Name: Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer hoe een GFP-gelabeld TMEM184A-construct de identiteit van een heparinereceptor in vasculaire cellen bevestigt. Deze methode ondersteunt functionele identificatie van weesgenen en biedt inzicht in eiwitlokalisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in het Lowe-Krentz lab wordt ondersteund door onderzoekssubsidie HL54269 van de National Institutes of Health aan LLK.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
<li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+%284TMs%29+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268(2016).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De protocollen hier vermeld zijn ontworpen om bevestiging op voor de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen 1 leveren. Knockdown technieken worden routinematig gebruikt als een mechanisme voor de identificatie van nieuwe eiwitten te bevestigen. Sommige functionele verlies na knockdown is gewoonlijk niet voldoende bewijs dat een kandidaat eiwit is eigenlijk de juiste receptor (of ander functioneel eiwit). Het is ook belangrijk om bewijs dat de gegadigde eiwit feiteli...

Identificatie van gegadigde eiwitten voor nieuwe functies vaak afhankelijk affiniteit gebaseerde isolatie protocollen gevolgd door een gedeeltelijke sequentiebepaling. Recente voorbeelden van nieuw geïdentificeerde eiwitten omvatten transmembraaneiwit 184A (TMEM184A), een heparine receptor geïdentificeerd na heparine-affiniteit interacties 1, en TgPH1, een pleckstrin homologie domein eiwit dat fosfoinositide PI (3,5) P2 2 bindt. Andere nieuwe proteïne-identificatie omvat directe sequentieanalyse van peptiden zoals door Vit, et al. die vroeger transmembraan peptiden aan eiwitproducten te identificeren sinds de voorgaande uncharacterized genen 3. Evenzo kan identificatie van nieuwe eiwitsequenties worden uitgevoerd met bioinformatica zoeken van eerder gekarakteriseerde eiwitten families zoals de identificatie van nieuwe eiwitten 4TM 4. Onderzoek van aquaporine familie gensequenties heeft alzo leverde de identificatie van nieuwe leden met nieuwe functies 5. Na identificatie, analyse van eiwitfunctie typisch een volgende stap die soms kunnen worden onderzocht met een specifieke assay van eiwitfunctie, zoals in het geval aquaporine. Indien mogelijk, kan de functie van een onlangs geïdentificeerd eiwit, met specifieke enzymatische of vergelijkbare functie in vitro assays. Omdat veel functies van nieuwe eiwitten afhankelijk complexe interacties die alleen voorkomen in intacte cellen of organismen in vitro testen zijn niet altijd effectief. Wel moet de in vivo assays worden ontworpen zodanig dat deze afhankelijk gensequentie. In celcultuur en / of eenvoudig model organismen, kan knock-down bewijsmateriaal in te dienen voor het eiwit / functie identificatie 6. Met nieuwe eiwitten die zoals hierboven vermeld, is het vaak voldoende om alleen neerhalen een eiwit functie te bevestigen, eend de opzet van in vivo functionele assays die afhankelijk gensequentie wordt belangrijk voor de karakterisering van nieuwe eiwitten. De recente identificatie van TMEM184A als heparine receptor (die moduleert proliferatie in vasculaire gladde spieren en ontstekingsreacties in endotheelcellen) middels affiniteitschromatografie en MALDI MS 1, 7 bood de gelegenheid om een verzameling assays ontwikkelen na knockdown vruchten afgeworpen in overeenstemming met de identificatie . Een recente beoordeling bevestigde dat heparine interageert specifiek met veel groeifactoren, hun receptoren, extracellulaire matrix componenten, celadhesie receptoren en andere eiwitten 8. In het vaatstelsel, heparine en heparansulfaat proteoglycanen (met heparansulfaat ketens gelijksoortige structuur heparine) interageren met honderden proteïnen 9. Om functioneel te bevestigen that TMEM184A was betrokken bij heparine opname en binding, technieken die het gen construct voor TMEM184A tewerkgesteld werden ontwikkeld. Het huidige rapport bevat een verzameling van testen op basis van een GFP-TMEM184A construct voor gebruik bij de bevestiging van de identiteit van TMEM184A als heparine receptor.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A construct</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Fluorescein-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, methanolvrij)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, verkrijgbaar via Fisher Scientific</td><td>PI28908 bij Fisher</td><td>Gebruik in een afzuigkap</td></tr><tr><td>Reacti-bind neutravidine platen (Avidine gecoate zwarte 96-well platen)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, via Fisher Scientific</td><td>PI15510 bij Fisher</td><td>Let op de houdbaarheid</td></tr><tr><td>Zwarte 96-well platen</td><td>Corning Life Sciences Plastic, gekocht via Fisher Scientific</td><td>064432 bij Fisher</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 vasculaire gladde spiercellijn</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>Kan worden omgezet in MEM-medium1</td></tr><tr><td>BAOEC boviene aorta endotheelcellen</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>Kweek zoals aanbevolen, kan worden omgezet in MEM-medium voor doorlopende kweek1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC boviene aorta gladde spiercellen</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>Kweek zoals aanbevolen, kan worden omgezet in MEM-medium voor doorlopende kweek1</td></tr><tr><td>RAOEC ratten aorta endotheelcellen</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td><td>Kweek zoals aanbevolen, kan worden omgezet in MEM-medium voor doorlopende kweek7</td></tr><tr><td>Biotinyleerde anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, via Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-gecoate kralen</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Beschikbaar bij Bio-Rad</td><td></td><td>Kan in het lab worden bereid. De pH is 6,8</td></tr><tr><td>TMEM184A antilichaam naar het N-uiteinde</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>Enige bekende TMEM184A antilichaam naar N-terminale regio.</td></tr><tr><td>TMEM184A antilichaam naar het C-uiteinde</td><td>Verkregen van ProSci Inc, Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci gebruikt in Figuur 1</td></tr><tr><td>GFP antilichamen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Gebruikt in Figuur 5</td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen, gelabeld met TRITC of Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (ezel anti-konijn, TRITC) 715 165 150 (ezel anti-muis, Cy3)</td><td>Minimale kruisreactiviteit om niet-specifieke kleuring te minimaliseren.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Gekocht bij Sigma</td><td>C5849</td><td>Let op dat dit specifieke catalogusnummer is stopgezet.&nbsp; De leverancier zal informatie verstrekken over vervanging.</td></tr><tr><td>Live imaging 35-mm schotels</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta met een 63X olie-immersielens</td><td>Gebruikt voor afbeeldingen en live-imaging in Figuur 1, 2 en 3</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td>C2+ confocal met een 60X olie-immersielens</td><td>Gebruikt voor afbeeldingen in Figuur 5</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880 met een 63X olie-immersielens</td><td>Gebruikt voor afbeeldingen in Figuur 2C</td></tr><tr><td>Electroporatieapparatuur</td><td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Electroporatie cuvettes</td><td>Beschikbaar bij MidSci</td><td>EC2L</td><td>Kan ook worden verkregen bij de apparatuurleverancier</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&reg; m200 Pro plate reader</td><td>Metingen in het midden van de putjes in plaats van aan het oppervlak.</td></tr><tr><td>Computerprogramma voor het meten van kleuringsintensiteit</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Programma en informatie beschikbaar online</td><td>Elk geschikt programma kan worden gebruikt. Zie https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html voor meer informatie&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Celcultuur trypsine-oplossing</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>gekocht als een 10x oplossing</td></tr></tbody></table>

met een gfp-gelabeld tmem184a construct voor bevestiging van heparine receptor identity

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Wanneer nieuwe eiwitten worden geïdentificeerd door middel van affiniteit gebaseerde isolatie en bioinformatica-analyse, zijn ze vaak grotendeels ongekarakteriseerd. Antilichamen tegen specifieke peptiden binnen de voorspelde sequentie toelaten dat sommige lokalisatie experimenten. Echter, andere mogelijke interacties met de antilichamen vaak niet worden uitgesloten. Deze situatie bood de gelegenheid om een ​​reeks assays afhankelijk van de eiwitsequentie ontwikkelen. Specifiek, een construct bevattende de gensequentie gekoppeld met de GFP coderende sequentie aan het C-terminale uiteinde van het eiwit werd verkregen en gebruikt voor deze doeleinden. Experimenten te karakteriseren lokalisatie, ligand affiniteit en versterking van de functie werden oorspronkelijk ontworpen en uitgevoerd om de identificatie van TMEM184A als heparine receptor 1 bevestigen. Bovendien kan het construct worden gebruikt voor studies naar membraantopologie vragen en gedetailleerde eiwit-ligand interacties. Het voorliggende rapport presenteert arange experimentele protocollen gebaseerd op het GFP-construct TMEM184A expressie gebracht in vasculaire cellen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor andere nieuwe eiwitten.

Terwijl in theorie transfectie van elke DNA-construct in cellen kunnen worden bereikt met lipofiele transfectie reagentia eerdere rapporten blijkt effectiever transfectie van GFP-constructen in endotheelcellen middels elektroporatie 12. Het protocol die hier gewoonlijk bereikt GFP-construct expressie in meer dan 80% van de primaire-afgeleide endotheelcellen en gladde spiercellen gebruikt. Het ontwerp van het construct in dienst gebruik gemaakt van een commercieel ...

Een construct dat codeert TMEM184A met een GFP-tag aan het carboxy-uiteinde ontworpen voor eukaryotische expressie, werd gebruikt in testen die de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen bevestigen.

Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Het algemene doel van het gebruik van een GFP-gelabeld construct is om de identiteit van een eerder onbekend eiwit te bevestigen met behulp van de GFP als een handvat. Deze methode kan helpen bij de functionele identificatie van weesgenen wanneer een specifieke enzymactiviteit niet beschikbaar is voor bevestiging. Het grote voordeel van deze techniek is dat de GPF-tag het mogelijk maakt om dezelfde construct te gebruiken voor verschillende soorten experimenten.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de transfectie niet altijd resulteert in de sterke expressie van het construct en de cellen niet altijd herleven. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we de moeilijkheden begonnen te herkennen bij het identificeren van een eiwit met alleen antilichamen die tegen het eiwit zijn gemaakt. Begin met het opnieuw opschorten van de cellen van belang in één milliliter HEPES-gebufferde elektroporatiebuffer in zoutoplossing en plaats de cellen onmiddellijk op ijs.Voeg een voldoende volume GFP-TMEM184A-gelabeld plasma toe aan de cellen om een ​​eindconcentratie van 20 microgram per milliliter DNA te bereiken en breng ongeveer 0,4 milliliter cellen over in een voorgekoelde elektroporatiecuvet. Elektroporeer de cellen. Breng vervolgens de getransfecteerde cellen aan op weefselkweekschotels en plaats de schotels 24 tot 72 uur in een cellenkweekincubator.De transfectiestap is de meest kritische stap van de procedure, omdat het grootste deel van het resterende experimentele werk niet effectief kan worden voltooid als de cellen niet levensvatbaar zijn en geen significante niveaus van het GFP-gelabelde construct tot expressie brengen. Voeg op het juiste experimentele tijdstip 100 microgram per milliliter Rhodamine Heparine toe aan het GFP-plasmide-expresserende celkweekmedium en incubeer de cellen, beschermd tegen licht, totdat het gewenste niveau van kleuring is bereikt, zoals waargenomen door middel van fluorescentiemicroscopie. Spoel vervolgens de cellen af met PBS en een paar seconden zacht schudden, beschermd tegen licht, gevolgd door fixatie met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten op kamertemperatuur met zacht schudden.Om de co-lokalisatie van GFP-gelabeld Rhodamine Heparine te beoordelen, gebruik een confocale microscoop met de juiste GFP- en Rhodamine-excitatieverlichting en verminderde lasers om ten minste 50 cellen van elk afzonderlijk labelexperiment te beeld. Onderzoek de beelden in het juiste beeldanalyseprogramma om de relatieve Rhodamine-vinding en opname in elke cel te bepalen, door een free-hand tool te gebruiken om de cellen binnen elke fluorescente afbeelding te omcirkelen. Gebruik het meetgereedschap om de intensiteit binnen elke omcirkelde ruimte te bepalen en exporteer vervolgens de fluorescentie-intensiteitsgegevens naar een spreadsheet om de oppervlakte vermenigvuldigd met de intensiteit te berekenen, waarbij de achtergrond voor dezelfde hoeveelheid oppervlakte voor elke cel wordt afgetrokken.De fluorescentie per cel kan vervolgens worden gemiddeld voor alle cellen om statistisch significante gegevens te verkrijgen. Om de fluorescentie-resonantie-energieoverdracht van GFP TMEM184A naar Rhodamine Heparine te vergemakkelijken, monteer eerst vaste GFP TMEM184A-getransfecteerde Rhodamine Heparine-gelabelde cellen op glazen microscoopglaasjes. Exciteer de cellen op 405 nanometer voor het beeldvormen van de Rhodamine-emissie, gevolgd door excitatie van 488 nanometer om de GFP-emissie af te beelden.Exciteer vervolgens de cellen op 561 nanometer voor een tweede Rhodamine-emissiebeeldvorming. Voor live-celbeeldvorming van de opname van Rhodamine Heparine, zaai een 100-milliliter confluente scheefkweek van de GFP TMEM184A-getransfecteerde cellen in 635 millimeter live-celbeeldvormingsschotels om cellen in de buurt van confluentie te verkrijgen. Vervang na 48 uur het supernatant door kweekmedium zonder fenolrood en breng een schotel met cellen over naar een confocale microscoop met een opwarmfase ingesteld op 37 graden Celsius.Focus de microscoop en voeg 100 microgram per milliliter Rhodamine Heparine toe aan de cellen met zacht mengen. Begin dan onmiddellijk met het opnemen van de live-beelden. Als er geen Heparine-opname optreedt binnen het gezichtsveld, verplaats de schotel lichtjes om de cellen met ten minste één groen blaasje te identificeren, dat de Rhodamine-label bevat.Voor de beoordeling van heparinebinding in vitro, spoel één zwarte ativan-gecoate 96-wellplaat en één zwarte niet-gecoate 96-wellplaat met 200 microliter 0,2%CHAPS PBS per put voor drie vijf minuten wasbeurten met schudden. Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter 60 picomol per put van biotinylerd anti-GFP in drievoudige toe aan de ativan-gecoate plaat voor elke GFP-vindingsgroep. Voeg vervolgens alleen buffer toe aan de controleputjes en verzegel alle putjes met een plaatdeksel voor een twee uur durende incubatie bij kamertemperatuur met schudden.Aan het einde van de incubatie, spoel alle putjes drie keer in CHAPS PBS, zoals net is aangetoond, en voeg 100 microliter vijf nanomol per put van GFP TMEM184A of GFP alleen toe aan de juiste putjes in de ativan-gecoate plaat. Na een uur incubatie bij kamertemperatuur met schudden, spoel alle putjes met verse CHAPS PBS en voeg 100 microliter van elke experimentele fluoresceïne-Heparineconcentratie toe, aan de juiste testputjes in drievoudige, aan de ativan-gecoate plaat. Voeg de concentratiestandaarden toe aan zowel de ativan-gecoate als niet-gecoate platen en incubeer beide platen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, met schudden, beschermd tegen licht.Gebruik nu een platenlezer om de initiële Heparine-fluorescentie-emissie in de controleputjes van beide platen op te nemen, en de initiële totale fluorescentie-emissie van de putjes met het geïmmobiliseerde GFP of GFP TMEM184A in de ativan-gecoate plaat. Breng vervolgens het ongebonden fluorescerende Heparine over van de putjes met het geïmmobiliseerde GFP TMEM184A of GFP naar de

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Hier laten wij het gebruik van fluorescente Alexa kleurstof gekoppeld met α-bungarotoxine aan GABAA-receptor oppervlak lokalisatie en endocytose in hippocampale neuronen meten. Door het gebruik van constructies, voorzien van een korte extracellulaire tag die bindt α-bungarotoxin, kan de analyse van plasmamembraaneiwit endocytische mensenhandel worden bereikt.

Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

Kernmembraaneiwitten spelen een centrale rol in veel fundamentele biologische processen en zijn betrokken geweest bij een verscheidenheid aan menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft een nieuw Cre/Lox-gebaseerd muismodel dat de ruimtelijk-tijdelijke controle van LINC-complexen-verstoring mogelijk maakt.

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Dit manuscript beschrijft een genoom-schaal celgebaseerde screening benadering om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren.

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Leer hoe een GFP-gelabeld TMEM184A-construct de identiteit van een heparinereceptor in vasculaire cellen bevestigt. Deze methode ondersteunt functionele identificatie van weesgenen en biedt inzicht in eiwitlokalisatie.

Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

Meer video's verkennen