In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Nanodeeltjes worden steeds vaker gebruikt in de industrie en geneeskunde vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Toch blijven er zorgen bestaan over de gezondheidsrisico's die gepaard gaan met langdurige blootstelling aan nanodeeltjes. Deze risico's kunnen worden gekwantificeerd door het gedrag van nanodeeltjes in cellen te bestuderen en de geïnduceerde metabolische reacties van cellen op nanodeeltjes.

Dit is deels te wijten aan het ontbreken van methoden die de detectie en kwantificering van geïnternaliseerde nanodeeltjes in een enkele cel mogelijk maken. Hoewel talrijke analytische hulpmiddelen, waaronder microscopie en massaspectrometrie, kunnen worden gebruikt om de opname van nanodeeltjes door cellen te schatten, bieden deze slechts kwalitatieve informatie op microscopisch niveau. Daarentegen kunnen in situ-methoden op basis van atomaire spectroscopie de hoeveelheid beeldartefacten verminderen die voortkomen uit monstervoorbereiding en kunnen ze directe observatie van nanodeeltjes opleveren.

Om hiervan te profiteren, presenteren we een correlatieve benadering die ons in staat stelt nanodeeltjes te bestuderen, hetzij in de native toestand, hetzij in een laboratorium omgeving met een fluorescerende tag. Hier beschrijven we een methode op basis van de combinatie van fluorescentiemicroscopie en nucleaire microsonde-analyse. Dit biedt beelden van de cellulaire dichtheid, speciale verdeling van chemische elementen en de hoeveelheid nanodeeltjes per cel.

Als demonstratie zullen we onderzoek doen naar cellen die gedurende 24 uur zijn blootgesteld aan titaandioxide nanodeeltjes met behulp van zowel fluorescentiemicroscopie als nucleaire microsonde-analyse. Voor dit protocol is een aangepaste monsterhouder gemaakt van het polymeer PEEK nodig. Het moet geschikt zijn voor celkweek en in vitro-observaties.

Bedek de houder met twee micron dik polycarbonaatfolie. De polycarbonaatfolie wordt met een dunne laag Formvar-oplossing op de PEEK-schaal gelijmd. Eenmaal gemonteerd, moet de monsterhouder worden gesteriliseerd.

Meerdere steriele monsterhouders kunnen, één per putje, in een steriele twaalfcellenschaal worden bewaard totdat ze nodig zijn voor gebruik. Cellen getransfecteerd met matrixrij GFP-plasmiden worden gecontroleerd door fluorescentiemicroscopie om ervoor te zorgen dat de transfectie met succes heeft plaatsgevonden en dat ze het fluorescerende eiwit tot expressie brengen. Verzamel de cellen met trypsine en incubeer ze gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius.

Stop de trypsinactie door vers kweekmedium toe te voegen. Bezinken de cellen door vijf minuten te centrifugeren bij 1200 omwentelingen per minuut bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg een geschikt volume vers kweekmedium toe.

Tel de cellen en voer een verdunning uit met vers en gethermostateerd compleet kweekmedium om een celsuspensie van 500 cellen per microliter te verkrijgen. Plaats een druppel van 40 microliter in het midden van de polycarbonaatfolie. Plaats het monster voorzichtig in de celincubator gedurende twee uur.

Voeg voorzichtig twee milliliter vers kweekmedium toe en laat ze gedurende 24 uur staan. Fluorescerende di-gemodificeerde titaniumoxide nanodeeltjes werden ontworpen, gesynthetiseerd en geënt met veel gebruikte fluoroforen om nanodeeltjes in vitro te detecteren, traceren en lokaliseren. Voor deze stap zou al een titaandioxide nanodeeltjessuspensie in ultra-puur water met een concentratie van één milligram per milliliter moeten zijn bereid.

Verspreid de nanodeeltjes door één minuut lange intense sonicatiepulsen bij kamertemperatuur te gebruiken. Verdun de nanodeeltjes in een geschikt kweekmedium om een blootstellingssuspensie van vier microgram per vierkante centimeter te verkrijgen. Vervang het vorige cellenkweekmedium door dit nieuwe nanodeeltjesbevattende medium en meng het voorzichtig om een homogene nanodeeltjesverdeling te verkrijgen.

Bereid op dezelfde manier een set controlecellen zonder toevoeging van titaandioxide nanodeeltjes. Incubeer de celpopulaties gedurende 24 uur. Met behulp van paraformaldehyde kunnen deze monsters worden gefixeerd en verwerkt voor in situ en single-cell beeldvorming met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Cryogene fysische fixatie behoudt echter de celultrastructuur en biochemische integriteit. Duiken bevriezing fixatie stopt snel de cellulaire activiteit binnen milliseconden en vermijdt het gebruik van fixeermiddelen. Om de cellen cryogisch te fixeren, voeren we het volgende uit.

Bereid een aluminium overdrachtsplaat voor door deze in vloeibare stikstof te koelen. Bewaar de plaat in een doos gevuld met vloeibare stikstof, waarbij het plaatoppervlak boven het vloeistofniveau in de koude stikstofdampen blijft. Koel een voldoende hoeveelheid 2-methylbutaan af tot 150 graden Celsius.

Bereid één 50 milliliter Falcon met kweekmedium en twee Falcons met ultrapuur water. Zorg ervoor dat absorberend papier in de buurt staat om het monster te drogen voordat het wordt ingevroren. Spoel de cellen eenmaal in kweekmedium en vervolgens twee keer in steriele, ultrapuur water om overtollig zout dat in het kweekmedium achterblijft te verwijderen.

Droog het monster snel op het absorberend papier. Duik bevries de cellen in het gekoelde 2-methylbutaan gedurende 30 seconden en plaats ze op de gekoelde aluminium overdrachtsplaat. Het is van cruciaal belang dat de doos zoveel mogelijk gesloten blijft om te voorkomen dat waterdamp condenseert op het koude plaatoppervlak.

Na het invriezen van alle monsters wordt lyofilisatie uitgevoerd door de volgende methode om eventueel aanwezig water te sublimeren. Voer eerst een primaire droging uit gedurende 12 tot 24 uur bij lage druk en lage temperatuur. Vervolgens, met lage druk, voer een secundaire drogingsfase uit gedurende ten minste 24 uur met de plaattemperatuur verhoogd tot 40 graden Celsius.

Na cryofixatie kunnen monsters gedurende meerdere dagen bij kamertemperatuur worden bewaard onder steriele en droge omstandigheden beschermd tegen stof en vocht. Nucleaire microsonde-analyse werd uitgevoerd in de Ifera-faciliteit in Bordeaux, Frankrijk. Een 3,5 megavolt singletron deeltjesversneller levert een licht