Een snelle, schaalbare methode voor het isoleren, functionele studie en analyse van cel-afgeleide extracellulaire matrix
January 4th, 2017
De extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol bij het definiëren van de micro-omgeving van cellen en bij het moduleren van celgedrag en fenotype. We beschrijven een snelle methode voor de isolatie van cel-afgeleide extracellulaire matrix, die kan worden aangepast aan verschillende schalen voor microscopische, biochemische, proteomische of functionele studies.
Het algemene doel van deze procedure is om extracellulair matrix van gekweekte cellen te isoleren voor een breed scala aan downstream experimenten, om functies en eigenschappen van extracellulair matrix in normale weefsels en ziekteprocessen te helpen begrijpen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van extracellulair matrix te beantwoorden, zoals de organisatie, moleculaire samenstelling, eiwitinteracties of functionele eigenschappen van extracellulair matrix. Ook het extracellulair matrix kan van elk aanhankend celtype worden bereid.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ze op verschillende schalen kunnen worden uitgevoerd om cellen efficiënt te verwijderen en extracellulair matrix-eiwitten te behouden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Silvia Rosini, een afgestudeerde student in mijn laboratorium, en Andrew Hellewell, een postdoctoraal onderzoeker. Om te beginnen, plateer cellen op deksels voor de beeldvorming van levende cellen en extracellulair matrix of ECM.
Voor fluorescencmicroscopiestudies, een vast ECM. Of voor de bereiding van cel-afgeleid ECM voor kleine schaal functionele studies. Incubeer de cellen bij een geschikte temperatuur en vochtigheid gedurende een geschikte tijd voor de cellen om ECM af te zetten.
Typisch meer dan 16 uur. In een afzuigkap, bereid 20 millimolair ammoniumhydroxide in een geschikt vat door gedeïoniseerd water te gebruiken om de stockoplossing één tot 14 te verdunnen. Verwijder de cellen uit de incubator en verwijder voorzichtig het kweekmedium.
Voeg vervolgens PBS zonder calcium of magnesium toe door voorzichtig te gieten tegen de wand van de schaal. Schud de schaal twee keer en giet de vloeistof weg. Herhaal de wassing vervolgens nog twee keer.
In de afzuigkap, verwijder de laatste PBS-was, voeg 1,5 milliliter ammoniumhydroxide per 60 millimeter schaal toe en incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Schud de schalen elke minuut voorzichtig om lysis van alle cellen te garanderen. Voeg vervolgens overvloedige hoeveelheden gedeïoniseerd water toe aan elke schaal en schud de plaat.
Giet vervolgens het ammoniumhydroxide gesolubiliseerde materiaal weg, dat bestaat uit ammoniumhydroxide, gelyseerd cellen en gedeïoniseerd water. Was de onoplosbare ECM-laag in overvloedige hoeveelheden gedeïoniseerd water nog vier keer om de volledige verwijdering van alle ammoniumhydroxide gesolubiliseerde materiaal te garanderen. Het is essentieel dat de cellen volledig worden verwijderd met overvloedige wasbeurten in gedeïoniseerd water.
Als deze stappen niet adequaat worden uitgevoerd, kan cellulair materiaal op de schaal achterblijven en downstream analyse verontreinigen. Voor onderzoek van het ECM door immunofluorescentie, verwijder het resterende gedeïoniseerd water, fixeer het ECM door 2% paraformaldehyde toe te voegen, afgekort PFA, en incubeer de schalen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gebruik PBS om elke fixeermonster twee keer te wassen en gooi de oplossing in een vloeibaar afvalcontainer voordat u fluorescentiemicroscopie uitvoert volgens het tekstprotocol.
Bereid in een laminaire stroomkap steriele oplossingen van PBS zonder calcium en magnesium, 20 millimolair ammoniumhydroxide en gedeïoniseerd water voor door elke oplossing door een steriele 0,2 micrometer filter in een geschikte steriele container te laten passeren. Terwijl u een steriele techniek handhaaft, gebruik steriele PBS om de matrixproduceercellen op deksels drie keer voorzichtig te wassen. Na het verwijderen van de laatste PBS-was, voeg 1,5 milliliter steriele ammoniumhydroxide toe aan de 60 millimeter schaal en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten met intermitterend schudden.
Voeg overvloedige hoeveelheden steriele gedeïoniseerd water toe aan de schaal met schudden, giet het cellysaat in een geschikte afvalcontainer. Herhaal deze wassing nog vier keer om de volledige verwijdering van het gesolubiliseerde materiaal te garanderen. Na trypsinisatie en pelletering van de cellen volgens het tekstprotocol, resuspendeer de testcellen in vers sterieel medium en gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.
Plateer vervolgens het juiste aantal testcellen en kweekmedium op het steriele geïsoleerde ECM op deksels en incubeer gedurende twee tot drie uur of voor de vereiste tijd. Om de organisatie van het actinecytoskelet te onderzoeken, fixeer de testcellen in 2% PFA en kleuren ze met FITC-Falioïdine om de F-actine te visualiseren en DAPI om de kernen te visualiseren. Na het kweken van een groot aantal cellen, vervolgens het verwijderen van de cellen en het wassen van het ECM zoals eerder in de video werd gedemonstreerd, kantelt u elke plaat onder een hoek om het resterende water naar de bodem van de schaal te laten lopen en gebruikt u een P200 pipette om voorzichtig al het resterende water te verwijderen tot de plaat volledig droog is.
Verwarm tegelijkertijd SDS-PAGE-steekbuffer die 100 millimolair DDT bevat tot 95 graden Celsius gedurende twee minuten, en voeg 200 microliter toe aan elke 100 millimeter plaat die door immunoblot zal worden onderzocht. Gebruik een celschraper om het monster naar één kant van de schaal te verzamelen en gebruik een 200 microliter pipettepunt om het in een buis over te brengen. Om het ECM door massaspectrometrie te analyseren, bereid een meer geconcentreerd monster voor door de SDS-PAGE-steekbuffer van de schaal te verzamelen, opnieuw op te warmen tot 95 graden Celsius en dezelfde aliquot over twee tot drie extra platen te gebruiken.
Breng eventueel overgebleven SDS-PAGE-steekbufferextract van de punt van de celschraper over in de buis om het verlies van ECM-materiaal te minimaliseren. Voor effectieve extractie van het geïsoleerde ECM in SDS-PAGE-steekbuffer is het essentieel dat de steekbuffer wordt verwarmd tot 95 graden, een reducerend middel bevat en dat de plaat uitgebreid wordt geschraapt. Hier getoond zijn COS-7 cellen gekweekt op glazen deksels.
Behandeling met ammoniumhydroxide verwijderde de cellen effectief, zoals vastgesteld door het verlies van de celkernen en het actinecyto
Overzicht
Dit artikel presenteert een snelle methode voor het isoleren van cel-afgeleide extracellulaire matrix (ECM) uit gekweekte cellen, die kan worden aangepast voor verschillende experimentele schalen. De techniek is cruciaal voor het bestuderen van de rol van ECM in cellulair gedrag en de implicaties ervan in normale en ziekelijke toestanden.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Extracellulaire Matrix Onderzoek
- Biochemische Analyse
Achtergrond
- De extracellulaire matrix is vitaal voor het celmicro-omgeving en gedrag.
- Inzicht in ECM eigenschappen kan inzichten opleveren in weefselfunctie en pathologie.
- Deze methode maakt het mogelijk om ECM van elk adherant celtype te bestuderen.
- Efficiënte verwijdering van cellen terwijl ECM-eiwitten behouden blijven, is een belangrijk voordeel.
Doel van Studie
- Om ECM te isoleren voor verschillende downstream experimenten.
- Om de organisatie en moleculaire samenstelling van ECM te onderzoeken.
- Om eiwitinteracties en functionele eigenschappen van ECM te verkennen.
Gebruikte Methoden
- Cellen worden geplaatst op dekglasjes voor ECM depositie.
- Ammoniumhydroxide wordt gebruikt om cellen te lyseren en ECM te isoleren.
- Wasstappen zorgen voor volledige verwijdering van cellulair materiaal.
- Immunofluorescence en SDS-PAGE worden gebruikt voor ECM analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van ECM gedemonstreerd door middel van microscopie.
- Fluorescente kleuring onthult ECM organisatie en samenstelling.
- De methode maakt analyse van ECM eigenschappen in verschillende celtypen mogelijk.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van de rol van ECM in gezondheid en ziekte.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het isoleren van ECM uit gekweekte cellen.
- Het biedt een basis voor verdere studies over ECM functies.
- Deze techniek kan onderzoek in celbiologie en weefsel engineering verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Rapid, scalable isolation of cell-derived extracellular matrix (ECM) enables high-confidence functional studies and biochemical analyses critical for early discovery and target validation. This method addresses a key bottleneck in ECM research by providing reproducible, contamination-minimized ECM preparations suitable for diverse downstream workflows. Its adaptability across adherent cell types supports portfolio-wide translational research and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of ECM composition and organization for pathway clarification.
- Supports functional target validation by isolating ECM free from cellular contaminants.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct analysis of ECM-protein interactions.
- Provides a platform for comparative studies across cell types and disease models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated ECM substrates for standardized phenotypic and functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative output in immunofluorescence and biochemical assays.
- Supports scalable workflows from small-scale functional studies to large-scale proteomics.
- Enables reliable evaluation of compound effects on ECM dynamics and composition.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ECM analysis with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from in vitro ECM studies to preclinical model validation.
- Reduces biological ambiguity in ECM-driven disease mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of ECM-targeted therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This ECM isolation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling robust hypothesis testing and downstream analytics.
- Discovery Biology: Provides high-purity ECM for hypothesis-driven studies of protein composition and organization.
- Screening: Delivers standardized ECM substrates for reproducible assay development and compound screening.
- Analytics: Supports quantitative immunofluorescence, SDS-PAGE, immunoblotting, and mass spectrometry outputs.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro ECM findings with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable protocol for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ECM-related studies.
- Operational Value: Standardizes ECM preparation, ensuring reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust, contamination-minimized ECM analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ECM-targeted programs and translational initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and cell culture handling.
- Needs access to fluorescence microscopy, SDS-PAGE, and mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous washing and extraction steps to prevent cellular contamination.
- Adaptable to any adherent cell type, supporting cross-model standardization.
- Careful handling of hazardous reagents (e.g., paraformaldehyde) is essential for safety.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Removal of Cells with Ammonium Hydroxide Solution
3:21
Sterile Preparation of Cell-derived Extracellular Matrix for Cell Functional Assays
5:01
Isolation of Extracellular Matrix for SDS-PAGE, Immunoblot Analysis, or Proteomics
6:30
Results: Isolation and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix
8:26
Conclusion
