Name: Afleiding van leptomeningen Explantatie culturen van postmortaal Human Brain Donors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Leer een explantcultuurtechniek voor het afleiden van fibronectine-positieve meningeale fibroblasten uit postmortaal menselijk hersenweefsel van patiënten met de ziekte van Parkinson.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De ontwikkeling van dit protocol werd gefinancierd door particuliere donaties gericht aan het Parkinson's Institute Brain Donation Program.

De registratie hersenen donatie bevat documentatie door de registrant van hun intentie om te doneren. De autopsie toestemming voor tissue ophalen wordt geleverd door de nabestaanden als wettelijk is toegestaan. Onderzoeken met behulp van verzamelde autopsie exemplaren worden beoordeeld door de Institutional Review Board (IRB) om de naleving van Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) regelgeving. OPMERKING: leptomeningen monsters worden verzameld door de hersenen dissector of neuropathologist tijdens hersenen dissectie en opgeslagen in 50 ml conische buisjes met 25-30 ml meninges groeimedia. Het monster wordt bewaard bij 4 ° C totdat monstervoorbereiding. De verwerking moet zo snel worden uitgevoerd mogelijk als de levensvatbaarheid van de cellen neemt af met de tijd post mortem. 1. Set-up voor het starten van de leptomeningen Dissection OPMERKING: Stappen 1,1-1,3 moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. <ol><li> Bereid meninges groeimedia combineert 375 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, 100 ml foetaal runderserum, 5 ml 10 mM niet-essentiële aminozuren, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamine, 5 ml 100 mM natriumpyruvaat, 5 mL 10.000 U / ml penicilline / streptomycine en 5 ml 250 ug / ml amfotericine B in 500 ml filtereenheid. Filter en meng. Gebruik media tot vier weken. </li><li> Plaats alle materialen in de bioveiligheid kast voordat de dissectie: 4x petrischaaltjes, 2x 6-well platen, 2x scalpels, 15-20 gesteriliseerde 15-mm dekglaasjes, fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), serologische pipetten, opzuigen pipetten. </li><li> Voeg 1 ml steriel 0,1% geautoclaveerde gelatine-oplossing in elk putje van een 6-wells plaat. Zet de plaat opzij voor 30-60 min. Bereid 2x 6-well platen. </li></ol> 2. Voorbereiding van de leptomeningen Sample OPMERKING: Stappen 2,1-2,3 moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. <ol><li> Voeg ongeveer 10 ml PBS omeen steriele 10-cm weefselkweek schaal en leg de hersenvliezen monster in de schaal. Met behulp van een tang, voorzichtig te wassen leptomeningen met PBS om bloed te verwijderen. </li><li> Breng de hersenvliezen in een nieuwe 10-cm weefselkweekplaat met 10 ml vers PBS en verder wassen. Indien nodig herhalen zoveel bloed te verwijderen mogelijk. </li><li> Met behulp van twee scalpels, leptomeningen weefsel gesneden in een ongeveer 6 cm x 6 cm groot stuk. </li><li> Plaats het deksel op een cultuur schotel en transfer naar een dissectie microscoop in een horizontale laminaire stroming kap. </li></ol> 3. Dissectie van leptomeningen Tissue OPMERKING: Stappen 3,1-3,3 worden uitgevoerd in een horizontale laminaire stroming kap met behulp van een stereomicroscoop. <ol><li> Verwijder de bloedvaten uit een gebied op de leptomeningen stuk (stap 2.3) groot genoeg is om ten minste maart 20-25 mm x 3 mm stukken te creëren. Houd de leptomeningen op zijn plaats met een scalpel en met de andere, gebruik dan een zachte en ondiepe schrapen motie om de schepen te scheiden. </li><li> Knip kleine vierkantjes van weefsel uit de voorbereide regio. Snij in een stapsgewijs proces door eerst het maken van grotere stukken en dan snijden die in kleinere secties. </li><li> Gebruik een scalpel om het weefsel op zijn plaats en een andere scalpel houden om het weefsel te snijden met een schommelende beweging. Door de consistentie van het weefsel, is het moeilijk om de scalpels tegen elkaar schuiven. Dit zal alleen het weefsel scheuren en resulteert in een rafelige randen. </li><li> Ga door het snijden van de stukken in de helft tot er ongeveer 20-25 3 mm x 3 mm stuks. </li></ol> 4. Overdracht van ontleed Meninges Pieces op Tissue Culture Plates OPMERKING: Stap 4 moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. <ol><li> Aspireren gelatine van 6-well plaat (uit stap 1.3). Voeg 1 ml meninges kweekmedium aan elke well. Met behulp van een steriel pincet, plaatst 3-4 biopsie stukken in elk putje. </li></ol> 5. Plaatsing van Cover bevestiging over Meninges Pieces OPMERKING: Stappen 5,1-5,2 worden uitgevoerd in een horizontale laminaire stroming kap met behulp van een stereomicroscoop. <ol><li> Bedek de stukken met 1-2 steriele 15-mm ronde dekglaasjes per putje. </li><li> Druk stevig met een tang te zorgen voor de stukken zijn de bodem van het schaaltje raken. Dit maakt bevestiging van weefsel stukjes naar de bodem van de put. </li><li> Plaats de 6-well plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li></ol> 6. Cell Culture Onderhoud OPMERKING: Stappen 6,1-6,3 moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. Behandel cultuur gerechten met zorg als dekglaasjes niet mag bewegen en verjagen de hersenvliezen stukken. <ol><li> Na 2 dagen in kweek, voeg nog eens 1 ml vers meninges groeimedium aan elk putje. </li><li> Op dag 7, voorzichtig zuigen de media en voeg 2 ml vers medium aan elk putje. </li><li> Na Dag 9, blijven groeimedia elke wijzigingde andere dag tot cultuur wordt confluent. </li></ol> 7. Passage OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. Zodra meningeale fibroblasten uit de meningeale weefselstukken gemigreerd en beginnen te groeien naar de randen van het kweekvat Vouw meningeale fibroblasten in grotere kweekschaal. <ol><li> Voordat u begint met de passage, de vacht van de cultuur schotel met 1% gelatine gedurende 15-30 min. </li><li> Aspireren media van 6-well gerecht en was cellen met 2 ml PBS. </li><li> Voeg 1 ml trypsine / EDTA aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. Het is niet nodig de dekglaasjes of meningeale weefsel voor deze stap verwijderd. </li><li> Wanneer de cellen zijn afgerond en beginnen te los te maken, voeg 2 ml van de cultuur media. </li><li> Pipet cellen omhoog en omlaag om volledig te verstoren alle klonten en breng de cel oplossing voor grotere cultuur schotel. </li><li> Met een verhouding van 1: 3 tot 1: 4 cellen combineren van drie 6 putjes inéén T75 cultuur schotel. </li><li> Zodra meningeale fibroblasten cellen confluent in T75 cultuur kolven, trypsinize de cellen en cryopreserve in cryopreservatie media op 1x10 6 cellen / ml per flacon. Een T75 kolf met samenvloeiing meningeale fibroblasten bevat ongeveer 5-7 miljoen cellen. </li></ol> 8. Analyse van de Meningeale fibroblasten door Immunokleuring LET OP: Voor het starten van de procedure, de voorbereiding van 4% paraformaldehyde-oplossing, 5% normaal geit serum in PBS (blokkerende buffer), 0,3% Triton X-100 in PBS (permeabilisatie buffer), primaire en secundaire antilichaam-oplossingen, en 1 ug / ml Hoechst 33.342 verdund in PBS van 10 mg / ml voorraad. <ol><li> Seed 15.000 tot 30.000 meningeale fibroblasten in 8-well kamer dia bekleed met 0,1% gelatine. </li><li> Na 24 uur bij de cellen gevoegd, vast cellen in 100 pi 4% paraformaldehyde per putje gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de putjes 3 keer met 1x PBS. </li><li> Permeabilize de cellen met 150 pl 0,3% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de putjes 3 keer met 1x PBS. </li><li> Voeg 200 pl blokkeeroplossing (PBS + 5% normaal geit serum) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Zuig de blokkerende oplossing en voeg 150 ul van gewenste primaire antilichamen verdund in blokkeeroplossing. Voor double-kleuring, voor te bereiden werken verdunningen van primaire antilichamen in afzonderlijke centrifugebuizen op ijs als volgt: <ol><li> Bereid 1: 300 verdunning van anti-fibronectine + 1: 200 verdunning van anti-nestine in blokkeeroplossing. Bereid 1: 250 verdunning van anti-SERPINH1 + 1: 1000 verdunning van anti-TUJ1 in blokkeeroplossing. Bereid 1: 250 verdunning van anti-SERPINH1 + 1: 100 verdunning van anti-SOX2 in blokkeeroplossing </li></ol></li><li> Incubeer bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was de putjes 3 keer met 1x PBS. </li><li> Bereid een werkende 1: 400 verdunning van fluorescent gelabelde secundaire antilichamen geit anti-konijn (groen; Ex / Em 2 </sup&gt; 495/519 nm) en geit anti-muis (rood; Ex / Em 2 590/617 nm) in blokkeeroplossing en voeg 100 ul aan elk putje. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. Was daarna wells eenmaal met 1x PBS. </li><li> Voeg 100 ul van 1 ug / ml Hoechst 33342 (blauw; Ex / Em 2 358/461 nm) oplossing aan elk putje en incubeer in het donker gedurende 3 min. Was de putjes 3 keer met 1x PBS, waardoor in de finale 1x PBS wassen in de put, en hebben betrekking op de dia met aluminiumfolie. </li><li> Analyseer cellen onder fluorescentiemicroscoop. </li></ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stem%2Fprogenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383(2015).</li>
<li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li>
<li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+autopsy+donor-derived+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells.</a> Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li>
<li>Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+autopsy-derived+fibroblasts+as+a+tool+to+study+systemic+alterations+in+human+neurodegenerative+disorders+such+as+Alzheimer%27s+disease--methodological+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations.</a> J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).</li>
<li>Bliss, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+postmortem+human+dura+mater+and+scalp+for+deriving+human+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures.</a> PLoS One. 7 (9), e45282(2012).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).</li>
<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson%27s+disease%3A+a+clinico-pathological+study+of+100+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li>
<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een eenvoudig en robuust protocol om een ​​meningeale fibroblast cultuur afkomstig zijn van menselijke postmortem leptomeningen verzameld in combinatie met een brein donatie. Er zijn maar weinig beschrijvingen van protocollen bij celculturen afkomstig van postmortale menselijk materiaal. Twee studies beschrijven huid afgeleide fibroblast cultures 7, 8, 9, een studie beschrijft dura monsters <sup class="x...

Meninges bestaan ​​uit drie vliezen die de hersenen te beschermen: dura mater, arachnoid en pia mater. Meer recent is erkend dat hersenvliezen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van de hersenen en de hersenen homeostase 1 spelen. Hersenvliezen afstammend van mesenchymale en neurale kam afgeleide cellen en interessant, is aangetoond dat stamcellen die in meninges kan leiden tot neuronen in vitro en in vivo na transplantatie 2, 3, 4 geven. Meninges culturen zijn ook met succes gebruikt als voedsterlagen mocht bezitten stromale cellen afgeleide inducerende activiteit differentiatie van embryonale stamcellen tot dopaminerge neuronen 5. Bovendien leptomeningen hebben het potentieel om direct differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten onder ischemische condities 6. Voor dit protocol worden menselijke postmortem hersenvliezen monsters van de arachnoid en pia mater, collectief genaamd de leptomeningen, en worden ingekocht als onderdeel van een menselijk brein donatie voor onderzoeksdoeleinden. Dissectie van de hersenen wordt uitgevoerd binnen 24 uur dood en de leptomeningen monster wordt in koud kweekmedium voor verdere verwerking in de volgende 6-8 uur zoals hier is weergegeven in dit protocol. Dit protocol beschrijft de ontleding en de bereiding van humane hersenvliezen monsters voor de ontwikkeling van patiënt leptomeningen primaire celkweek. Het weefsel wordt gesneden in 25-30 stukjes van ongeveer 3 mm x 3 mm vierkant. Drie stukken zijn geplaatst in elk 6-well-gelatine gecoate goed en hield neer met ronde glazen dekglaasjes. De hersenvliezen dissectie duurt ongeveer 25-35 minuten. De uitdaging met deze cultuur steriliteit als de aanschaf hersenen, transport en dissectie algemeen niet onder steriele omstandigheden uitgevoerd. Therefore, is het belangrijk om de kweekmedia aangevuld met een cocktail van penicilline, streptomycine en amfotericine B meerdelige putjes afzonderlijk cultuur weefselstukken. Uitvloeisel van meningeale fibroblasten gebeurt meestal binnen de eerste week. Medium wordt elke twee tot drie dagen vervangen totdat de cellen confluent en de cellen enzymatisch gepasseerd. De meningeale fibroblasten gecryopreserveerd 1 miljoen cellen per ml / injectieflacon cryopreservatie media. Met dit protocol, kan 20-30000000 meningeale fibroblasten afgeleid worden in 6-8 weken voor cryopreservatie. Downstream-toepassingen van deze meningeale fibroblasten zijn primaire kweken voor de ziekte van onderzoek, direct neuronale differentiatie of afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen van de leptomeningen voor het begrip van de mechanismen en vaatziekten en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

<table><tbody><tr><td>Corning Petri schotels</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 6-well plaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>15-mm dekglasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels, steriele mesjes, nr. 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Geboogde precisietang met punt</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL filter unit</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>Combineer mediacomponenten en filter.</td></tr><tr><td>Nunc Cell Culture Treated Flasks met filterdoppen, T175 cm2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Kweekmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvaat (100 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B (gele oplossing/250 &micro;g/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Fibronectinekleuring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-wel kamer slides&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% Glycerol&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>100% normaal geitenserum&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronectine antilichaam [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>1:300 verdunning in blokkeringsoplossing</td></tr><tr><td>Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>1:250 verdunning in blokkeringsoplossing</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>1:100 verdunning in blokkeringsoplossing</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 verdunning in blokkeringsoplossing</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1:1.000 verdunning in blokkeringsoplossing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-konijn</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>1:400 verdunning in blokkeringsoplossing; (groen kanaal; Ex/Em2 495/519 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-muis</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>1:400 verdunning in blokkeringsoplossing; (rood kanaal; Ex/Em2 590/617 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 kleurstof</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>verdun tot een eindconcentratie van 1,0 &mu;g/mL; (blauw kanaal; Ex/Em2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">Leveranciers zijn suggesties, vergelijkbare producten van alternatieve leveranciers kunnen ook worden gebruikt.</td></tr></tbody></table>

afleiding van leptomeningen explantatie culturen van postmortaal human brain donors

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Hoewel grote vooruitgang is gemaakt in de klinische karakterisering van de ziekte van Parkinson, een aantal studies rapporteren dat de diagnose van de ziekte van Parkinson niet pathologisch bevestigd tot 25% van de ziekte klinisch gediagnosticeerde Parkinson. Daarom weefsel vanuit klinisch gediagnosticeerde patiënten met de ziekte van Parkinson kunnen een hoog percentage verkeerde diagnose hebben; vandaar in vitro studies uit dergelijke weefsels parkinsondementie onderzoeken als preklinisch model nutteloos kan worden. Door het verzamelen postmortem menselijk leptomeningen met een bevestigde neuropathologische diagnose van de ziekte van Parkinson en gekenmerkt door nigrostriatale celverlies en intracellulaire eiwit inclusies Lewy lichaampjes, kan men er zeker van zijn dat klinisch waargenomen parkinsonisme niet wordt veroorzaakt door een onderliggende ziekteproces (bijvoorbeeld tumoren, arteriosclerose). Dit protocol presents de dissectie en de voorbereiding van postmortale menselijke leptomeningen voor het afleiden van een meningeale fibroblast cultuur. Deze procedure is robuust en heeft een hoog slagingspercentage. De uitdaging van de kweek steriliteit als het brein opdrachten algemeen niet onder steriele omstandigheden wordt uitgevoerd. Daarom is het belangrijk om de kweekmedia aangevuld met een cocktail van penicilline, streptomycine en amfotericine B. De afleiding van meningeale fibroblasten autopsie bevestigde gevallen van de ziekte van Parkinson als basis voor een in vitro model van de ziekte van Parkinson. Meningeale fibroblasten verschijnen 3-9 dagen na de bereiding van de monsters en ongeveer 20-30 miljoen cellen kunnen worden gecryopreserveerd in 6-8 weken. De hersenvlies fibroblast cultuur is homogeen en de cellen brengen fibronectine, een veel gebruikte marker om hersenvliezen te identificeren.

Wanneer de verwerking leptomeningen protocol succesvol is geweest, is uitgroei meningeale fibroblasten eerst waargenomen 3-9 dagen na sectie, hoewel dit kan afhankelijk van de duur van post-mortem interval voor de hersenen. Figuur 1 toont hersenvlies fibroblast culturen van vier verschillende donoren. Figuur 1A toont een leptomeningen stuk naar beneden door een glazen afdekplaat slip (donkere diagonale lijn) en fibroblast uitgroei rond het weefsel vier d...

De leptomeningen explantaatkweek protocol uit menselijke postmortem hersenen is een technisch robuust en eenvoudige manier om fibronectine-positieve meningeale fibroblasten ontlenen binnen 6-8 weken en cryopreserve, circa 20-30 miljoen cellen.

Afleiding van leptomeningen Explantatie culturen van postmortaal Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Ik ben Birgitt Schule, de Directeur van het Brain Donation Program bij het Parkinson's Institute and Clinical Center. In deze video beschrijven we een techniek voor een explant celcultuur en de duur van primaire fibroblasten uit leptomeninges van postmortem menselijk brein van patiënten met de ziekte van Parkinson. Deze fibroblasten kunnen voor verschillende toepassingen worden gebruikt, inclusief cel-gebaseerde assays.Dit is belangrijk, omdat we cellijnen kunnen bestuderen van autopsie-bewezen gevallen van sporadische ziekte van Parkinson met Lewy-body pathologie. Begin door alle benodigde materialen in de weefselkweek-kap te plaatsen. Alle objecten die de kap binnenkomen moeten worden besproeid met 70% ethanol en worden afgeveegd.De eerste stap is om de meninges van de buis naar de snijschotel over te brengen. Begin door ongeveer 10 milliliter fosfaat-gebufferd zout water in een steriele 10-centimeter snijschotel te gieten. Hier zie je de meninges.Gebruik steriele pincetten om de meninges voorzichtig over te brengen naar de snijschotel. Voer deze stap langzaam uit om te voorkomen dat er gescheurd wordt. De volgende stap is om de meninges in PBS te wassen om zoveel mogelijk bloed te verwijderen.Als uw monster te bloederig is, kunt u overwegen het naar een andere snijschotel over te brengen. Voeg nog eens 10 milliliter PBS toe aan een nieuwe 10-centimeter schotel. Herhaal deze wassing om het bloed uit de meninges te blijven verwijderen.Ten slotte breng je de meninges over naar een nieuwe 10-centimeter schotel met PBS. Wanneer je klaar bent, dek de schotel af en breng het over naar de dissectiescoop in de laminaire stromingskast. De volgende stap is om de meninges in kleinere stukken te blijven snijden.Gebruik twee steriele scalpels om de bloedvaten voorzichtig van de meninges te scheiden met een ondiepe schraapbeweging. Bereid een gebied voor dat groot genoeg is om ongeveer 18 stukken van 3 millimeter bij 3 millimeter te snijden, zoals in dit beeld te zien is. Neem dan het scalpel en snij met een wiegende beweging het voorbereide gebied in stukken van 3 millimeter bij 3 millimeter.Het is gemakkelijker om dit in een stapsgewijs proces te doen door eerst de meninges in grotere stukken te snijden en vervolgens die stukken in kleinere secties te snijden. Dek de snijschotel af en breng het terug naar de weefselkweek-kap. Bereid vervolgens de meninges voor om over te brengen naar een zes-putjes weefselkweekplaat die is voorbehandeld met 1 milliliter van 0,1 procent gelatine gedurende 30 tot 60 minuten.Voeg één milliliter meningesmedium toe aan elk putje. Breng vervolgens met steriele pincetten drie tot vier meningesstukken over naar het midden van elk putje. De cellen die op deze plaat groeien, zullen een passage nul zijn.De volgende stap gebruikt dekstukjes om ervoor te zorgen dat de meningesstukken stationair blijven en in contact blijven met de kweekschotel. Plaats een steriele 15-millimeter ronde dekschotel over de meningesstukken. Indien nodig, herpositioneer de meningesstukken met een dekschotel.Druk vervolgens met de pincetten stevig op het dekschoteltje om ervoor te zorgen dat de stukken de plaat raken. Dit beeld toont de meningesstukken die met een dekschoteltje op hun plaats worden gehouden. Plaats het deksel over de zes-putjesplaat en breng de plaat voorzichtig over naar een incubatiekast ingesteld op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Na twee dagen in cultuur, voeg een extra milliliter verse meningesmedium toe aan elk putje. Na zeven dagen, aspireer het medium. Vul vervolgens elk putje bij met 2 milliliter vers medium.Na dag zeven, blijf de putjes elke tweede dag aanvullen met 2 milliliter vers medium. Dit beeld toont de eerste dag van de meningesstukken en cultuur onder een omgekeerde microscoop. Na ongeveer zes tot negen dagen kan cellulaire hechting in de eerste uitgroei worden waargenomen.Tussen 15 tot 19 dagen neemt het aantal cellen toe en wordt de groei dichter. Meningeale fibroblasten worden gekenmerkt door de expressie van fibronectine. Deze afbeeldingen tonen gekweekte meningeale cellen die zijn gekleurd en positief zijn voor fibronectine.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe men leptomeninges explant culturen kan verkrijgen uit postmortem menselijke hersendonoren. Deze techniek biedt een eenvoudige en robuuste manier om meningeale fibroblasten binnen drie tot zes weken te verkrijgen, en maakt het mogelijk om 15 tot 20 miljoen cellen te banken bij een laag passagenummer.

derivation-leptomeninges-explant-cultures-from-postmortem-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC's op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

This video demonstrates a technique for preparing free-floating slice cultures from the adult human brain. Thin slices are generated from a brain section using a vibratome. These slices are then suspended in a culture medium supplemented with growth factors to maintain tissue viability.

Preparing Free-Floating Slice Cultures from an Adult Human Brain

This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

De ventriculaire cerebrospinale vloeistof (CSF) baadt de neuro-epitheliale en cerebrale corticale progenitorcellen tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen in het embryo. Hier beschrijven we de methode ontwikkeld om ventriculaire CSF isoleren van knaagdieren embryo's van verschillende leeftijden om zijn biologische functie onderzoeken. Daarnaast tonen wij onze cerebrale corticale explantatie dissectie en cultuur techniek die voor explantatie groei mogelijk maakt met een minimale...

Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo&#39;s voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten

Dit protocol beschrijft een methode om individuele hersenverouderingstrajecten te volgen via een hersendonatieprogramma en de juiste karakterisering van hersenen. Hersendonoren zijn betrokken bij een langdurige longitudinale studie met inbegrip van seriële multi-dimensionale beoordelingen. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de verwerking van de hersenen en een nauwkeurige diagnostische methodologie.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol voor het verzamelen, verwerken en karakteriseren van veroudering hersenen

We beschrijven een intracisternalinjectie die een naald gebruikt die aan de punt is gebogen en die kan worden gestabiliseerd aan de schedel, waardoor het risico op schade aan de onderliggende parenchyma wordt geëlimineerd. De aanpak kan worden gebruikt voor genetische lot mapping en manipulaties van leptomeningealcellen en voor het bijhouden van cerebrospinale vloeistof beweging.

Inductie van Leptomeningeal Cellen Wijziging Via Intracisternal Injectie

Dit artikel presenteert twee geoptimaliseerde protocollen voor het onderzoeken van residente en perifeer afgeleide immuuncellen in het centrale zenuwstelsel, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen. Elk van deze protocollen helpt bij het vaststellen van de functie en samenstelling van de cellen die deze compartimenten bezetten onder steady state en ontstekingsomstandigheden.

Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC's), een recent geïdentificeerd intracraniaal celtype, hebben slecht begrepen functies. Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het oogsten van LLC's van muizen en het opzetten van in vitro primaire culturen. Dit protocol is ontworpen om onderzoekers in staat te stellen zich te verdiepen in de cellulaire functies en mogelijke klinische implicaties van LLC's.

Oogst en primaire kweek van leptomeningeale lymfatische endotheelcellen

Dit artikel beschrijft een protocol voor de voortplanting van cerebrale spinale wervelvocht-circulerende tumorcellen (CSF-CTC's) verzameld van patiënten met melanoom-geassocieerde leptomeningeale ziekte (M-LMD) om preklinische modellen te ontwikkelen om M-LMD te bestuderen.

Ex Vivo Kweek van circulerende tumorcellen in het cerebrale ruggenmergvocht van melanoompatiënten om melanoom-geassocieerde leptomeningeale ziekte te bestuderen

Leer een explantcultuurtechniek voor het afleiden van fibronectine-positieve meningeale fibroblasten uit postmortaal menselijk hersenweefsel van patiënten met de ziekte van Parkinson.

Afleiding van leptomeningen Explantatie culturen van postmortaal Human Brain Donors

Meer video's verkennen