Dissectie van de auditieve Bulla in postnatale muizen: Isolatie van het middenoor botten en histologische analyse

Het algemene doel van de dissectieprocedure is om de auditieve bulla en capsule te isoleren, gevolgd door de individuele gehoorbeentjes van postnatale muizen voor verschillende geheel-mount en histologische analyses. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het veld van wondbiologie aan te pakken, zoals mechanismen van slechte morfogenese, enchondrale ossificatie of slecht mineraalmetabolisme. Deze methode is gebaseerd op diepgaande kennis van anatomische details.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in de muis als biologisch systeem worstelen, omdat hun kennis van het menselijk middenoor mogelijk niet van toepassing is op de muis-tegenhanger. De procedure wordt gedemonstreerd door Ayako Sakamoto, een technicus in mijn laboratorium. Begin door de auditieve bulla en capsule met omliggend schedelbot in een specimenbak met fosfaat-gebufferde zoutoplossing pH 7,4 bij kamertemperatuur te plaatsen.

Onder een binoculaire dissectiemicroscoop identificeren we de schedelbotten rond de auditieve capsule zoals hier getoond. Gebruik een set pincetten om de omliggende schedel vast te grijpen en een tweede set om het basisfenoïde en het occipitale bot weg te trekken. Gebruik vervolgens de pincetten om voorzichtig de interpariëtale en pariëtale botten van de capsule te trekken en te verwijderen wanneer ze volledig los zitten.

Trek vervolgens het squamosale weg van de bulla en capsule en verwijder voorzichtig het bot en de zachte weefsels. Grijp vervolgens het buitenoor en draai het specimen om de mediale kant te onthullen. Draai vervolgens het specimen 180 graden, pak de capsule en verwijder de resterende zachte weefsels.

De dorsale kam is nu zichtbaar. Op deze hoek zijn de faciale en vestibulo-cochleaire zenuwen in de interne gehoorgang, fossa subarcuata en voorste halfcirkelvormige kanaal duidelijk zichtbaar. Wanneer de dorsale kam naar de bodem van de dissectieschaal is gedraaid, is de auditieve bulla duidelijk te zien.

Als de voorbereiding licht wordt gedraaid, is de hamer zichtbaar binnen de bulla. Begin met het gebruik van pincetten om de externe gehoorgang te breken boven de hamer en lateraal aan de sulcus tympanicus. Maak een tweede breuk voor de eerste.

Vervolgens verwijdert u het stuk externe gehoorgang zodat het trommelvlies zichtbaar is. Verwijder vervolgens een deel van het trommelvlies en het tympanische bot nabij de processus brevis van de hamer zowel aan de ventrale als achterste wanden. De hamer, aambeeld, stijgbeugel en tensor tympani-spier zouden nu zichtbaar moeten zijn.

Til de hamer op en snijd het tensor tympani-spier met de afgeschuinde rand van een 27 gauge naald. Merk op dat de hamerhandgreep stevig bevestigd is aan het trommelvlies, zoals bij andere zoogdieren. Ontkoppel de hamer van het aambeeld op de ossiculaire gewricht door de voorste processus van de hamer bij de goniale te breken.

Isoleer de hamer van de auditieve bulla met behulp van pincetten. Verwijder het grootste deel van de auditieve bulla om het aambeeld en de stijgbeugel bloot te leggen. Gebruik vervolgens de afgeschuinde rand van een 27 gauge naald om het achterste ligament van het aambeeld bij de korte kam af te snijden.

Isoleer het aambeeld met behulp van pincetten. Snijd de arteria stapedia met de afgeschuinde rand van een 27 gauge naald nabij de stijgbeugel af. Draai het monster zodat het ronde venster op de bodem is gepositioneerd.

Breng vervolgens een naainaald in het obturator foramen van de stijgbeugel in en til de stijgbeugel op. Na het verwijderen van de stijgbeugel zou de opening van het ovale venster duidelijk zichtbaar moeten zijn. Gebruik de 27 gauge naald om de stijgbeugel van de naainaald te duwen.

Om met weefsel-inbedding te beginnen, gebruikt u eerst schaar om de styliforme processus af te snijden aan het voorste uiteinde van de bulla. De hamer en dorsale kam zijn zichtbaar door de gesneden portie. Dompel de bulla en capsule in 1-2% paraformaldehyde in PBS.

Als er lucht in de bulla is gevangen, verwijder deze met een naald en spuit. Laat de bulla en capsule in de fixeervloeistof bij vier graden Celsius overnacht op een buisrotator. De volgende dag wast u de bulla en capsule snel in PBS.

Dompel het vervolgens onmiddellijk in vloeibaar cryo-inbeddingscompound bij vier graden Celsius. Het is gebruikelijk dat er luchtbellen ontstaan in het cryo-inbeddingscompound op het niveau van het midden- en buitenoor. Verwijder de luchtbel uit het middenoor door middel van aspiratie door een naald.

Gebruik dezelfde techniek voor de luchtbel in het buitenoor. Zodra alle luchtbellen zijn verwijderd, oriënteert u het weefsel volgens het type secties dat moet worden verkregen. Het weefsel kan vervolgens in bevroren blokken worden ingebed voordat het wordt gesneden.

Deze afbeelding toont H en E-kleuring van een longitudinale paraffinesectie van decalcificeerd hamer, aangegeven met de letter M, en de auditieve bulla en capsule van een P14 muis. Het trommelvlies wordt aangegeven met de letter TM. Deze afbeelding toont calciumbotkleuring van een longitudinale sectie van bevroren, ondecalcificeerd hamer, aangegeven met de letter M, en de auditieve bulla van een P21 muis. Calciumgroene signalen onthullen nieuwe botvorming in de hamer, bulla en capsule.

Eenmaal de techniek onder de knie is, kunnen de auditieve bulla en de capsule in tien minuten worden geïsoleerd als de procedure correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de anatomische oriëntaties van de gehoorbeentjes en bulla in de muis, zoals beschreven in de hoofdtekst.