teelt van Caenorhabditis elegans In drie dimensies in het Laboratorium

Het algemene doel van deze procedure is om een driedimensionaal kweeksysteem voor nematoden te produceren dat natuurlijke omstandigheden beter kan simuleren. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden op het gebied van de ontwikkeling, fysiologie en het gedrag van C elegans. We hadden het idee voor deze methode voor het eerst toen we natuurlijk nematodengedrag in rottend fruit bestudeerden, wat een 3D-omgeving is.

Deze techniek heeft een voordeel ten opzichte van standaard tweedimensionale kweektechnieken omdat nematoden in de natuur in 3D-habitats verblijven. Hoewel deze methode is ontwikkeld voor de kweek van C elegans, kan deze ook op andere nematoden worden toegepast. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Tong Young Lee, een afgestudeerde student in mijn laboratorium.

Om deze procedure te beginnen, steriliseert Otto Clave de bereide oplossingen gedurende 15 minuten bij 121 graden Celsius. Bereid vervolgens 50 milliliter van de steriele cholesteroloplossing met 5 milligram per milliliter. Voeg in een 50 milliliter conische buis 0,25 gram cholesterol en 50 milliliter 99,99% ethanol toe en meng goed.

Steriliseer vervolgens de cholesteroloplossing met behulp van een 50 milliliter spuit met een 0,45 geventileerde spuitfilter en verwijder eventueel onontwikkeld cholesterol. Injecteer vervolgens 10 milliliter lysogeen bouillon met bacteriën. Kweek de bacteriën bij 37 graden Celsius in een schudkuvende incubator gedurende een nacht.

Bereid in aanloop naar een seriële verdunning negen milliliter van de natriumchlorideoplossing voor in zeven steriele 15 milliliter conische buizen. Maak een tent van de zevende verdunningsvoud van Opi 50 Strain E Coli. Vervolgens haalt u één milliliter van de bacteriecultuur of verdunde bacteriecultuur uit en plaatst deze in een nieuwe buis met negen milliliter natriumchlorideoplossing.

En vortex de mengsel goed. Na het bereiden van de bacteriecultuur, voegt u 0,6 gram natriumchloride, één gram gegranuleerde auger en 0,5 gram pepton toe in een 500 milliliter fles. Plaats een magnetische roerstaaf in de fles.

Voeg vervolgens 195 milliliter gedistilleerd water toe en dek de fles af met aluminiumfolie. Plaats vervolgens de hete Otto Claved fles op een roerplaat, roer gedurende ten minste twee uur op een matige snelheid tot het 40 graden Celsius bereikt.

Alternatief kan de fles worden afgekoeld tot 40 graden Celsius door deze gedurende 15 minuten in een waterbad van 40 graden Celsius te plaatsen voordat deze op een roerplaat wordt geplaatst. Zorg ervoor dat het voldoende is afgekoeld, want anders kan het auger troebel worden, maar een te lage temperatuur kan leiden tot voortijdige verharding van het auger.

Wanneer de temperatuur van het augermedium 40 graden Celsius bereikt, voegt u calciumchloride, cholesteroloplossing, magnesiumsulfaat en kaliumfosfaatbuffer toe en blijft u de oplossing roeren. Voor NGT-3D levensduurtest, voegt u 80 microliter van 150 millimeter FUDR toe aan het medium om een eindconcentratie van 120 micromolair te verkrijgen. Vervolgens verwijdert u zes milliliter augermedium in een steriele conische buis en bewaart u deze warm in een incubator.

Dit medium wordt gebruikt voor de bacterievrije bovenste laag. Voeg vervolgens zes milliliter van de verdunde bacteriecultuur toe aan de fles direct op een gesteriliseerde werkbank. Voor NGT-3D, giet 6,5 milliliter medium in de acht milliliter doorzichtige kunststof testbuizen om een bacterie-augerlaag te vormen.

En doseer zorgvuldig 200 microliter van het bacterievrije medium op de top van het semi-harde 3D-medium om een dunne bacterievrije laag bovenop te maken. Sluit vervolgens de deksel van de kamer goed. Voor NGB-3D, giet 65 milliliter medium in een 25 centimeter vierkante doorzichtige kunststof celkweekfles.

Plaats vervolgens de kamer verticaal op kamertemperatuur gedurende één week om bacteriekolonies te laten groeien tot een aanzienlijke grootte van minimaal één millimeter diameter. In deze procedure, pakt u een L vier fase worm en brengt u deze over naar een bacterievrije NGM-plaat. Laat vervolgens de worm een paar minuten vrij rondlopen om bacteriën van zijn lichaam te verwijderen.

En herhaal de procedure nog twee keer. Plaats vervolgens de schone worm voorzichtig op het oppervlak van het 3D-medium. De worm zou eigenlijk de auger in de 3D-augermatrix moeten zijn gegaan.

Sluit vervolgens het deksel losjes om gedurende 96 uur bij 20 graden Celsius te incuberen. Na vier dagen, sluit u het deksel goed en plaatst u de NGT-3D kweekkamer in een waterbad van 88 graden Celsius om de auger te smelten. Gebruik een glazen pipet om het gesmolten medium over te brengen naar een negen centimeter plastic petrischaal.

Nadat u, met behulp van een transmissie stereo dissecting microscoop, het aantal wormen in de L3, L4 en volwassen stadia hebt geteld. Zoals hier getoond, is de constructie van NGT-3D een eenvoudig en rechtlijnig protocol dat resulteert in een met auger gevulde testbuis met kleine bacteriekolonies die door de auger zijn verdeeld. Om te bevestigen of C elegans in NGT-3D kan reduceren en normaal kan groeien, worden vruchtbaarheid en larf ontwikkeling in 3D vergeleken met de standaard 2D NGM-platen.

In de relatieve broedgrootte test, reproduceerden volwassen C elegans hermafrodiets in NGT-3D net zo goed als hermafrodiets in de standaard 2D MGM-platen wanneer er genoeg bacteriekolonies zijn met minimaal 60 kolonies. Bovendien, de ontwikkeling van larven in NGT-3D gaat ook normaal door wanneer er genoeg bacteriekolonies zijn met de meerderheid van de wormen in de volwassen toestand na 96 uur. Echter, als bacteriekolonies schaars zijn in de 3D-matrix, worden zowel de relatieve broedgrootte als de larf ontwikkeling negatief beïnvloed.

Hier is een overlevingscurve van het wilde type C elegans in NGT-3D of NGM-platen. Als deze techniek eenmaal onder de knie is,