Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

Het algemene doel van het gebruik van een GFP-gelabeld construct is om de identiteit van een eerder onbekend eiwit te bevestigen met behulp van de GFP als een handvat. Deze methode kan helpen bij de functionele identificatie van weesgenen wanneer een specifieke enzymactiviteit niet beschikbaar is voor bevestiging. Het grote voordeel van deze techniek is dat de GPF-tag het mogelijk maakt om dezelfde construct te gebruiken voor verschillende soorten experimenten.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de transfectie niet altijd resulteert in de sterke expressie van het construct en de cellen niet altijd herleven. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we de moeilijkheden begonnen te herkennen bij het identificeren van een eiwit met alleen antilichamen die tegen het eiwit zijn gemaakt. Begin met het opnieuw opschorten van de cellen van belang in één milliliter HEPES-gebufferde elektroporatiebuffer in zoutoplossing en plaats de cellen onmiddellijk op ijs.

Voeg een voldoende volume GFP-TMEM184A-gelabeld plasma toe aan de cellen om een ​​eindconcentratie van 20 microgram per milliliter DNA te bereiken en breng ongeveer 0,4 milliliter cellen over in een voorgekoelde elektroporatiecuvet. Elektroporeer de cellen. Breng vervolgens de getransfecteerde cellen aan op weefselkweekschotels en plaats de schotels 24 tot 72 uur in een cellenkweekincubator.

De transfectiestap is de meest kritische stap van de procedure, omdat het grootste deel van het resterende experimentele werk niet effectief kan worden voltooid als de cellen niet levensvatbaar zijn en geen significante niveaus van het GFP-gelabelde construct tot expressie brengen. Voeg op het juiste experimentele tijdstip 100 microgram per milliliter Rhodamine Heparine toe aan het GFP-plasmide-expresserende celkweekmedium en incubeer de cellen, beschermd tegen licht, totdat het gewenste niveau van kleuring is bereikt, zoals waargenomen door middel van fluorescentiemicroscopie. Spoel vervolgens de cellen af met PBS en een paar seconden zacht schudden, beschermd tegen licht, gevolgd door fixatie met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten op kamertemperatuur met zacht schudden.

Om de co-lokalisatie van GFP-gelabeld Rhodamine Heparine te beoordelen, gebruik een confocale microscoop met de juiste GFP- en Rhodamine-excitatieverlichting en verminderde lasers om ten minste 50 cellen van elk afzonderlijk labelexperiment te beeld. Onderzoek de beelden in het juiste beeldanalyseprogramma om de relatieve Rhodamine-vinding en opname in elke cel te bepalen, door een free-hand tool te gebruiken om de cellen binnen elke fluorescente afbeelding te omcirkelen. Gebruik het meetgereedschap om de intensiteit binnen elke omcirkelde ruimte te bepalen en exporteer vervolgens de fluorescentie-intensiteitsgegevens naar een spreadsheet om de oppervlakte vermenigvuldigd met de intensiteit te berekenen, waarbij de achtergrond voor dezelfde hoeveelheid oppervlakte voor elke cel wordt afgetrokken.

De fluorescentie per cel kan vervolgens worden gemiddeld voor alle cellen om statistisch significante gegevens te verkrijgen. Om de fluorescentie-resonantie-energieoverdracht van GFP TMEM184A naar Rhodamine Heparine te vergemakkelijken, monteer eerst vaste GFP TMEM184A-getransfecteerde Rhodamine Heparine-gelabelde cellen op glazen microscoopglaasjes. Exciteer de cellen op 405 nanometer voor het beeldvormen van de Rhodamine-emissie, gevolgd door excitatie van 488 nanometer om de GFP-emissie af te beelden.

Exciteer vervolgens de cellen op 561 nanometer voor een tweede Rhodamine-emissiebeeldvorming. Voor live-celbeeldvorming van de opname van Rhodamine Heparine, zaai een 100-milliliter confluente scheefkweek van de GFP TMEM184A-getransfecteerde cellen in 635 millimeter live-celbeeldvormingsschotels om cellen in de buurt van confluentie te verkrijgen. Vervang na 48 uur het supernatant door kweekmedium zonder fenolrood en breng een schotel met cellen over naar een confocale microscoop met een opwarmfase ingesteld op 37 graden Celsius.

Focus de microscoop en voeg 100 microgram per milliliter Rhodamine Heparine toe aan de cellen met zacht mengen. Begin dan onmiddellijk met het opnemen van de live-beelden. Als er geen Heparine-opname optreedt binnen het gezichtsveld, verplaats de schotel lichtjes om de cellen met ten minste één groen blaasje te identificeren, dat de Rhodamine-label bevat.

Voor de beoordeling van heparinebinding in vitro, spoel één zwarte ativan-gecoate 96-wellplaat en één zwarte niet-gecoate 96-wellplaat met 200 microliter 0,2%CHAPS PBS per put voor drie vijf minuten wasbeurten met schudden. Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter 60 picomol per put van biotinylerd anti-GFP in drievoudige toe aan de ativan-gecoate plaat voor elke GFP-vindingsgroep. Voeg vervolgens alleen buffer toe aan de controleputjes en verzegel alle putjes met een plaatdeksel voor een twee uur durende incubatie bij kamertemperatuur met schudden.

Aan het einde van de incubatie, spoel alle putjes drie keer in CHAPS PBS, zoals net is aangetoond, en voeg 100 microliter vijf nanomol per put van GFP TMEM184A of GFP alleen toe aan de juiste putjes in de ativan-gecoate plaat. Na een uur incubatie bij kamertemperatuur met schudden, spoel alle putjes met verse CHAPS PBS en voeg 100 microliter van elke experimentele fluoresceïne-Heparineconcentratie toe, aan de juiste testputjes in drievoudige, aan de ativan-gecoate plaat. Voeg de concentratiestandaarden toe aan zowel de ativan-gecoate als niet-gecoate platen en incubeer beide platen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, met schudden, beschermd tegen licht.

Gebruik nu een platenlezer om de initiële Heparine-fluorescentie-emissie in de controleputjes van beide platen op te nemen, en de initiële totale fluorescentie-emissie van de putjes met het geïmmobiliseerde GFP of GFP TMEM184A in de ativan-gecoate plaat. Breng vervolgens het ongebonden fluorescerende Heparine over van de putjes met het geïmmobiliseerde GFP TMEM184A of GFP naar de