Een Model voor perineurale invasie in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om snel meerdere behandelingscondities te evalueren die perineurale invasie bij plaveiselcelcarcinoom in de kop en nek beïnvloeden, met zeer hoge succespercentages van de test en reproduceerbaarheid. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van oncologie in de kop en nek te beantwoorden, zoals welke factoren van invloed zijn op de perineurale invasie van kankercellen in de kop en nek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een groot aantal tests snel en reproduceerbaar kan worden uitgevoerd vanuit één muis in een relatief korte tijd.

Voordat u begint met de dissectieprocedure van het dorsale wortelganglion, of DRG, voegt u vers medium op kamertemperatuur toe aan ten minste 40 putjes van een V-vormige 96-wellplaat. Gebruik vervolgens een paar fijne schaar om een longitudinale incisie te maken langs de wervelkolom van de staartwortel tot aan het hoofd van de muis. En verdeel het weefsel dwars onder de sacrale wervelkolom, waarbij beide zijden van de wervelkolom worden gescheiden tot aan de basis van de schedel.

Breng het monster onder de microscoop over en observeer het cervicale uiteinde van de wervelkolom bij lage vergroting. Het witte ruggenmerg is zichtbaar in het midden van een botachtige ring, omgeven door variabele hoeveelheden perispinale spieren en zacht weefsel. Gebruik microscopische veerschaar om de dorsale, of superieure, kant van de eerste twee tot drie wervellichamen te splitsen.

Gebruik vervolgens de veeractie van de schaar om deze initiële bot-incisie te openen, om ervoor te zorgen dat de dissectie van het wervellichaam op de middellijn plaatsvindt. Ga in kleine stappen door naar de sacrale wervelkolom, waarbij de wervelkolom wordt gedeeld met identieke sneden aan de ventrale, of inferieure, kant van de wervellichamen. Leg een helft van de wervelkolom opzij en breng de andere helft van de wervelkolom met het ruggenmerg op zijn plaats op een steriele plaat met de ruggenmerg in plaats.

Gebruik vervolgens twee 18-gauge naalden om beide uiteinden van de helft van de wervelkolom op het polystyreen dissectieplatform vast te zetten. Begin vervolgens bij het smallere, cervicale uiteinde en verwijder voorzichtig het ruggenmerg vanaf ongeveer vier wervelniveaus. In het gebied waar de sensorische zenuwen in de DRG invoegen, grijpt u voorzichtig het omringende fascia met microscopische pincetten en gebruikt u microscopische veerschaar om deze fascia en ander zenuwweefsel te trimmen om de DRG vrij te maken.

Gebruik onder hogere vergroting de veerschaar om de perifere zenuw zo dicht mogelijk bij de DRG af te snijden om het weefsel vrij te maken en de proximale takken bij te snijden. Trim vervolgens de DRG van eventuele losse zenuwvezels of fasciale aanhechtingen en plaats het geïsoleerde weefsel in een putje van de 96-well V-vormige plaat. Om de semi-solide matrixdruppels voor te bereiden, brengt u één glazen putje over van ijs naar een ijsblok onder de operatiemicroscoop.

Plaats de punt van een pipet van niet meer dan 10 microliter direct op het glas onder een hoek van 45 graden en doseer voorzichtig een druppel van 1,5 microliter matrix op het glas. Beweeg de pipetpunt langzaam van het glas weg terwijl de matrix in contact komt met de plaat. Deponeer één druppel matrix op elk van de vier hoeken van de plaat en breng de plaat over naar een oppervlak op kamertemperatuur gedurende ongeveer één minuut.

Wanneer de matrix enigszins is verstevigd, brengt u de plaat terug naar het ijsblok en gebruikt u gesloten microscopische pincetten om de DRG voorzichtig met de linkerhand op te scheppen. Gebruik de rechterhand om voorzichtig het zenuwweefsel naar de punt van een 21-gauge naald te brengen en gebruik de naald om de DRG voorzichtig in het midden van de matrixdruppel te plaatsen. De DRG zou gemakkelijk in de matrix moeten vrijkomen voor centrale positionering met de naald.

Nadat u een DRG-stuk in elk van de vier druppels hebt geplaatst, plaatst u de plaat gedurende drie minuten in een incubator op 37 graden Celsius. Wanneer alle DRG zijn ingebed, houdt u de platen één voor één op een lichte hoek en voegt u langzaam vier milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS toe aan de platen, zodat het medium alleen geleidelijk in contact komt met de matrix DRG-eenheden. Breng de platen terug naar de incubator voor nog eens 48 tot 72 uur.

Wanneer de neurites minstens 75% van de rand van de matrix hebben bereikt, zuigt u het medium uit de putjes zonder de matrix DRG-eenheden te verwijderen. Vervolgens plaatst u, met behulp van een 200-microliter pipet met een soepele trigger, twee druppels van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter medium boven elke matrix DRG-test. En breng de platen terug naar de incubator.

Na één uur voegt u voorzichtig vier milliliter DMEM met 10%FBS toe langs de zijwand van de glazen bodemplaat en brengt u de platen terug naar de incubator tot hun volgende microscopische evaluatie. Na hun dissectie en plaatsing in de matrixdruppels, zou het uiterlijk van de test moeten lijken op de in de matrix ingebedde DRG die hier wordt getoond. Merk op dat de DRG niet perfect rond is, maar is gecentreerd in de matrixdruppel, waardoor de uitgroei van neurites in 360 graden mogelijk is.

Direct na het bedekken vormen de plaveiselcelcarcinoomcellen in de kop en nek een ringvormige ring rond de matrix en breiden zich over de volgende twee tot drie dagen uit langs de neurites. Cellen die op blanco controledruppels met alleen matrix worden geplaatst, delen zich actief rond de matrices, maar gaan niet in of uitbreiden over de bovenkant. Voor kwantificering van de perineurale invasie van de kankercellen worden beelden van de tests verdeeld in vier kwadranten via één verticale en één horizontale lijn.

Vervolgens worden een reeks punten geteld voor elke perineurale invasie-extensie die in elk kwadrant wordt waargenomen, waardoor vergelijking van de kankercelingroei langs de neurites tussen versch