure en bedekt met anionische korte moleculen of polymeer. Het gebruik van magnetometrie voor het monitoren van de integratie en biotransformaties van magnetische nanodeeltjes in menselijke stamcellen wordt aangetoond met behulp van een trillende monstermagnetometer (VSM).

Magnetometrie gebruiken om cellulaire integratie en daaropvolgende biologische afbraak van chemisch gesynthetiseerde ijzeroxide nanodeeltjes te monitoren

We bieden een algemeen overzicht van kwantitatieve microanalysemethoden voor het schatten van de locatiebezetting van onzuiverheden en hun chemische toestanden door gebruik te maken van elektronengeangaliseerde verschijnselen onder incidentele elektronenstraal-schommelomstandigheden, die betrouwbaar informatie extraheren uit minderheidssoorten, lichtelementen, zuurstofvacatures en andere punt/lijn/planaire defecten.

Kwantitatieve atomaire-site analyse van functionele dopants/puntdefecten in kristallijne materialen door elektronengeankan-verbeterde microanalyse

Leer een methode voor in situ detectie en kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes in menselijke cellen met behulp van nucleaire microprobe analyse. Deze techniek biedt waardevolle inzichten voor nanotoxicologie.

In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Meer video's verkennen