Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters
5 januari 2017
Er wordt een methode voorgesteld voor het analyseren van de DNA-integriteit in de celvrije supernatantfractie van urinemonsters. De methode is geschikt voor vroege detectie van urologische maligniteiten en heeft bewezen nauwkeurig te zijn voor de vroege diagnose van blaaskanker.
Het algemene doel van deze methode is om de integriteit van urine cel-vrij DNA te beoordelen bij specifieke oncogensequenties. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van urologische kanker, zoals vroege niet-invasieve diagnose van blaas- en prostaatkanker. Het grote voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk te doen en te analyseren is.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van urologische maligniteiten, omdat ze normaal gesproken cellen en vrije nucleïnezuren in de urine afgeven. Hoewel deze methode inzicht kan geven in urinemonsters, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals serum of plasma. Over het algemeen zouden mensen die nieuw zijn met deze methode, problemen ondervinden omdat de concentratie van urine cel-vrij DNA vaak laag is.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we probeerden een eenvoudige methode te vinden voor niet-invasieve vroege detectie van blaaskanker. Om de procedure te starten, moet u een schone vangst van 50 milliliter eerste ochtendurine nemen die gedurende maximaal drie uur op vier graden Celsius is bewaard. Draai het monster twee keer om en verdeel het monster vervolgens in twee 50 milliliter kegelcentrifugebuizen.
Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 850 keer G op vier graden Celsius. Transfer vervolgens voor elke buis 10 milliliter van het bovenste deel van de supernatant naar twee vijf milliliter buizen, waarbij minimaal twee milliliter supernatant boven de pellet wordt achtergelaten. Gooi de pellets weg en bewaar de supernatant op min 80 graden Celsius.
Herhaal dit proces voor aanvullende urinemonsters indien nodig. Om met DNA-zuivering te beginnen, ontdooi voor elk monster een aliquot van urinesupernatant. Vortex het ontdooide monster en draai de buis twee keer om.
Plaats één milliliter van het monster in een vijf milliliter buis en bewaar de rest op min 80 graden Celsius. Bereid een DNA-zuiveringskit voor urinmonsters voor volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 100 microliter proteïnase K en één milliliter lysisbuffer toe aan het monster en meng goed met een pipette.
Incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 56 graden Celsius. Tijdens de incubatie, bereid de spoelbuffers in een spinkolom. Na incubatie, laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur en voeg vervolgens één milliliter absolute ethanol toe en meng goed door te pipetteren.
Breng 650 microliter van het monster over naar de kolom. Centrifugeer gedurende één minuut bij 6000 keer G. Vervang de opvangbuis en herhaal dit proces totdat al het monster op de kolom is geladen.
Voeg vervolgens 500 microliter van de eerste spoelbuffer toe en centrifugeer de kolom gedurende één minuut bij 6000 keer G. Vervang de opvangbuis, voeg 500 microliter van de tweede spoelbuffer toe en centrifugeer de kolom gedurende drie minuten op maximale snelheid. Plaats de kolom in een schone opvangbuis en centrifugeer gedurende nog eens drie minuten op maximale snelheid om resterende spoelbuffer te verwijderen.
Breng de kolom over naar een schone 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Laad 50 microliter elutiebuffer op de kolom en laat de buffer gedurende zeven minuten in de kolom weken. Centrifugeer vervolgens de kolom gedurende één minuut bij 6000 keer G.
Pipetteer het eluaat terug in de kolom en centrifugeer de kolom gedurende één minuut op maximale snelheid om het urine cel-vrije DNA te verkrijgen. Om de standaarden voor te bereiden, isoleer eerst DNA van een geschikte cellijn met behulp van een zuiveringskit. Kwantificeer het DNA van elk gezuiverd urinemonster in de cellijn met een spectrofotometer volgens de instructies van de kitfabrikant.
Verdun het UCF DNA tot één nanogram per microliter en bewaar de verdunde monsters op min 20 graden Celsius tot ze klaar zijn voor de integriteitstest. Verdun het cellijn DNA om zes standaarden van 100 microliter met verschillende concentraties te maken. Bewaar de standaarden op min 20 graden Celsius.
Om de DNA-integriteitstest te starten, ontdooi de UCF DNA-monsters, de standaarden, de geschikte PCR-primers en groene supermix op ijs. Zet vervolgens de 72-wels rotor schijfplaat met stripbuizen op. Plaats twee, 10 microliter aliquoten van standaard en vervolgens elke monster in de putjes.
Bereid twee putjes van 10 microliter RNAse-vrij water voor als negatieve controles. Bereid voor elke gevulde put een mix van één microliter van elke primer, 12,5 microliter groene supermix en 6,5 microliter RNAse-vrij water. Breng 15 microliter van de mix over in elke gevulde put en breng vervolgens de putjes over in een 72-wels rotor schijf.
Voer de PCR uit met een realtime instrument volgens de specificaties van de fabrikant. Controleer met behulp van de instrumentsoftware of er replieken zijn met een verschil in cyclische drempelwaarde van één of meer. Gooi deze monsters weg uit de analyse en evalueer de mediaan cyclische drempelwaarde voor de resterende monsters.
Voer smeltanalyse uit op elk monster met een mediaan cyclische drempelwaarde van 36 of minder om de specificiteit van het PCR-product te evalueren. Gebruik vervolgens de standaardcurve om een concentratie in nanogram per microliter te bepalen voor elke applicon. Urine cel-vrij DNA werd geïsoleerd en de DNA-integriteit werd geëvalueerd in vier regio's die een verhoogde DNA-kopienummer in solide tumoren vertonen.
Een controlesequentie werd ook geëvalueerd om te verifiëren of de DNA-hoeveelheid in elk monster voldoende was voor de integriteitstest. De totale vrije DNA-concentratie en de variantiecoëfficiënten werden voor elk gen berekend. Deze methode vertoont 73% gevoeligheid en 84% specificiteit voor het detecteren van blaaskanker, maar slechts 58% gevoeligheid en 44% specificiteit voor prostaatkanker.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één werkdag worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals digitale PCR of next generation sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het induceren van kopienummer van de genen van belang. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het analyseren van de DNA-integriteit in de celvrije supernatantfractie van urine-monsters, gericht op de vroege detectie van urologische maligniteiten. Deze methode heeft een nauwkeurigheid getoond bij het non-invasief diagnosticeren van blaas kanker.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Urologische oncologie
- Niet-invasieve diagnostische technieken
- Celvrij DNA-analyse
Achtergrond
- Urologische maligniteiten laten vaak vrije nucleïnezuren vrij in de urine.
- Vroegtijdige diagnose is cruciaal voor een effectieve behandeling.
- Huidige methoden kunnen invasief zijn of een lagere nauwkeurigheid hebben.
- Analyse van celvrij DNA kan waardevolle inzichten verschaffen.
Doel van de studie
- Om de integriteit van celvrij DNA in urine te beoordelen.
- Om vroege diagnose van blaas- en prostaatkanker te faciliteren.
- Om een methode te ontwikkelen die eenvoudig uit te voeren en te analyseren is.
Gebruikte methoden
- Analyse van urineproeven op de integriteit van celvrij DNA.
- Beoordeling van specifieke oncogensequenties.
- Toepassing van de methode op andere biologische vloeistoffen zoals serum.
- Overweging van de uitdagingen bij lage concentraties in urineproeven.
Belangrijkste resultaten
- De methode is effectief voor de vroege detectie van blaaskanker.
- Het demonstreert potentieel voor het diagnosticeren van andere urologische maligniteiten.
- Het gebruiksgemak maakt het toegankelijk voor onderzoekers.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van de kankerbiologie verbeteren.
Conclusies
- Deze methode biedt een veelbelovende benadering voor niet-invasieve cancerdiagnostiek.
- Het kan worden aangepast voor diverse soorten biologische monsters.
- Toekomstig onderzoek kan de toepassing ervan in klinische omgevingen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De ontdekking van niet-invasieve biomarkers voor urologische kankers blijft een kritieke onvervulde behoefte in trajecten voor vroege detectie. Integriteitsanalyse van celvrij DNA in urine biedt een snelle methode met een lage input om oncogen-loci te onderzoeken via kwantitatieve PCR-metingen, wat target-validatie en assay-ontwikkeling in discovery-workflows ondersteunt. De eenvoud en aanpasbaarheid aan andere biofluïda maken cross-functioneel hergebruik in translationele biomarkerprogramma's mogelijk.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt analyse van specifieke oncogeensequenties (c-MYC, BCAS1, HER2, AR) mogelijk om de DNA-integriteit te beoordelen als functionele uitlezing van de afgifte van tumorafgeleide nucleïnezuren.
- Operationele waarde: Vereist slechts enkele milliliters urine, waardoor minimale monstervolumes en standaard laboratoriumapparatuur volstaan voor een brede toegankelijkheid.
- Voorspellende waarde: Levert kwantitatieve cycling threshold-gegevens om drempelwaarden voor DNA-integriteit te evalueren die kanker onderscheiden van gezonde toestanden, ter ondersteuning van hypothesetoetsing bij targetvalidatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, genspecifieke concentratiemetingen via standaardcurves, wat een reproduceerbare beoordeling van de DNA-integriteit over meerdere oncogeenloci mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Compatibel met real-time PCR-platforms en bevat ingebouwde controles (negatieve watercontroles, consistentiecontroles van replicaten) om de assay-specificiteit en datakwaliteit te waarborgen.
- Schaalbaarheid: De methode kan worden aangepast aan andere genen van belang of biologische vloeistoffen (serum/plasma), waardoor het platform kan worden hergebruikt in verschillende ontdekkingsprojecten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Toonde een sensitiviteit van 73% en een specificiteit van 84% aan voor de detectie van blaaskanker in menselijke urinevloeistoffen, wat een referentiekader biedt voor de translationele stap van preklinisch naar klinisch onderzoek.
- Mechanistische risicoreductie: Evalueert de DNA-integriteit op loci die frequent geamplificeerd zijn in solide tumoren, waarbij het moleculaire fenotype wordt gekoppeld aan kankergerelateerde genomische alteraties.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van integriteitsmetrieken afgeleid van niet-invasieve monsters, waardoor de afhankelijkheid van invasieve biopten tijdens de vroege validatie wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesegestuurde targetvalidatie tot assaykwalificatie, in het bijzonder voor urologische kankerprogramma's die op zoek zijn naar niet-invasieve biomarkers.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van apoptotische versus necrotische DNA-vrijgavepatronen door de integriteit van lange amplicons (>250 bp) in urine-supernatans te meten.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten (ng/μL per gen) die vergelijking tussen verschillende monstersets en condities voor hit-selectie mogelijk maken.
- Analytics: Genereert mediane cycling threshold- en concentratiegegevens die statistisch kunnen worden geëvalueerd om diagnostische afkapwaarden en reproduceerbaarheid te bepalen.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door aangetoonde prestaties in menselijke monsters, wat bijdraagt aan inspanningen voor biomarker-kwalificatie.
- Enterprise Reuse: Het protocol is modulair—urine-DNA-isolatie en integriteitstesten kunnen worden ontkoppeld en worden toegepast op andere monstertypen of genpanelen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de ontwikkeling van vloeibare biopten door een directe maat te bieden voor de integriteit van de lengte van DNA-fragmenten afkomstig uit tumoren.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerde workflow met gedefinieerde stappen voor centrifugatie, zuivering en kwaliteitscontrole garandeert reproduceerbaarheid tussen gebruikers en locaties.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go beslissingen mogelijk in de vroege ontdekkingsfase door een niet-invasieve, kosteneffectieve proxy te bieden voor de beoordeling van de tumorlast.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets of assays op basis van de prestaties van de niet-invasieve DNA-integriteit in ziekterelevente monsters.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de verwerking van urine-monsters, DNA-zuivering en real-time PCR-opstelling om de lage opbrengst te beheren en contaminatie te voorkomen.
- Afhankelijk van toegang tot een centrifuge, een thermische cycler met smeltcurve-functionaliteit en spectrophotometrische kwantificatietools.
- Vereist standaardisatie van het tijdstip van urinecollectie (eerste ochtendurine, <3h bij 4°C) en de verwerking om pre-analytische variabiliteit te minimaliseren.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van de DNA-inputconcentratie en ampliconselectie vereisen op basis van het kopienummer van het doelgen.
- Praktische beperking: De lage concentratie van celvrij DNA in urine kan het samenvoegen van monsters of normalisatie van de input noodzakelijk maken voor consistente resultaten, zoals vermeld in het protocol.
