Lichtwaaier fluorescentiemicroscopie van plantenwortels Kweken op het oppervlak van een gel
18 januari 2017
Dit protocol toont een methode voor de bereiding van plantenmonsters voor lichtbladmicroscopie. De opstelling wordt gekenmerkt door het verticaal monteren van de plant op het oppervlak van een gel en het laten groeien in gecontroleerde lichte omstandigheden. Dit maakt langdurige observatie van de ontwikkeling van plantenorganen mogelijk in gestandaardiseerde omstandigheden.
Het algemene doel van deze procedure is om langetermijnwaarnemingen van een plantenwortelsysteem te verwerven met behulp van lichtbladmicroscopie. Om dit te bereiken, is het essentieel om een zachte monstervoorbereidingsmethode te hebben, gecontroleerde groeiomstandigheden en een beeldvormingstechniek die de plantontwikkeling niet verandert, zoals lichtbladmicroscopie. Om te beginnen worden planten gekweekt op het oppervlak van een twee millimeter dunne gellaag.
Het gel met een Aribidopsis-zaailing wordt vervolgens uitgesneden, opgeschept en overgebracht naar de monsterstander van de microscoop. Binnen de microscoop groeit de plant in zijn natuurlijke rechtopstaande positie. De wortels groeien in een vloeibaar medium, terwijl de bladeren in de lucht blijven.
Een verlichtingssysteem verlicht alleen de bladeren. Het wateroppervlak is bedekt om de wortels in het donker te houden. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden, zoals het inbedden van de wortel in het gel, is dat we gewend zijn om planten op het oppervlak van een gel te kweken.
Daarom kunnen we het exactezelfbde kweekprotocol volgen als voorheen. En ten tweede staat de wortel in direct contact met het vloeibare medium, dat kan worden uitgewisseld voor medicamenteuze behandelingen, bijvoorbeeld. Giet 30 milliliter vers geautoclaveerd halfsterk MS-medium met 1,5 procent fytogel in een vierkante petrischaal om een laag van ongeveer 2 millimeter te creëren.
Zaai steriele zaden zij aan zij met minimaal één centimeter ruimte ertussen. Vervolgens wikkel je de plaat met een microporeus plakband. Kweek de plaat in je kweekincubator verticaal gedurende maximaal 10 dagen.
In dit experiment gebruiken we zes dagen oude planten om de ontwikkeling van zijwortels te observeren. We bieden een model voor 3D-printen van de monsterstander. We hebben verschillende materialen getest.
De transparante harsen waren het meest geschikt in termen van stijfheid en waterbestendigheid. Een gedetailleerde beschrijving van de afmetingen om een monsterstander van massief materiaal te bewerken, wordt beschreven in het manuscript. Snijd het gel rond de plant met een scalpel.
Scoop vervolgens het gelblok op waarop de plant groeit en breng het voorzichtig over naar de monsterstander. Smelt 1 procent aggros op 80 graden Celsius en koel het af tot 33 graden Celsius. Lijm het gelblok op de monsterstander en lijm de plant voorzichtig op het gel.
Gebruik een stereomicroscoop om de positie van de plant te verifiëren en zorg ervoor dat het gebied van belang niet door een gel is bedekt. Om te voorkomen dat de plant uitdroogt, schuif de monsterstander waar mogelijk op een pipettip van 1.000 microliter. Leg de houder op een pipetbox en bereid indien nodig meer monsters voor.
Onze microscoop is een klassieke open-spin zonder grote aanpassingen. We hebben een verlichtingssysteem geïmplementeerd voor het kweken van planten in de microscoop. Rode en blauwe LED's zijn in een ring gerangschikt.
Paren van LED's kunnen afzonderlijk worden in- en uitgeschakeld voor directionele verlichting. Het spectrum van het verlichtingssysteem komt overeen met dat in onze kweekkamers. Bijna al het licht dat van de LED's komt, wordt geblokkeerd door een emissiefilter voor GFP.
We konden geen strooilicht detecteren dat de camera bereikte. Daarom kan het licht aanblijven tijdens het beeldvormen. De lichtintensiteit kan worden aangepast, variërend van 30 tot 250 micro mol per meter vierkant per seconde.
Schroef of lijm de LED-ring op de onderkant van de open spin-stage-arm. Monteer het terug op de microscoop en sluit de draden aan. Monteer het profusiesysteem.
Verbind de buizen met de monsterkamer in een eenrichtingsopstelling. Stel de snelheid in op één milliliter per minuut. Voeg drie millimeter vierkanten van een steriele zwarte kunststoffolie toe en verdeel ze op het wateroppervlak.
Plaats het monster in de microscoop. Controleer of er geen plastic vellen aan de monsterstander kleven. Sluit de kamer met twee deksels van zwart aluminiumfolie.
Schakel het licht in en pas de lichtintensiteit aan. Schakel het kamerlicht uit en begin met opnemen. Deze methode maakt het mogelijk om wortelgroei gedurende meerdere uren tot dagen op te nemen, hier gepresenteerd door de groei van een zijwortel.
Afbeeldingen van een z-stack van een enkele tijdstip tonen goede optische sectie-eigenschappen. We hebben het hele proces van laterale wortelvorming in 3D vastgelegd, waardoor we de dynamica van dit proces kunnen bestuderen. Het bekijken van een enkele schijf van deze opname toont een goede resolutie, zelfs diep in de wortel.
Na het bekijken van deze video, zou u een duidelijk begrip moeten hebben van de plantmonstervoorbereidingsmethode voor lichtbladmicroscopie. Volgens dit protocol kunnen we nu intracellulaire eiwitlokalisatie of genexpressiepatronen bekijken tijdens organogenese, plantentropismen of plantaanpassing. Dit zal ons helpen om de ruimte-tijdelijke regulatie van plantenontwikkeling te begrijpen.
Overzicht
Dit protocol demonstreert een methode voor de preparatie van plantmonsters voor light-sheet microscopie, waardoor langetermijnobservatie van de ontwikkeling van plantorganen mogelijk is. De opstelling omvat het kweken van planten op een geloppervlak onder gecontroleerde omstandigheden, wat gedetailleerde beeldvorming mogelijk maakt zonder de plantengroei te beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Plantbiologie
- Microscopietechnieken
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Light-sheet microscopie biedt een niet-invasieve beeldvormingstechniek.
- Traditionele methoden kunnen de ontwikkeling van de plant beïnvloeden.
- Gecontroleerde omstandigheden zijn cruciaal voor nauwkeurige observaties.
- Arabidopsis-zaailingen worden vaak gebruikt voor dergelijke studies.
Doel van de studie
- Om langetermijnobservaties van plantwortelstelsels te verkrijgen.
- Om een milde methode voor monsterpreparatie te ontwikkelen.
- Om imagingtechnieken te gebruiken die de plantgroei niet verstoren.
Gebruikte methoden
- Planten worden gekweekt op een dunne laag gel.
- Het gelblok wordt overgebracht naar een objecthouder van de microscoop.
- Er is een verlichtingssysteem geïmplementeerd voor optimale groeicondities.
- Beeldvorming legt de dynamiek van de wortelgroei in de loop van de tijd vast.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle 3D-beeldvorming van de vorming van zijwortels.
- Goede optische eigenschappen waargenomen in z-stapelbeelden.
- De methode maakt onderzoek naar intracellulaire processen mogelijk.
- Faciliteert het begrip van spatiotemporele regulatie in planten.
Conclusies
- Deze methode verbetert de mogelijkheid om de plantontwikkeling waar te nemen.
- Het ondersteunt onderzoek naar genexpressie en eiwitlokalisatie.
- Biedt een gestandaardiseerde aanpak voor toekomstige studies.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor het management
Dit protocol maakt langetermijn-beeldvorming met een hoge resolutie van plantenwortelsystemen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk, wat mechanistische studies naar organogenese en ontwikkelingsdynamiek ondersteunt. Door natuurlijke groei te behouden terwijl uitwisseling van het vloeibare medium mogelijk is, faciliteert het de screening van verbindingen en doelwitvalidatie in plantgebaseerde modelsystemen. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekkingen door cellulaire fenotypes te koppelen aan responsen op weefselniveau in een reproduceerbaar, schaalbaar formaat.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe observatie van cellulaire dynamiek tijdens de organogenese.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door visualisatie van target-engagement in intacte, ontwikkelende weefsels.
- Voorspellende waarde: Verbindt moleculaire perturbaties aan fenotypische uitkomsten in een fysiologisch relevante context.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream evaluatie van verbindingen met de mogelijkheid tot uitwisseling van vloeibaar medium.
- Kwantitatieve outputs: Genereert 3D temporele datasets die nauwkeurige meting van structurele en functionele veranderingen mogelijk maken.
- Hergebruik van het platform: Het gestandaardiseerde ontwerp van de monsterhouder maakt schaalbaarheid over meerdere experimentele campagnes mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Biedt een ziekte-relevant systeem voor het bestuderen van worteltropismen en adaptieve reacties op omgevingsstimuli.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen beeldvorming in de ontdekkingsfase en preklinische validatie door middel van consistente, niet-invasieve read-outs.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit bij target-validatie door moleculaire veranderingen te correleren met structurele ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, waardoor iteratieve verfijning van biologische targets mogelijk wordt op basis van dynamische fenotypische gegevens.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door cellulaire processen in real-time te visualiseren binnen de natuurlijke weefselarchitectuur.
- Screening: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk via gestandaardiseerde montage en perfusie met een vloeibaar medium.
- Analytica: Levert ruimtelijk-temporele read-outs met een hoge resolutie die vergelijkende analyse tussen verschillende condities faciliteren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege mechanistische inzichten met preklinische modellen via geconserveerde ontwikkelingsprocessen.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform dat aanpasbaar is aan diverse plantensoorten en experimentele variabelen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: VerhoogtHet voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde montage op basis van gels en gecontroleerde belichting.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door directe visualisatie van biologische reacties op perturbaties te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk via kwantitatieve, longitudinale fenotypische gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in plantbiologie, microscopie en microfluïdische monsterverwerking.
- Afhankelijk van een light-sheet microscopie-infrastructuur met aanpasbare LED-verlichting en omgevingscontrole.
- Noodzaakt standaardisatie van gelbereiding, monstertransfers en illuminatieprotocollen tussen teams.
- Omvat aanpassingen voor verschillende plantensoorten, groeimedia en oplosbaarheidsprofielen van verbindingen.
- Beperkt door de noodzaak van optische transparantie en compatibiliteit tussen gelmaterialen en beeldvormingsgolflengten.
