Name: Dissectie van de auditieve Bulla in postnatale muizen: Isolatie van het middenoor botten en histologische analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Leer de dissectie van de auditieve bulla bij postnatale muizen voor histologische analyse van het middenoor. Deze methode is essentieel voor onderzoek naar wondbiologie en botvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Masaki Yoda en Elise Lamar voor het kritisch lezen van het manuscript, Kazumasa Takenouchi voor hulp met histologie, Mari Fujiwara voor hulp met microscopie en Makoto Morikawa voor hulp bij het fotograferen van menselijke en muis gehoorbeentjes.

Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Keio University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC - erkenningsnummer: 09.221) en volg de institutionele richtlijnen inzake dierproeven aan Keio University voor het gebruik van dieren in het onderzoek. Menselijke specimens werden geïsoleerd uit een kadaver gedoneerd aan de afdeling Anatomie, Keio University School of Medicine, en werden gebruikt in overeenstemming met de institutionele regelgeving. 1. Isolatie van Auditieve Bulla en Capsule <ol><li> Euthanaseren muizen in een pot met een platform boven keukenpapier gedrenkt in isofluraan of sevofluraan tot respiratoire ventilatie langer dans een minuut en voer cervicale dislocatie. Wees voorzichtig om direct contact van muizen met de geweekte papieren handdoeken te vermijden. </li><li> Voeg een kleine dwarse snede in de dorsale kant van de nek en trek huid elkaar naar de kop en staart met beide handen onderliggende hals mu blootSCLE weefsel. </li><li> Onthoofden muizen op de cervicale regio met behulp van 14 cm scherpe chirurgische schaar. </li><li> Peel huid volledig in de richting van de neus. Snijd alle huid samen met de snuit en snijtanden. </li><li> Plaats schaar in de mond en snijd kauwspieren aan beide zijden. </li><li> Open de kaak voorzichtig en verwijder de tong en de onderkaak elkaar. </li><li> Met behulp van een scherpe schaar, gespleten schedel en schedelbasis in twee helften langs het sagittale vlak (figuur 1 A, B). </li><li> Met behulp van een tang, verwijder de cerebrale en cerebellaire hemisferen en de hersenstam. De auditieve bulla en capsule zich lateraal van het cerebellum en hersenstam. Merk op dat de auditieve bulla verder lateraal van de auditieve capsule (figuur 1C, D). </li><li> Ontleden de bulla en capsule met de omringende schedel bot (figuur 1E). </li><li> Breng het monster op een schotel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 bij kamertemperatuur. </li><li> Under een binoculair microscoop ontleden, een tang de omringende botten en een schaar uit elkaar te trekken om de losgemaakte grens rond de bulla en de capsule (figuur 1F) te snijden. De omringende beenderen verwijderd zijn de basioccipital (ventrale grens), exoccipital (ventro-posterior grens), supraoccipitale (posterior grens), interparietal, pariëtale (dorsale grens), squamosal (dorso-anterieure grens), alisphenoid (anterior grens), en basisfenoïdbeen (antero-ventrale grens) botten. Merk op dat de styliform proces (Sp), die de tympanische opening van de buis van Eustachius 41 ondersteunt, verschilt van de styloid proces van het slaapbeen. </li></ol> 2. Isolatie van gehoorbeentjes: Malleus, Incus en Stapes <ol><li> soort been <ol><li> Waarbij zowel kleine schaar en forceps, verwijder het gedeelte van de uitwendige gehoorgang lateraal van de sulcus tympanicus zodat het trommelvlies zichtbaar (Figuur 2A, B). </li><li> Verwijder een deel van het trommelvlies en trommelvlies bot in de buurt van de malleal processus brevis (kringspieren apophysis, zie Discussie), zowel op het ventrale (stippellijn) en posterior (#) wanden (figuur 2C). De hamer en de tensor tympani spier moet nu worden blootgesteld (figuur 2D, E). </li><li> Til de Malleus (figuur 2F) en snijd de tensor tympani spier met de schuine rand van een 27 G naald (figuur 2G). Merk op dat de malleal manubrium stevig hecht aan het trommelvlies, zoals gezien in andere zoogdieren. </li><li> Maak het trommelvlies voorzichtig uit de manubrium, dat is kwetsbaar. Verwijder het trommelvlies bot om de drie gehoorbeentjes onthullen. </li><li> Ontwrichten de hamer van het aambeeld op de ossicular gewricht (figuur 2H). </li><li> Isoleer de hamer door het breken van de voorste proces op goniale. </li></ol></li><li> Aambeeld en Stapes <ol><li> isoleer tHij incus door het afsnijden van het achterste ligament van de incus aan de korte crus (figuur 3A). </li><li> Isoleer de stijgbeugel door het afsnijden van de stapediale slagader in de buurt van de stijgbeugel met de schuine rand van een 27 G naald (Figuur 3B, C). Indien nodig, knip de pees van de stapediale spier aan de gespierde proces van de stijgbeugel met de naald. </li><li> Plaats een naald (of een markering pen) in de obturator foramen van de stijgbeugel en til de stijgbeugel. Na het verwijderen van de stijgbeugel, moet het ovale venster opening duidelijk zichtbaar (figuur 3D). </li></ol></li></ol> 3. Inbedding van Auditieve Bulla en Capsule <ol><li> Voorbereiding voor het inbedden in paraffine blokken <ol><li> Isoleer de bulla en de capsule zoals beschreven in paragraaf 1. </li><li> Snijd het voorste uiteinde van de bulla (styliform de werkwijze) met een schaar, dompel de bulla en capsule in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS bij 4 °C, en laat fixerende in de bulla te gaan. Als er lucht wordt gevangen in de bulla, verwijder deze dan met een naald en spuit. Laat de bulla en de capsule in het fixeermiddel bij 4 ° CO / N op een buis rotator. Let op: PFA is giftig en moet zorgvuldig worden behandeld. </li><li> Was eenmaal met PBS. </li><li> Ontkalken bulla capsule en een week bij 4 ° C in 10% ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA-2Na), 100 mM Tris-base, pH 7,0, in een 2 ml buisje. Wijzig de buffer om de andere dag. </li><li> Was eenmaal met PBS. Monsters kunnen worden opgeslagen in 70% ethanol in water bij 4 ° C. Eventueel overbrengen naar 70% ethanol door een gegradeerde reeks alcohol (30%, 50%, 70% in water). </li><li> Een weefselprocessor, dehydrateren specimens in een gegradeerde reeks ethanoloplossingen (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, per 1 h), duidelijk xyleen (4x, elk 1 uur bij 40 ° C) en infiltreren exemplaren met gesmolten paraffinewas 42. Eventueel vervangende xyleen commerciële weefsel Clearing oplossing (bijv Histo-Clear). </li><li> Uitladen exemplaren van de processor, en verwijder ze uit hun cassettes. </li><li> Op een tissue inbedding console systeem, plaats exemplaren in mallen gevuld met gesmolten paraffinewas. Ga verder met het inbedden van (deel 4). </li></ol></li><li> Voorbereiding voor het inbedden in bevroren blokken (Kawamoto&#39;s film methode) 43 <ol><li> Isoleer de bulla en de capsule zoals beschreven in paragraaf 1. </li><li> Snijd het voorste uiteinde van de bulla (styliform de werkwijze) met een schaar, dompel de bulla en capsule fixatief (2% of 1% PFA in plaats van 4% in PBS antigeniteit behouden) bij 4 ° C. Als zich lucht in bulla, verwijder deze dan met behulp van een naald en spuit. Laat de bulla en de capsule in het fixeermiddel bij 4 ° CO / N op een buis rotator. </li><li> Wassen bulla en capsule snel in PBS en onmiddellijk onderdompelen in vloeibare cryogene inbedding verbinding bij 4 ° C. </li><li> Belangrijk: Verwijder luchtbellen indien aanwezig in het middenen oorschelp door middel van aspiratie met een naald, en door toevoeging van de inbedding verbinding met een tang. Ga verder met het inbedden van (deel 4). </li></ol></li></ol> 4. Sample Orientation and Embedding LET OP: De gehele bulla en capsule moet worden geregeld in een bepaalde oriëntatie tijdens het inbedden om de gewenste secties te snijden. De hieronder beschreven procedures worden gebruikt om het gedeelte Malleus in verschillende richtingen. <ol><li> Longitudinale (parasagittal) afsnijden van de hamer <ol><li> Zet de zijkant van de bulla of externe gehoorgang in warme paraffine (of cryo-inbedding compound). Stel de oriëntatie zodat de nek en transversale lamina van de hamer evenwijdig aan de horizontale bodem van de inbedding schotel (Figuur 4A - C) zijn. Merk op dat het trommelvlies helt onder een hoek van ongeveer 30 ° met de verticaal in de muis kop (Figuur 4A Figuur 59 in Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Horizontale snijden van de hamer <ol><li> Leg de dorsale kam horizontaal in warme paraffine (of cryo-inbedding compound). Stel de oriëntatie van de bulla en capsule zodat de nek en transversale lamina van de hamer loodrecht op de bodem van de schotel inbedding (Figuur 4D - F). </li></ol></li><li> Frontale snijden (dwarsdoorsneden) van manubrium en trommelvlies 5 <ol><li> Plaats de malleal manubrium in warme paraffine (of cryo-inbedding compound) zodanig dat deze loodrecht op de bodem van de schotel insluiten. </li></ol></li><li> Afkoelen het blok tot temperaturen passend paraffine verharden op een tissue inbedding console-systeem (als alternatief, gebruik-cryo inbedding verbinding in een droog ijs / hexaan bad). </li><li> Proces weefsel blok en geslepen secties met behulp van routine procedures. Bijvoorbeeld, vlek paraffine secties met hematoxyline en eosine (H &amp; #38; E), safranine O (kraakbeen), of tartraat-resistent zuur fosfatase (TRAP) activiteit (voor osteoclasten) 3, of immunohistochemie. Ontkalkte vriescoupes zijn geschikt voor bot- etikettering gebruik fluorochromen 14, alizarine rood kleuring voor calcium en 42 immunofluorescentie. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een methode nuttig voor de auditieve bulla en capsule postnatale muizen te isoleren. Vóór P12, weefsels kwetsbaar en kan worden beschadigd tijdens isolatie. Na P12, kan de auditieve bulla en de capsule gemakkelijk worden geïsoleerd van de omliggende weefsels. Opheldering van de bulla van het hoofd voor het snijden heeft verschillende voordelen. Ten eerste postnatale cavitatie en groei van de auditieve bulla komen het meest actief van P6 verder en volledig door 50 P14. De mesenchymale weefsel tussen het trommelvlies en cochleaire wand wordt vervangen door lucht door de cavitatie proces. De resulterende lucht in het middenoor holte contact tussen weefsels en vloeistoffen tijdens fixatie, ontkalken en inbedding belemmeren. Het is gemakkelijker om de lucht uit de geïsoleerde auditieve bulla verwijderen door het afsnijden van het voorste einde (styliform proces) in plaats van te proberen om dit te doen in de ongeïsoleerde bulla. Ten tweede, oriëntatie van de Malleus (en het trommelvlies) is niet verticaalin het hoofd. Daarom is het makkelijker om het gedeelte Malleus in de gewenste vlakken door het inbedden van de geïsoleerde auditieve bulla en capsule in een bepaalde richting. Eenmaal geïsoleerd, auditieve bulla en capsules zijn geschikt voor talrijke analyses. Zo kan een hoge resolutie Röntgenstralen micro-CT bone microstructuur morfologie onthullen zoals osteogene capillairen in de hamer 14. De stereofluorescence ontleden microscoop is een krachtig hulpmiddel om structuren te visualiseren in de evaluatie van reporter muizen die fluorescerende eiwitten in het midden of binnenoor 33. Daarnaast zijn er diverse in vivo of ex vivo fluorescentie etikettering methoden en hele mount immunofluorescentie detectie kunnen worden ondernomen. Licht sheet fluorescentiemicroscopie is ook nuttig voor driedimensionale analyse 51. Hoewel hier niet beschreven, diverse anatomische structuren geassocieerd met de auditieve bulla en capsule zoals perifere zenuwen, bloedvaten enhet trommelvlies in het middenoor kan worden geëvalueerd met dit protocol. Merk op dat paraffine snijden vereist ontkalking van het bot weefsels voor het inbedden en dus niet de analyse van de mineralisatie mogelijk te maken. Daarentegen kan de Kawamoto filmmethode 43 gebruikt om ingevroren secties bereiden worden uitgevoerd zonder ontkalking en is geschikt voor mineralisatie studies met in vivo been labeling technieken of specifieke kleuringen zoals alizarine kleuring. Cryo-snijden voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd volgens op basis van de muis leeftijd. Zo wordt een minder koele temperatuur in de cryostaatkamer aanbevolen voor oudere muis specimens schade aan onderdelen te minimaliseren. In de muis, de juiste term voor de prominente semi-bolvormig uitsteeksel van de Malleus is &quot;orbicular apophysis&quot;. Toch is de term &quot;processus brevis&quot; wordt algemeen gebruikt om de circulaire apophysis meer th aangeveneen twee decennia, met name onder muis ontwikkelingsstoornissen biologen 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; oorspronkelijk verwezen naar de laterale proces (processus lateralis), die verschilt van de kringspieren apophysis. Bij mensen een laterale proces lijkt op een klein conisch uitsteeksel vormt de algemene regel van bevestiging aan het trommelvlies, zich vanaf het manubrium (niet gezien in figuur 6B, mediaal aanzicht). In muizen, de laterale proces is een projectie van het manubrium aan het andere uiteinde naar umbo 48. De pars flaccida van het trommelvlies is boven het laterale proces van de hamer. Orbicular apophysis is niet duidelijk in het menselijk hamer.

De drie gehoorbeentjes van het middenoor, namelijk de hamer, aambeeld en stijgbeugel, vormen een zoogdier-specifieke auditief keten die geluid uitzendt van het trommelvlies naar het binnenoor of cochlea 1,2. Hoorzitting functie kan in muizen worden geëvalueerd door het meten van BAER-test (ABR) drempelwaarden 3-6, en de trillingen van de hamer achter het trommelvlies kan worden gecontroleerd met behulp van Laser Doppler vibratiemeting (LDV) 7. Door het combineren van ABR, LDV en Distortion Product Otoakoestische Emission (DPOAE) metingen kan geleidende gehoorverlies te onderscheiden van perceptief impairment 8. Diermodellen van oor omstandigheden nodig, gezien het belang van het gehoor en gezondheid oor aan het welzijn van patiënten van alle leeftijden. Bijvoorbeeld otitis media is een veel voorkomende oorontsteking waargenomen bij humane zuigelingen en kinderen, en ernstige, acute otitis media en de complicaties kunnen optreden als de conditie is niet behandeld met geschikte antimicrobiële stoffen 9. Muismodellen van otitis media kan nuttig zijn bij het begrijpen van de pathogenese en in het ontwikkelen van behandelingen 10,11. Murine gehoorbeentjes, die (met uitzondering van de goniale deel van de hamer) gevormd door endochondrale ossificatie 12,13, zijn bijzonder relevant voor de studie van het botmetabolisme en morfogenese. Ten eerste, hun kleine formaat maakt hoge-resolutie analyse van de botten met een intacte beenvlies met X-ray of fluorescentiemicroscopie 14. Ten tweede, afwijkende botmetabolisme, zoals overmatige of deficiënte botresorptie of verminderde interacties tussen botcellen 15, kan worden opgevat als een mogelijke bijdrage aan gehoorverlies 3,4,7. Ten derde, abnormale beentje morfogenese wordt vermeld voor diverse gen-deficiënte muizen, zoals dieren ontbreken Hoxa2 16-19, 20-22 MSX1, Prrx1 23, Goosecoid(Gsc) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, schildklierhormoon receptoren (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 en anderen 1,31, of in muizen overexpressie Hoxa2 32. Tot slot, ondanks hun geringe omvang, structuren in verband met de gehoorbeentjes, zoals spieren en gewrichten 33 34,35 toegankelijk zijn. Muis gehoorbeentjes kleiner dan menselijke gehoorbeentjes, maar het is opmerkelijk dat de muis middenoor geen miniatuurversie van zijn menselijke tegenhanger. Bijvoorbeeld, in muizen, de stapediale slagader, die door de ring van de stijgbeugel geeft blijft gedurende het hele leven 36, terwijl bij de mens, de embryonale stapediale slagader verdwijnt tijdens de dracht. Bovendien, de morfologie van de muis hamer verschilt van die van de menselijk bot (zie figuur 6). Bij muizen, de auditieve (trommelvlies) bulla omsluit de met lucht gevulde middenoor holte, terwijl bij de mens, mastoideus luchtcellen bestaat uit trabeculair bot in het slaapbeen bevindt zich de gehoorbeentjes in plaats van een bulla 37. In beide soorten, de auditieve capsule (Otic capsule, knokige labyrint) omsluit het slakkenhuis en halfcirkelvormige kanalen van het binnenoor. Vergelijkende en evolutionaire biologie van het middenoor is uitgebreid beoordeeld 38-40. Het protocol voorzien hieronder eerst beschreven hoe te ontleden het auditieve bulla en de capsule, die voornamelijk bestaan ​​uit het middenoor en het binnenoor, respectievelijk. Dit protocol toont ook aan hoe de hamer, aambeeld en stijgbeugel van het auditieve bulla te isoleren. Tot slot, het laat zien hoe de auditieve bulla en de capsule te oriënteren voor het inbedden in de voorbereiding op het weefsel snijden van de gehoorbeentjes.

<table><tbody><tr><td>Hulpmiddelen/apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papierhanddoek</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Glazen pot</td><td>Verschillende</td><td></td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>14 cm chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Extra fijne schaar-recht</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Fijne tang hoekig 45&deg;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>voor routine dissectie</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>voor films&nbsp;</td></tr><tr><td>Injectienaald 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Markeerstift</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blad</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>voor Kawamoto's firm methode</td></tr><tr><td>Roestvrij stalen containers</td><td>Leica</td><td></td><td>voor Kawamoto's firm methode</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>voor Kawamoto's firm methode</td></tr><tr><td>Silane gecoate lade (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Matsunami</td><td></td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Weefselprocessor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Weefsel inbeddingsconsole systeem</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Schuifmicrotoom voor paraffine</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>Path Blade+pro voor hard weefsel</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>voor paraffine sectie</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4 12H2O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>voor Kawamoto's firm methode</td></tr><tr><td>Droogig</td><td>Verschillende</td><td></td><td>voor Kawamoto's firm methode</td></tr><tr><td>Hexaan</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>voor Kawamoto's firm methode</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>voor Kawamoto's firm methode</td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline&nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosine</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissectie van de auditieve bulla in postnatale muizen: isolatie van het middenoor botten en histologische analyse

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In de meeste zoogdieren gehoorbeentjes van het middenoor, zoals de hamer, aambeeld en stijgbeugel, zijn de kleinste botten. Bij muizen, een benige structuur genaamd de auditieve bulla herbergt de gehoorbeentjes, terwijl de auditieve capsule het binnenoor, namelijk het slakkenhuis en halfcirkelvormige kanalen omsluit. Murine gehoorbeentjes zijn essentieel voor het gehoor en dus van groot belang voor onderzoekers op het gebied van KNO, maar hun metabolisme, de ontwikkeling en evolutie zeer relevant zijn voor andere gebieden. Veranderde het botmetabolisme kan invloed hebben op het gehoor functie bij volwassen muizen, en diverse gen-deficiënte muizen vertonen veranderingen in de morfogenese van gehoorbeentjes in de baarmoeder. Hoewel muizen gehoorbeentjes zijn klein, hun manipulatie haalbaar is als men hun anatomische oriëntatie en 3D-structuur begrijpt. Hier beschrijven we hoe de auditieve bulla en de capsule van postnatale muizen ontleden en vervolgens te isoleren individuele gehoorbeentjes door een deel van de bulla verwijderen. We bespreken ook hoe je emhet bed van de bulla en de capsule in verschillende oriëntaties voor het genereren van paraffine of ingevroren secties geschikt zijn voor de bereiding van de lengterichting, horizontaal of frontale delen van de hamer. Tot slot noemen we anatomische verschillen tussen muis en mens gehoorbeentjes. Deze methoden zou nuttig zijn bij het analyseren van pathologische, ontwikkelings- en evolutionaire aspecten van de gehoorbeentjes en het middenoor bij muizen zijn.

Dit protocol geeft een methode om gehoorbeentjes van de muis auditieve bulla isoleren. Ten eerste, de bulla en capsule worden uitgesneden als één geheel uit de schedel (figuur 1). De ontlede bulla wordt dan gebruikt om de hamer (figuur 2) en het aambeeld en stijgbeugel (figuur 3) te bereiden. Bezienswaardigheden van de auditieve bulla en capsule zijn de styliform proces aan het voorste einde van de bulla, de dorsale kam, anterior halfronde kanaal, en de subarcuate fossa (Figuur 1F). Microcomputed tomografie (CT) beeldvorming openbaart gehoorbeentjes in het auditieve bulla en de optimale oriëntatie in de lengterichting en horizontaal snijden van de gehoorbeentjes (figuur 4). Longitudinale paraffine snijden van de hamer, de bulla en capsules werden ontkalkt in EDTA bij 4 ° C gedurende één week, ingebed in een paRaffin blok aan de in figuur 4 A oriëntatie - C, coupes 4 urn en gekleurd met H &amp; E. De hamer bevestigd aan het trommelvlies in het auditieve bulla geopenbaard lopende endochondrale ossificatie bij P14 (figuur 5A). Om vorming van nieuw bot te visualiseren, werd calceïne (30 ug / g lichaamsgewicht) peritoneaal geïnjecteerd in een P20 muis en bulla en capsule werden 24 uur later geïsoleerd op P21. Het monster werd ingevroren zonder ontkalking ingesloten en vervolgens cryosectioned op 6 pm met een zelfklevende film naar de wijze van Kawamoto 43. Na nucleaire kleuring met DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool), werd de sectie waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Calceïne signalen (groen) toonde nieuwe botvorming in de hamersteel (m), bulla en capsule (figuur 5B). Voor horizontale afsnijden van de hamer, werd de auditieve bulla geïsoleerd uit een 5 weken oude muizen ingevroren ingebedde zonder ontkalking (voor deoriëntatie zie Figuur 4D - F), cryosectioned op 6 micrometer met behulp van de Kawamoto methode en gekleurd met H &amp; E. Horizontale snijden van de malleal processus brevis (MPB) toont ook het slakkenhuis (figuur 5C). Een mediale zicht op de juiste gehoorbeentjes geïsoleerd uit een P31 muis toont typische kenmerken van de muis Malleus, namelijk de &#39;glijdende-meeuw-vleugel-achtige &quot;(of Perzisch zwaard-achtige 45) manubrium, een prominente processus brevis (orbicular apophysis zie Discussie) en de transversale lamina (figuur 6). Merk op dat de voorste proces (processus anterior) werd gebroken in de dissectie procedure rond de goniale en is gescheiden van de tympanische ring (ectotympanic). Deze representatieve steekproef vertoont een intacte incudomalleolar verbinding tussen de hamer en aambeeld, terwijl de incudostapedial gewricht is uit de kom. Tendineuze inserties in de malleal enstapediale gespierde processen detecteerbaar zijn (Figuur 6A, sterretjes). Figuur 6B vergelijkt muizen en mensen gehoorbeentjes bij dezelfde vergroting. Species verschillen, anders dan de grootte, zijn de volgende. De malleal manubrium is wing-achtige bij muizen, maar club-achtige bij de mens. De hoek tussen de anatomische as (of de rotatieas, de lijn door de voorste proces van de hamer en de korte werkwijze volgens de incus) en het manubrium veel kleiner in muizen en de twee nagenoeg evenwijdige, tegenover bijna loodrechte bij mensen 6,46-48. In de menselijke gehoorbeentjes, vibrometric studies blijkt dat de incudo-malleolaire gewricht is mobiel in plaats van functioneel vaste 49. De muis Malleus vertoont een brede, dunne, en platte transversale lamina niet duidelijk bij de mens 47. In muizen, de processus voorste zekeringen membraneuze botten, namelijk de goniale en tympanic ring, terwijl bij mensen het processus anterior wordt gereduceerd tot een kleine spicule been 41. De stijgbeugel van muizen en mensen verschilt ook: in muizen, de voorste crus is gebogen en het achterste crus is meer rechttoe, terwijl bij de mens, de voorste crus is meer recht dan het achterste crus. Het is vermeldenswaard dat de Malleus hoofd in verhouding tot lichaamslengte massaal wordt vergroot in soorten, zoals de goudmollen, waaruit blijkt significante variabiliteit in allometrische relaties van de &quot;kleinste&quot; botten 48. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Figuur 1. Dissectie van de auditieve Bulla en Capsule. (A) De schedel van een P31 muis is verdeeld in rechter en linker helften. A, anterior; P, posterior; L, links; R, rechts. (B) mediale oppervlak van de rechter helft van de doorsneden, gevild hoofd. Cx, cerebrale cortex; Cb, cerebellum; Bs, brainstem. D, dorsale; V, ventrale. (C) Verwijdering van hersenen met een tang. (D) mediale Gezien de auditieve capsule op de juiste schedel. De dorsale kam (pijlpunten) ligt tussen de middelste schedelgroeve (MCF) en posterior schedelgroeve (PCF) en scheidt dorso-anterieure en ventro-posterior oppervlakken van de auditieve capsule. Schaal bar, 2 mm. (E) een hogere vergroting van de auditieve bulla en capsule (mediale view). Co, slakkenhuis; VII, gezichtszenuw; VIII, nervus vestibulocochlearis; AC, anterior (superior) halfronde gracht; Sf, subarcuate fossa, die de cerebellaire paraflocculus herbergt. Schaal bar, 1 mm. (F) Deze coupe van geïsoleerde auditieve bulla en capsule (mediale view). Sp, styliform proces. Schaal bar, 1 mm. (A - E), P31 muis. (F), P33 muizen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Figuur 2. Dissectie van de Malleus. (A) ventrolaterale weergave van een recht auditieve bulla en capsule. De sulcus tympanicus (ST, gestippelde pijl) is de bevestigingsplaats van het trommelvlies. Het bot lateraal van de ST is onderdeel van het uitwendige oor en het bot mediaal van de ST vormt de bodem van het middenoor holte. A, anterior; P, posterior; D, dorsale; V, ventrale. (B) Uitzicht na verwijdering van de uitwendige gehoorgang het trommelvlies (TM) omvattende de pars flaccida (Pf) en pars tensa (Pt) onthullen. (C) Het verwijderen van delen van het trommelvlies bot (stippellijnen en #) in de buurt van de malleal processus brevis (MPB). m, hamer; mM, malleal manubrium. Pijl, luchtbel in het middenoor holte gezien door het trommelvlies. (D) Exposed hamer. Malleus hoofd is aangegeven. stippellijn geeft de articulaire oppervlak van de incus. (E) pees van de musculus tensor tympani (TT) bevestigd aan de hamer. (F) Het tensor tympani wordt getrokken wanneer de Malleus wordt opgeheven. *, Gespierde proces. (G) Tensor tympani wordt gesneden met behulp van een naald. (H) Drie gehoorbeentjes na verwijdering van het trommelvlies. De incudo-malleolaire gewricht is uit de kom. m, hamer; i, aambeeld; s, stijgbeugel; Go, goniale (gefuseerd met de hamer en trommelvlies ring, TR). Alle schaal bars, 0,5 mm. (A, H), P33 muizen. (B - G), P31 muis. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Figuur 3. Dissection van de Incus en Stapes. (A) en Incusstijgbeugel na verwijdering van de hamer. De stapediale slagader (SA) gaat door de stijgbeugel (s). Stippellijn geeft het articulaire oppervlak van de incus. Merk op dat de korte crus (ICB, crus breve) van de incus (i) wordt bepaald door de achterste ligament (niet getoond). Asterisk, gespierde proces van de stijgbeugel. (B) stapes na verwijdering van de incus. Naaldtip wordt gebruikt om de stapediale slagader (SA) gesneden. Pijl richting van de bloedstroming. Stippellijn geeft articulaire oppervlak van de stijgbeugel. (C) De stapediale slagader wordt uit de stijgbeugel. X is het afgesneden uiteinde van de stapediale slagader (SA). (D) De ovale venster (Ow, Fenestra ovalis of fenestra vestibuli) zichtbaar is na verwijdering van de stijgbeugel. Rw, ronde venster (fenestra rotonde of Fenestra cochleae). Schaalbalken 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze foto</a>figuur. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Figuur 4. oriënteren van de Auditieve Bulla en Capsule tijdens insluiten voor Longitudinaal (parasagittal, A - C) en horizontale (D - E) Snijden van de Malleus. (A - C) De hals en transversale lamina van de hamer evenwijdig geplaatst aan de bodem van inbedding schaal. (A) Zijaanzicht: micro-CT afbeelding om inbedding van de rechter hamer in de bulla (pseudocolored blauw) te tonen. De hamer en aambeeld zijn pseudocolored groen. Binnen de stippellijn, de gewenste snijvlak. Ononderbroken lijn, onderkant van het inbedden schotel. m, hamer; pijlpunten, dorsale kuif. M, mediale; L, laterale; D, dorsale; V, ventrale. (B) Bovenaanzicht: het Micro-CT. Merk op dat het voorste uiteinde van de bulla (styliform proces) verwijderd. i, incus. (C) Bovenaanzicht: microfoto (genomen met eenkleurfilter). AC, anterior (superior) halfronde gracht; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform proces. A, anterior; P, posterior; D, dorsale; V, ventrale. (D - F) De processus brevis van de malleus is geplaatst loodrecht op de bodem van inbedding schaal. (D) Zijaanzicht: afbeelding Micro-CT om inbedding van de juiste hamer te laten zien. Binnen de stippellijn, de gewenste snijvlak. Ononderbroken lijn, onderkant van het inbedden schotel. (E) Bovenaanzicht: het Micro-CT. mM, malleal manubrium. (F) Bovenaanzicht: microfoto (genomen met een kleurfilter). Schaalbalken, 1 mm. Micro-CT-beelden werden verkregen bij een voxel resolutie van 5 urn, zoals eerder beschreven 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> FIGUUR 5. Histologie. (A) H &amp; E-kleuring. Longitudinale (parasagittal) sectie van de paraffine ingebedde recht Malleus (m) in de auditieve bulla (stippellijn) op P14. TM, trommelvlies. (B) calceïne bot labeling. Langsdoorsnede van de bevroren, ontkalkte linker hamer (m) in het auditieve bulla bij P21. Tegenkleuring, DAPI. (C) H &amp; E-kleuring. Horizontale doorsnede van de bevroren, ontkalkte linker malleal processus brevis (MPB) in het auditieve bulla en capsule (5 weken oude muis). Co, slakkenhuis. Schaalbalken, 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Figuur 6. Mediale View of gehoorbeentjes. (A) Recht gehoorbeentjes van P31 muis. A, anterior; P, posterior; D, dorsale; V, ventrale. Schaal bar, 1 mm. Malleus hoofd (Caput mallei, Capitulum mallei); hals (Collum mallei); lamina (transversale lamina); mM (Manubrium mallei); zwarte asterisk (gespierde proces van de hamer); MPa (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); incus lichaam (Corpus incudis); ICB (Crus breve, korte crus, kort proces); ICL (Crus longum, lange crus, lang proces); IPL (Processus lenticularis, lenticular proces, Sylvian apophysis); stijgbeugel hoofd (Caput stapedis); witte asterisk (gespierde proces van de stijgbeugel); SCA (Crus anterius, anterior crus); SCP (Crus posterius, posterior crus); base (Basis stapedis, voetplaat); SOF (obturator foramen, intercrural foramen). (B) Rechter gehoorbeentjes van een 76-jarige menselijke vrouwelijke (Met dank van de afdeling Anatomie, Keio University School of Medicine). De gehoorbeentjes van P31 muis (rechtsonder) worden afgebeeld op dezelfde vergroting als die gebruikt voor menselijke gehoorbeentjes. Curved pijlen geven de hoek tussen de anatomische as en de manubrium (stippellijnen). Schaal bar, 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We presenteren een protocol om de auditieve bulla, capsule en gehoorbeentjes te isoleren van postnatale muizen voor gehele montage en histologische analyse.

Dissectie van de auditieve Bulla in postnatale muizen: Isolatie van het middenoor botten en histologische analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Het algemene doel van de dissectieprocedure is om de auditieve bulla en capsule te isoleren, gevolgd door de individuele gehoorbeentjes van postnatale muizen voor verschillende geheel-mount en histologische analyses. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het veld van wondbiologie aan te pakken, zoals mechanismen van slechte morfogenese, enchondrale ossificatie of slecht mineraalmetabolisme. Deze methode is gebaseerd op diepgaande kennis van anatomische details.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in de muis als biologisch systeem worstelen, omdat hun kennis van het menselijk middenoor mogelijk niet van toepassing is op de muis-tegenhanger. De procedure wordt gedemonstreerd door Ayako Sakamoto, een technicus in mijn laboratorium. Begin door de auditieve bulla en capsule met omliggend schedelbot in een specimenbak met fosfaat-gebufferde zoutoplossing pH 7,4 bij kamertemperatuur te plaatsen.Onder een binoculaire dissectiemicroscoop identificeren we de schedelbotten rond de auditieve capsule zoals hier getoond. Gebruik een set pincetten om de omliggende schedel vast te grijpen en een tweede set om het basisfenoïde en het occipitale bot weg te trekken. Gebruik vervolgens de pincetten om voorzichtig de interpariëtale en pariëtale botten van de capsule te trekken en te verwijderen wanneer ze volledig los zitten.Trek vervolgens het squamosale weg van de bulla en capsule en verwijder voorzichtig het bot en de zachte weefsels. Grijp vervolgens het buitenoor en draai het specimen om de mediale kant te onthullen. Draai vervolgens het specimen 180 graden, pak de capsule en verwijder de resterende zachte weefsels.De dorsale kam is nu zichtbaar. Op deze hoek zijn de faciale en vestibulo-cochleaire zenuwen in de interne gehoorgang, fossa subarcuata en voorste halfcirkelvormige kanaal duidelijk zichtbaar. Wanneer de dorsale kam naar de bodem van de dissectieschaal is gedraaid, is de auditieve bulla duidelijk te zien.Als de voorbereiding licht wordt gedraaid, is de hamer zichtbaar binnen de bulla. Begin met het gebruik van pincetten om de externe gehoorgang te breken boven de hamer en lateraal aan de sulcus tympanicus. Maak een tweede breuk voor de eerste.Vervolgens verwijdert u het stuk externe gehoorgang zodat het trommelvlies zichtbaar is. Verwijder vervolgens een deel van het trommelvlies en het tympanische bot nabij de processus brevis van de hamer zowel aan de ventrale als achterste wanden. De hamer, aambeeld, stijgbeugel en tensor tympani-spier zouden nu zichtbaar moeten zijn.Til de hamer op en snijd het tensor tympani-spier met de afgeschuinde rand van een 27 gauge naald. Merk op dat de hamerhandgreep stevig bevestigd is aan het trommelvlies, zoals bij andere zoogdieren. Ontkoppel de hamer van het aambeeld op de ossiculaire gewricht door de voorste processus van de hamer bij de goniale te breken.Isoleer de hamer van de auditieve bulla met behulp van pincetten. Verwijder het grootste deel van de auditieve bulla om het aambeeld en de stijgbeugel bloot te leggen. Gebruik vervolgens de afgeschuinde rand van een 27 gauge naald om het achterste ligament van het aambeeld bij de korte kam af te snijden.Isoleer het aambeeld met behulp van pincetten. Snijd de arteria stapedia met de afgeschuinde rand van een 27 gauge naald nabij de stijgbeugel af. Draai het monster zodat het ronde venster op de bodem is gepositioneerd.Breng vervolgens een naainaald in het obturator foramen van de stijgbeugel in en til de stijgbeugel op. Na het verwijderen van de stijgbeugel zou de opening van het ovale venster duidelijk zichtbaar moeten zijn. Gebruik de 27 gauge naald om de stijgbeugel van de naainaald te duwen.Om met weefsel-inbedding te beginnen, gebruikt u eerst schaar om de styliforme processus af te snijden aan het voorste uiteinde van de bulla. De hamer en dorsale kam zijn zichtbaar door de gesneden portie. Dompel de bulla en capsule in 1-2% paraformaldehyde in PBS.Als er lucht in de bulla is gevangen, verwijder deze met een naald en spuit. Laat de bulla en capsule in de fixeervloeistof bij vier graden Celsius overnacht op een buisrotator. De volgende dag wast u de bulla en capsule snel in PBS.Dompel het vervolgens onmiddellijk in vloeibaar cryo-inbeddingscompound bij vier graden Celsius. Het is gebruikelijk dat er luchtbellen ontstaan in het cryo-inbeddingscompound op het niveau van het midden- en buitenoor. Verwijder de luchtbel uit het middenoor door middel van aspiratie door een naald.Gebruik dezelfde techniek voor de luchtbel in het buitenoor. Zodra alle luchtbellen zijn verwijderd, oriënteert u het weefsel volgens het type secties dat moet worden verkregen. Het weefsel kan vervolgens in bevroren blokken worden ingebed voordat het wordt gesneden.Deze afbeelding toont H en E-kleuring van een longitudinale paraffinesectie van decalcificeerd hamer, aangegeven met de letter M, en de auditieve bulla en capsule van een P14 muis. Het trommelvlies wordt aangegeven met de letter TM. Deze afbeelding toont calciumbotkleuring van een longitudinale sectie van bevroren, ondecalcificeerd hamer, aangegeven met de letter M, en de auditieve bulla van een P21 muis. Calciumgroene signalen onthullen nieuwe botvorming in de hamer, bulla en capsule.Eenmaal de techniek onder de knie is, kunnen de auditieve bulla en de capsule in tien minuten worden geïsoleerd als de procedure correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de anatomische oriëntaties van de gehoorbeentjes en bulla in de muis, zoals beschreven in de hoofdtekst.

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Er bestaan verschillende methoden voor het introduceren van ototoxische middelen in de slakken van diermodellen. Hier wordt een chirurgisch protocol gepresenteerd voor het toedienen van ototoxische middelen in de ronde venster nis. De procedure is betrouwbaar, creëert gerichte intra-cochleaire laesies en voorkomt mechanische schade aan de microarchitectuur. Onderzoek naar zelfherstel/regeneratie van de cochlea is mogelijk.

De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

Twee microchirurgiebenaderingen voor lokale medicijntoediening aan het binnenoor worden hier beschreven en vergeleken in termen van impact op gehoorparameters, cochleaire cytoarchitectuur en expressie van inflammatoire markers.

Een vergelijkende studie van Drug Delivery Methoden Gericht op de Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een effectieve methode om decellularize en decalcify van muis cochleae voor gebruik als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.

Een Protocol voor Decellularizing muis Cochleae voor binnenoor Tissue Engineering

Dierlijke modellen van cochleaire implantaten kunnen vooraf kennis van de technologische grondslagen voor de behandeling van permanente perceptief gehoorverlies met elektrische stimulatie. Deze studie geeft een chirurgische protocol voor acute oorverdovend en cochleaire implantatie van een elektrodenserie in muizen, alsmede de beoordeling van de functionele met auditieve brainstem response.

Cochleair implantaatchirurgie en elektrisch opgeroepen auditieve Brainstem Response opnamen in C57BL/6 muizen

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.

Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, zuivering en kweek van primaire marginale cellen uit de muis stria vascularis, en voor het opstellen van in vitro modellen van oxidatieve stress en cellulaire senescentie om cochleaire laterale wandaandoeningen te bestuderen.

Isolatie en kweek van primaire marginale cellen van de stria vascularis uit neonatale muizen

Leer de dissectie van de auditieve bulla bij postnatale muizen voor histologische analyse van het middenoor. Deze methode is essentieel voor onderzoek naar wondbiologie en botvorming.

Dissectie van de auditieve Bulla in postnatale muizen: Isolatie van het middenoor botten en histologische analyse

Meer video's verkennen