Imaging Metals in hersenweefsel door Laser Ablation - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie (LA-ICP-MS)

Het algemene doel van deze methode is het kwantificeren van de ruimtelijke distributie van metalen in weefselcoupes met behulp van laserablatie-inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie. Deze methode kan kernvragen beantwoorden binnen zowel de fundamentele biologie als het ziekteonderzoek, in het bijzonder voor aandoeningen waarbij metaalbiochemie betrokken is bij de ziektepathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ruimtelijke informatie over metalen behouden blijft, wat traditioneel verloren gaat bij conventionele metaalanalyse-technieken.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie en diagnose van neurodegeneratieve ziekten, omdat het ons in staat stelt om te monitoren hoe metalen veranderen in hersengebieden waar celsterfte optreedt. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het opzetten van deze lange en complexe experimenten. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het ontwerpen van het experiment en het analyseren van de gegevens uitdagend kan zijn omdat elke stap in een specifieke volgorde moet worden uitgevoerd.

Plaats eerst een hersenweefselmonster en alle matrix-gematchte weefselstandaarden in de laserablatiekamer. Controleer of de monsters zich binnen de scherptediepte van de LACCD-camera bevinden. Sluit de deur van de kamer en draai de schroeven met de hand vast.

Open vervolgens in de ICPMS-software de klep van het dragersgas en stel de debietsnelheid in op 1,2 liters per minuut. Voer in de LA-software een spoeling van 30 minuten van de ablatiecel uit met het dragersgas. Verplaats bij een ablatiecel met een volume van twee eenheden elke tien minuten de monsterhouder naar elke hoek van de kamer om de hoeveelheid resterende lucht in de cel te verminderen.

Zet de ICPMS aan en laat het instrument twee uur opwarmen. Terwijl het instrument opwarmt, trekt u in de laserablatiesoftware een ablatielijn van ongeveer drie millimeter lang over het oppervlak van de eerste weefselstandaard. Klik op de ablatielijn en stel de standaardstraaldiameter, de scansnelheid en de stralingsfluentie in.

Dupliceer de lijn zes keer en hanteer een tussenruimte tussen de lijnen die gelijk is aan de straaldiameter. Herhaal dit proces voor elke standaard. Gebruik vervolgens de lijntool om het ablatiegebied over het monster te tekenen, vanaf de linkerbovenhoek over het breedste punt van het monster, met dezelfde parameters als bij de standaarden.

Herhaal de lijn indien nodig voor volledige dekking van het monster met dezelfde tussenruimte als gebruikt bij de standaarden. Teken vervolgens een reeks lijnen voor periodieke scanning van de standaarden, uiterlijk na 20 uur scannen van het monster, of tussen elk monster. Voeg aan het einde van het experiment een scan van de standaarden toe.

Bepaal op basis van de lijnlengte en de scansnelheid de analysetijd voor de monster- en standaardlijnen. Maak vervolgens een nieuwe batch aan in de ICPMS-software en selecteer tijdsopgeloste analyse. Kies de massagetals-ladingsverhoudingen van belang en stel de integratietijden voor elke verhouding zo in dat de totale integratietijd voor één cyclus 0,25 seconden bedraagt.

Sla de batch op. Vul voor een standaardbatch de analysetijd voor elke lijn in met een extra buffer van 15 seconden om rekening te houden met de opwarmtijd van de laser en de uitspoeltijden. Stel een monsterlijst op met een acquisitie voor elke standaardlijn.

Dupliceer voor de monsterbatch de standaardbatch en pas de tijden en het aantal acquisities aan op basis van het ablatiepatroon van het monster. Zodra de ICPMS is opgewarmd, voegt u de eerste batch toe aan de wachtrij en zorgt u ervoor dat de software wacht op een trigger van het LA-instrument. Zet vervolgens in de LA-software de voeding van de laser aan en stel de opwarm- en uitspoeltijden van de laser in.

Start de lasersequentie en controleer of de ICPMS na ablatie correct begint met de gegevensverzameling. Zodra de gegevens zijn verzameld, extraheert u de gegevens voor de standaarden uit de CSV-bestanden. Voer baseline-correcties uit en sluit het achtergrondsignaal uit.

Identificeer signaalvalen veroorzaakt door gaten in de weefselstandaarden. Maskeer deze gebieden met een laag signaal en exporteer vervolgens de gegevens als een spreadsheet. Bereken voor elk geïdentificeerd element een conversiefactor van CPS naar PPM.

Herhaal dit proces voor elke standaard. Open vervolgens de software voor kwantitatieve beeldconstructie en importeer de monstergegevens uit de CSV-bestanden. Selecteer verschillende gebieden van de achtergrond om achtergrondcorrectie toe te passen.

Selecteer de grafiekbewerkingstool, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer 'modify image appearance'. Wijzig de eerste kleur bij Z naar een grote negatieve waarde en klik op 'done' om het achtergrondsignaal te verbeteren. Voer vervolgens in het tabblad 'standards' de CPS PPM-correctiefactoren voor elke standaard in en klik op 'go'.

Open de databrowser in het tabblad gegevens, klik met de rechtermuisknop op een gecorrigeerd afbeeldingsbestand en klik op nieuwe afbeelding. Open het venster voor het wijzigen van het uiterlijk van de afbeelding en stel de kleurtabellen en de schaal in. Gebruik de tool voor het toevoegen van annotaties om een kleurenschaal op de afbeelding te plaatsen.

Pas de kleurenschaal aan in het venster voor de kleurenschaal. Zodra de afbeelding is ingekleurd en geannoteerd, kan de afbeelding worden gekopieerd en geplakt in een ander programma, of worden geëxporteerd vanuit de software voor beeldconstructie. Om de ROI-instrumenten te activeren, selecteert u beeldverwerking uit de analysepakketten en kiest u een afbeelding.

Klik in het tabblad afbeelding op ROI en start het tekenen van de ROI. Selecteer het gebied van interesse en klik vervolgens op finish ROI. Klik in het tabblad afbeelding op stats om de ROI-gegevens te verkrijgen.

Kopieer en plak de gegevens in een spreadsheet en zorg ervoor dat u opslaat nadat elke ROI is toegevoegd. Herhaal dit proces indien nodig. Met deze techniek werd de metaalgehalte en -distributie van een wild-type muizenbrein onderzocht.

Hier worden de distributies van koolstof, magnesium en fosfor weergegeven in counts per seconde. Kwantitatieve beelden worden getoond voor mangaan, koper, ijzer en zink. De koolstofdistributie werd gebruikt als interne standaard.

IJzer was het meest aanwezig in het middenbrein en de gyrus dentatus. Zink was het meest aanwezig in de corticale gebieden. De informatie uit deze beelden kan vervolgens worden gebruikt om de expressie en functionaliteit van metaalbindende eiwitten te volgen. Zodra men de methode beheerst, kan een experiment dat meerdere dagen in beslag neemt, binnen een uur worden opgezet indien dit correct wordt gedaan.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw ablatielijnen en uw databestanden te synchroniseren met ICPMS. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals histologische kleuring op aangrenzende secties, worden uitgevoerd om extra informatie te verkrijgen, zoals de colocalisatie van metalen met specifieke eiwitten. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we wilden onderzoeken hoe metaalniveaus veranderden in laboratoriummodellen voor de ziekte van Parkinson.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in neurodegeneratie, kan ze ook worden toegepast op verschillende weefseltypen en ziektestadia, waaronder menselijk weefsel en diverse biologische matrices. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen om te onderzoeken hoe metaalniveaus veranderen in zowel menselijke monsters als diermodellen van ziekten. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u het laserablatie-ICPMS-experiment opzet.

Vergeet niet dat werken met biologisch materiaal uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.