Name: Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer cell-free DNA-integriteitsanalyse in urine voor niet-invasieve diagnose van blaas- en prostaatkanker. Deze methode biedt een eenvoudige aanpak voor vroegtijdige detectie van urologische maligniteiten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Gráinne Tierney en Silvia Bellissimo voor hun redactionele bijstand.

Het protocol volgt de richtlijnen van de IRST Human ethische commissie onderzoek. LET OP: In dit protocol, geïsoleerde we DNA van urinemonsters naar een UCF DNA integriteit analyses uit te voeren. LNCaP en MRC cellijnen werden gebruikt om standaarden te construeren. Technieken zoals DNA-extractie DNA kwantificatie (spectrofotometer en real-time PCR voor de controle gen STOX1) en real-time PCR voor bepaalde oncogenen werden uitgevoerd (figuur 1). 1. Urine verwerven en verwerken <ol><li> Zorg voor een schone bijvangst eerste ochtend urine monster in een schone, droge, plastic beker. Vang minimaal 50 ml van het urinemonster. </li><li> Handhaaf de urine bij 4 ° C gedurende maximaal 3 uur en het naar het laboratorium bij dezelfde temperatuur. </li><li> Meng elk monster door het tweemaal inverteren onmiddellijk na aankomst in het laboratorium en overdracht in twee 50-mL-conische bodem polypropyleen buizen. </li><li> Centrifugeer de buizenbij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C of bij kamertemperatuur. </li><li> Zorgvuldig overdracht 10 ml van het bovenste deel van de urine supernatant in twee 5-ml buizen, waarbij ten minste 2 ml van de bovenstaande vloeistof boven de celpellet. OPMERKING: overbrengen het bovenste deel van het supernatant vermindert het gevaar voor besmetting met cellen of celresten. Er is geen duidelijke afbakening tussen de bovenste en onderste delen. </li><li> Gooi de pellet en het supernatant onmiddellijk bevriezen bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. DNA-isolatie uit de urine supernatant en cellijnen OPMERKING: Isoleer het DNA uit een cellijn (bijvoorbeeld LNCaP prostaatkanker of blaaskanker MRC) met een commerciële kit en de instructies van de fabrikant. Isolatie van DNA uit de urine supernatant moet worden uitgevoerd met de commerciële protocol als volgt gewijzigd: <ol><li> Dooi een portie van de supernatant urine bij kamertemperatuur. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex en meng de urine monster en 1 ml van het supernatant urine in een duidelijke 5-mL buis. Bevries de residuele urine bij -80 ° C. </li><li> Voeg 100 ul proteïnase k rechtstreeks aan het monster. </li><li> Voeg 1 ml AL buffer aan het monster en goed mengen door pipetteren. </li><li> Sluit de buis en incubeer de monsters bij 56 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Tijdens incubatie bereiden één kolom voor elk monster en de voorbereiding van de wasbuffers, AW1 en AW2, volgens instructies van de fabrikant (voeg de opgegeven hoeveelheid 100% ethanol). </li><li> Breng de monsters naar kamertemperatuur en voeg 1 ml absolute ethanol. Meng volledig door pipetteren. </li><li> Voeg 650 ul van het mengsel verkregen in stap 2.7 op de kolom en centrifugeer bij 6000 xg deze gedurende 1 min. </li><li> Gooi de buis met het doorstroomkanaal en plaats de kolom op een nieuwe, schone verzamelbuis. Herhaal de stappen 2,8 en 2,9 tot alle monster mengsel is gebruikt (5 maal). </li><li> Voeg 500 &amp;# 181, L buffer AW1 zonder bevochtiging de rand van de kolom. Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min. </li><li> Gooi de buis met het doorstroomkanaal en vervangen door een nieuwe, schone verzamelbuis. </li><li> Voeg 500 ul buffer AW2 zonder bevochtiging de rand van de kolom. Centrifugeer het op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 min. </li><li> Gooi de buis met het doorstroomkanaal en vervangen door een nieuwe, schone verzamelbuis. </li><li> Herhaal stap 2.12 om eventuele resten wassen buffer te verwijderen. </li><li> Plaats de kolom in een schone 1,5-mL buis. Voeg 50 ul elutiebuffer AE en wacht 7 minuten zodat de buffer bevochtigt de kolom. </li><li> Centrifugeer bij 8000 xg gedurende 1 min. </li><li> Pipetteer het eluens uit stap 2,15 in de mini-kolom en centrifugeer het op maximale snelheid gedurende 1 minuut tot de maximale herstel van DNA te waarborgen. </li></ol> 3. DNA Kwantificering en verdunning <ol><li> Met behulp van een spectrofotometer, voert de kwantificering van DNA uit both de cellijn en de urine supernatant monsters. Gebruik 2 pi monster op een bench-top spectrometer, volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Verdun de UCF DNA monsters worden tot een concentratie van 1 ng / ul verkrijgen en opslaan van de DNA bij -20 ° C totdat het DNA integriteit analyse. Opmerking: Als de DNA hoeveelheid onvoldoende te gaan met real-time PCR (ten minste 100 ng) Voer een nieuw DNA isolatiewerkwijze. </li><li> Verdun het DNA van cellijn monsters met zes standaarden te verkrijgen met verschillende concentraties: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 en 2 ng / ul, elk met een volume van 100 pl (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, en ST6). Bewaar de cellijn DNA standaarden bij -20 ° C totdat het DNA integriteit analyse. </li></ol> 4. DNA Integrity Test - PCR <ol><li> Ontdooi de primers (de concentratie afhankelijk van het type test), groene Supermix, cellijn DNA standaarden en UCF DNA verdunde monsters op ijs. </li><li> Bereid strip buizen in de plaat fof de 72-well rotor disc. Aliquot 10 pi in duplo voor elke standaard en verdunde monster en 10 ul van RNase-vrij water voor de negatieve controle. </li><li> Bereid een mengsel van 1 pi van elke primer (de concentraties aangegeven in tabel 1), 12,5 pl groene Supermix en 6,5 ui RNase-vrij water voor elk monster. Bij de voorbereiding van de mix, gebruikt u het volgende aantal monsters: 6-normen voor 2 herhalingen, aantal monsters voor 2 duplo, negatieve controle voor 2 herhalingen, en 2 extra monsters. </li><li> Aliquot 15 pi van het mengsel in elk putje. Niet pipet of draai de buizen. </li><li> Start het protocol met de in tabel 1 PCR-omstandigheden. LET OP: Voor de UCF DNA waarde werden 29 DNA-monsters verwerkt voor elke real-time experiment met behulp van de 72-well rotor schijf: 29 x 2 monsters + 6 x 2 normen + negatieve controle x 2 = 72 (UCF DNA-waarde). LET OP: Het protocol voor de UCF DNA integriteit analyse kan ookuitgevoerd met een andere PCR real-time instrument (bij gebruik van een ander apparaat, kan ROX kleurstof te worden toegevoegd). </li></ol> 5. DNA Integrity Test - Data-analyse en interpretatie OPMERKING: De UCF DNA voor elk monster werd verkregen door een real-time-detectie instrument systeemsoftware met een standaard curve constructie voor elk individueel gen PCR evaluatie en onder gebruikmaking standaardkromme interpolatie, zoals eerder beschreven 7-9 (figuur 2). <ol><li> Evalueer de replica&#39;s; monster repliceert met een verschil ≥1 Ct moeten worden verwijderd en opnieuw geëvalueerd in een tweede experiment. </li><li> Bereken de mediaan Ct voor elk monster en beschouwen monsters met een Ct-waarde ≤ 36. </li><li> Evalueer de specificiteit van de PCR producten met behulp van smelt-analyse. </li><li> Evalueer de concentratie van elke amplicon door interpolatie van de standaardcurve; het verkrijgen van een concentratie (ng / ul) voor elke amplicon.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine%3A+Sources%2C+Structure%2C+Diagnostic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li>
<li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer%3A+urine+supernatant+versus+urine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li>
<li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Hum.Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li>
<li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+Integrity%2C+Applications+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Clin.Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li>
<li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.Markers%22%5BJournal%5D)">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120(2015).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.Res.Int%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis%3A+preliminary+data%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.Oncol%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li>
<li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2%2Fneu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Patho%22%5BJournal%5D)">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li>
<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

UCF DNA integriteit analyse is een nieuwe, niet-invasieve werkwijze voor het bepalen van DNA integriteit in urine. Het werd onlangs voorgesteld voor de vroege diagnose van de blaas 9 en prostaatkanker 7,8. Een aantal van de voor- en nadelen van de UCF DNA betrouwbaarheidstoetsing komen hier aan bod, samen met toekomstperspectief. Het belangrijkste voordeel van de benadering is dat het een goedkope, niet-invasieve werkwijze en een eenvoudig protocol om urine te onderzoek...

Celvrij DNA in bloed en urine door celdood gedetecteerd door apoptotische of necrotische mechanismen. Celvrij DNA in bloed is uitgebreid bestudeerd voor diagnostische en prognostische doeleinden bij verschillende ziekten, met name kanker 1. Maar minder bekend is over de rol van urine-cel-vrij (UCF) DNA. UCF DNA kan afkomstig zijn van bloed dat door de glomerulaire filtratie systeem of uit cellen die direct in contact komen met de lichaamsvloeistof 2 (bijvoorbeeld urotheelcellen of prostaatcellen). Het gebruik van UCF DNA als bron van biomarkers is hoofdzakelijk onderzocht voor de vroege diagnose van nier, blaas en prostaat kanker door het hoge percentage UCF DNA rechtstreeks uit urinewegen cellen 3,4. Weinig bekend over UCF DNA en de beste methoden voor het isoleren en karakteriseren van het. Aangezien de hypothese dat tumorcellen vrijkomen langer DNA-fragmenten dan normale cellen, de evaluatiecelvrij DNA integriteit is onderzocht in een poging om de oorsprong van DNA ophelderen in de bloedsomloop 5. Sommige studies hebben aangetoond dat celvrij DNA integriteit in bloed vormt een goede diagnostische test voor vele soorten kanker 6, en dezelfde hypothese is die met betrekking tot urine 7-9. Dit artikel beschrijft een nieuwe werkwijze voor UCF DNA integriteit analyse met een mogelijke toepassing van de blaas en prostaat kanker detectie. Vooral de integriteit van UCF DNA fragmenten meer dan 250 bp werd getest in 4 regio&#39;s waarin een hoger aantal DNA-kopieën in vaste tumoren, zoals prostaat- en blaaskanker: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ) BCAS1 (20q13.2), en AR (Xq12) 10-14. Specifieke oncogenen, plaats willekeurige sequenties werden gekozen om de kans op het vinden van hen in het celvrije fractie van kankerpatiënten te verhogen. Een van de belangrijkste voordelen vandeze methode is dat het flexibel is en dat andere gebieden kunnen ook worden geselecteerd op basis van het type tumor en kenmerken.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>HPLC-zuivering, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Andere spectrofotometrische methoden kunnen ook worden gebruikt om DNA te kwantificeren</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Een ander Real Time PCR-instrument kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>één centrifuge voor 50 mL buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &deg;C vriezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg;C vriezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipettips (10; 20; 200; 1.000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes en Kappen, 0,1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collectiebuizen (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in de urine monsters

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Hoewel de aanwezigheid van circulerend celvrij DNA in plasma of serum is op grote schaal aangetoond dat een geschikte bron van biomarkers voor vele vormen van kanker zijn er weinig studies gericht op het mogelijke gebruik van urine celvrij (UCF) DNA. Uitgaande van de hypothese dat de normale apoptotische cellen sterk gefragmenteerd DNA en dat kankercellen vrijgave langer DNA, de mogelijke rol van DNA integriteit UCF beoordeeld als vroege diagnostische merker kan onderscheiden tussen patiënten met prostaatkanker of blaaskanker en gezonde individuen. Een UCF DNA integriteit analyse is voorgesteld op basis van vier kwantitatieve real-time PCR van vier sequenties langer dan 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2 en AR. Sequenties die vaak een groter aantal DNA-kopieën in de blaas en prostaat kanker werden voor de analyse, maar de werkwijze is flexibel, en deze genen kunnen worden vervangen door andere genen van interest. De potentiële bruikbaarheid van UCF DNA als bron van biomarkers reeds aangetoond voor urologische maligniteiten, aldus de weg voor verdere studies UCF DNA typering bestrating. UCF DNA integriteit test het voordeel dat niet-invasief, snel en gemakkelijk uit te voeren met slechts een paar milliliter urine nodig de analyse worden uitgevoerd.

De totale vrije DNA-concentratie was meetbaar spectrofotometrisch voor alle geanalyseerde monsters, met een bereik tussen 1,51 en 138 ng / ul. Vijf controlemonsters werden gebruikt voor de reproduceerbaarheid van de gegevens: twee onafhankelijke realtime experimenten werden uitgevoerd voor c-MYC, HER2, BCAS1, AR en STOX1. De variatiecoëfficiënten (CV) werden vervolgens berekend voor elk gen (Tabel 2), met een goede reproduceer...

Er wordt een methode voorgesteld voor het analyseren van de DNA-integriteit in de celvrije supernatantfractie van urinemonsters. De methode is geschikt voor vroege detectie van urologische maligniteiten en heeft bewezen nauwkeurig te zijn voor de vroege diagnose van blaaskanker.

Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Het algemene doel van deze methode is om de integriteit van urine cel-vrij DNA te beoordelen bij specifieke oncogensequenties. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van urologische kanker, zoals vroege niet-invasieve diagnose van blaas- en prostaatkanker. Het grote voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk te doen en te analyseren is.De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van urologische maligniteiten, omdat ze normaal gesproken cellen en vrije nucleïnezuren in de urine afgeven. Hoewel deze methode inzicht kan geven in urinemonsters, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals serum of plasma. Over het algemeen zouden mensen die nieuw zijn met deze methode, problemen ondervinden omdat de concentratie van urine cel-vrij DNA vaak laag is.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we probeerden een eenvoudige methode te vinden voor niet-invasieve vroege detectie van blaaskanker. Om de procedure te starten, moet u een schone vangst van 50 milliliter eerste ochtendurine nemen die gedurende maximaal drie uur op vier graden Celsius is bewaard. Draai het monster twee keer om en verdeel het monster vervolgens in twee 50 milliliter kegelcentrifugebuizen.Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 850 keer G op vier graden Celsius. Transfer vervolgens voor elke buis 10 milliliter van het bovenste deel van de supernatant naar twee vijf milliliter buizen, waarbij minimaal twee milliliter supernatant boven de pellet wordt achtergelaten. Gooi de pellets weg en bewaar de supernatant op min 80 graden Celsius.Herhaal dit proces voor aanvullende urinemonsters indien nodig. Om met DNA-zuivering te beginnen, ontdooi voor elk monster een aliquot van urinesupernatant. Vortex het ontdooide monster en draai de buis twee keer om.Plaats één milliliter van het monster in een vijf milliliter buis en bewaar de rest op min 80 graden Celsius. Bereid een DNA-zuiveringskit voor urinmonsters voor volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 100 microliter proteïnase K en één milliliter lysisbuffer toe aan het monster en meng goed met een pipette.Incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 56 graden Celsius. Tijdens de incubatie, bereid de spoelbuffers in een spinkolom. Na incubatie, laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur en voeg vervolgens één milliliter absolute ethanol toe en meng goed door te pipetteren.Breng 650 microliter van het monster over naar de kolom. Centrifugeer gedurende één minuut bij 6000 keer G. Vervang de opvangbuis en herhaal dit proces totdat al het monster op de kolom is geladen.Voeg vervolgens 500 microliter van de eerste spoelbuffer toe en centrifugeer de kolom gedurende één minuut bij 6000 keer G. Vervang de opvangbuis, voeg 500 microliter van de tweede spoelbuffer toe en centrifugeer de kolom gedurende drie minuten op maximale snelheid. Plaats de kolom in een schone opvangbuis en centrifugeer gedurende nog eens drie minuten op maximale snelheid om resterende spoelbuffer te verwijderen.Breng de kolom over naar een schone 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Laad 50 microliter elutiebuffer op de kolom en laat de buffer gedurende zeven minuten in de kolom weken. Centrifugeer vervolgens de kolom gedurende één minuut bij 6000 keer G.Pipetteer het eluaat terug in de kolom en centrifugeer de kolom gedurende één minuut op maximale snelheid om het urine cel-vrije DNA te verkrijgen. Om de standaarden voor te bereiden, isoleer eerst DNA van een geschikte cellijn met behulp van een zuiveringskit. Kwantificeer het DNA van elk gezuiverd urinemonster in de cellijn met een spectrofotometer volgens de instructies van de kitfabrikant.Verdun het UCF DNA tot één nanogram per microliter en bewaar de verdunde monsters op min 20 graden Celsius tot ze klaar zijn voor de integriteitstest. Verdun het cellijn DNA om zes standaarden van 100 microliter met verschillende concentraties te maken. Bewaar de standaarden op min 20 graden Celsius.Om de DNA-integriteitstest te starten, ontdooi de UCF DNA-monsters, de standaarden, de geschikte PCR-primers en groene supermix op ijs. Zet vervolgens de 72-wels rotor schijfplaat met stripbuizen op. Plaats twee, 10 microliter aliquoten van standaard en vervolgens elke monster in de putjes.Bereid twee putjes van 10 microliter RNAse-vrij water voor als negatieve controles. Bereid voor elke gevulde put een mix van één microliter van elke primer, 12,5 microliter groene supermix en 6,5 microliter RNAse-vrij water. Breng 15 microliter van de mix over in elke gevulde put en breng vervolgens de putjes over in een 72-wels rotor schijf.Voer de PCR uit met een realtime instrument volgens de specificaties van de fabrikant. Controleer met behulp van de instrumentsoftware of er replieken zijn met een verschil in cyclische drempelwaarde van één of meer. Gooi deze monsters weg uit de analyse en evalueer de mediaan cyclische drempelwaarde voor de resterende monsters.Voer smeltanalyse uit op elk monster met een mediaan cyclische drempelwaarde van 36 of minder om de specificiteit van het PCR-product te evalueren. Gebruik vervolgens de standaardcurve om een concentratie in nanogram per microliter te bepalen voor elke applicon. Urine cel-vrij DNA werd geïsoleerd en de DNA-integriteit werd geëvalueerd in vier regio's die een verhoogde DNA-kopienummer in solide tumoren vertonen.Een controlesequentie werd ook geëvalueerd om te verifiëren of de DNA-hoeveelheid in elk monster voldoende was voor de integriteitstest. De totale vrije DNA-concentratie en de variantiecoëfficiënten werden voor elk gen berekend. Deze methode vertoont 73% gevoeligheid en 84% specificiteit voor het detecteren van blaaskanker, maar slechts 58% gevoeligheid en 44% specificiteit voor prostaatkanker.Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één werkdag worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals digitale PCR of next generation sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het induceren van kopienummer van de genen van belang. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

De gepresenteerde diagnostische FL-DNA kit is een tijdbesparende en gebruiksvriendelijke methode om de betrouwbare waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van colorectale kankerlaesies te bepalen.

Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor niet-invasieve vloeibare biopsietechniek, waaronder bloedafname, plasma- en buffy coatscheiding, cfDNA- en kiembaan-DNA-extractie, kwantificering van cfDNA of kiembaan-DNA en cfDNA-fragmentverrijkingsanalyse.

Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

De komeettest is een populair middel om DNA-schade op te sporen. Deze studie beschrijft een benadering van het uitvoeren van dia's in representatieve varianten van de komeettest. Deze aanpak verhoogde het aantal monsters aanzienlijk, terwijl de looptijd van de test, het aantal diamanipulaties en het risico op schade aan gels afnam.

Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.

Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen

Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde, door de ISO15189 geaccrediteerde sequencing-workflow van de volgende generatie voor het detecteren van doelgerichte genomische veranderingen in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels.

Detectie van doelgerichte veranderingen bij niet-kleincellige longkanker met behulp van sequencing van de volgende generatie

Leer cell-free DNA-integriteitsanalyse in urine voor niet-invasieve diagnose van blaas- en prostaatkanker. Deze methode biedt een eenvoudige aanpak voor vroegtijdige detectie van urologische maligniteiten.

Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters

Meer video's verkennen