Cryosectioning aaneengesloten Regio's van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses
12 december 2016
Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.
Het algemene doel van deze procedure is om analyse van histologische en moleculaire parameters mogelijk te maken van aangrenzende secties van een enkel weefsel. Met deze methode kunnen we helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van de biologie en ziekte van skeletspieren. Zoals, wat zijn de regeneratieve effecten na spierletsel, en wat zijn de effecten van virale genoverdracht door intramusculaire injectie?
Het voordeel van deze methode is dat histologische en moleculaire gegevens direct gecorreleerd kunnen worden van een enkel weefsel. Dat maakt effectievere gegevensanalyse en beter gebruik van experimenteel weefsel mogelijk. Vijf minuten voor het voltooien van de dissecties, koel het cryopreserveringsbad.
Wanneer de weefselmonsters klaar zijn om ingebed te worden, breng eerst inbeddingshars aan op het onderste derde tot de helft van het weefsel, waar de spier de kurk ontmoet. Dit moet netjes gebeuren om harsinterferentie met de downstream stappen te verminderen. Daarna, laat de kurk onmiddellijk vallen in het 2-Methylbutaanbad gekoeld tot min 140 graden Celsius.
Neem tot acht weefselpreparaten per batch op. In het bad, roer de weefsels gedurende 30 seconden, krab de bodem van de beker om te voorkomen dat de weefselkurken in de oplossing bevriezen. Na 30 seconden, trek met een metalen gereedschap een weefselkurk uit de 2-Methylbutaan.
Verwijder vervolgens snel het ondersteunende deksel. Dep het overtollige 2-Methylbutaan terug in het bad en laat vervolgens de weefselkurk in het buitenste stikstofbad vallen. Nadat alle weefsels in het vloeibare stikstof zijn overgebracht, verplaats ze naar een container en bewaar ze op min 80 graden Celsius.
Na het voorbereiden van de cryostaat en het monteren van een weefselmonster, gebruik de grove en fijne bedieningselementen om het monster naar de mes te laten oprukken tot het het mes raakt. Reset het totaal van de sectiedikken op dit punt op nul. Stel vervolgens de cryostaat in op de trimfunctie met een sectiedikte van 30 microns.
En snijd secties af tot de gewenste weefseldiepte. Om cryosecties efficiënt te verzamelen voor RNA-extractie, open eerst de verzamelbuis en plaats deze dicht bij de mesdrager. Gebruik daar een voorgekoelde, schone borstel om elke sectie op te nemen en deze naar de buis over te brengen.
Gepoolde 30-micron muis tibialis anterior secties genomen van 400 tot 4.000 micron weefseldiekte leveren typisch 25 tot 50 milligram spier op. Als inbeddingshars de cryosectie omringt, zet de handrem vast en gebruik een scheermes om kleine stukjes hars eraf te scheren tot er slechts een dunne laag rond de bovenkant van de spier aanwezig is. Snijd altijd hars met het mes in de richting van de spier weg.
Een dunne laag inbeddingshars belemmert de downstream RNA-extractie niet substantieel. Als dikkere inbeddingshars aanwezig is, gebruik borstels om deze van de spier te verwijderen voordat de cryosectie in de verzamelbuis wordt gebracht. Tijdens het sectieproces, wanneer histologische secties gewenst zijn, stel de snededikte opnieuw in op zeven micron met behulp van de cryostaatbedieningselementen.
Snijd vervolgens en gooi vier tot zeven secties af om een consistente, gelijkmatige weefseloppervlakte te verkrijgen en noteer deze weefseldiekte. Snijd nu een goede sectie en oriënteer deze op het oppervlak van de mesdrager. Gebruik een microscoopglaasje op kamertemperatuur om de sectie op te nemen en breng het glaasje terug naar kamertemperatuur.
Verzamel alle gewenste secties en noteer vervolgens de uiteindelijke weefseldiekte. Nadat de sectie is voltooid, noteer snel het gewicht van de gepoolde cryosecties voor RNA-isolatie. Breng de buis onmiddellijk terug naar de cryostaatkamer om de temperatuur van de secties rond de min 20 graden Celsius te houden.
Begin door de gepoolde cryosecties snel over te brengen naar ijs en voeg ongeveer één milliliet organisch RNA-extractiemiddel toe per 50 milligram cryosecties. Hoe eerder het reagens wordt toegepast, hoe minder de RNA degradeert. Gebruik vervolgens een spuit van één milliliter met een 18-gauge naald om de cryosecties te homogeniseren zonder te veel bellen te maken door herhaaldelijk een oplossing op te trekken en deze op de buiswanden uit te spuiten.
Gebruik de naaldpunt om verklumpte stukken te verspreiden. Na elke vijf slagen, breng het monster kort terug naar het ijs om het koel te houden. Eenmaal gehomogeniseerd, gebruik een 22-gauge naald om het monster voorzichtig te trituren met vijf extra slagen.
Breng vervolgens het monster terug naar het ijs. Herhaal dit proces drie of vier keer om een zeer fijn verspreide weefselhomogeniteit te verkrijgen. Zodra het uiteindelijke homogenaat is gemaakt, laat het vijf minuten op kamertemperatuur incuberen om moleculaire complexen te verstoren.
Voeg vervolgens in een afzuigkap 0,1 milliliter BCP toe per milliliter RNA-isolatiereagens. Schud vervolgens de buis krachtig gedurende 15 seconden. Gebruik geen vortex.
Incubeer vervolgens het monster gedurende twee tot drie minuten op kamertemperatuur. Na de korte incubatie, centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000g en vier graden Celsius. Verzamel vervolgens voorzichtig de heldere bovenste fase die het RNA bevat.
Breng het over naar een schone buis en voeg een gelijk volume van 70% ethanol toe, gemaakt in diep zeewater. Na kort te hebben gevormd, laat het 10 minuten op kamertemperatuur incuberen en volg vervolgens het tekstprotocol. RNA-preparaten van skeletspieren werden gemaakt van de muis tibialis anterior.
Drie dagen eerder werden sommige spieren geïnjecteerd met 10 micromolar cardiotoxine en andere met zoutoplossing. De zuiverheid en opbrengst van het RNA uit deze monsters was uitstekend. De RNA-opbrengst was aanzienlijk hoger in tibialis anterior spieren na toxineletsel.
Weefselintegriteit en RNA-productie
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze procedure maakt het mogelijk om histologische en moleculaire parameters te analyseren uit aangrenzende secties van één enkel weefsel, specifiek skeletspierweefsel van muizen. Het faciliteert de correlatie tussen histologische en moleculaire gegevens, waardoor de data-analyse en het gebruik van experimentele weefsels worden verbeterd.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Skeletspieronderzoek
Achtergrond
- Opeenvolgende cryosneden worden verzameld voor histologische toepassingen.
- RNA-verrijking voor genexpressiemetingen wordt uitgevoerd met aangrenzende regio's.
- RNA van hoge kwaliteit wordt verkregen uit gepoolde cryosneden.
- Deze methode maakt een directe vergelijking tussen verschillende toepassingen mogelijk.
Doel van de studie
- Om regeneratieve effecten na spierletsel te analyseren.
- Om de effecten van virale genoverdracht via intramusculaire injectie te onderzoeken.
- Om histologische en moleculaire gegevens uit één enkel weefsel te correleren.
Gebruikte methoden
- Cryopreservering van weefselmonsters.
- Verzamelen van opeenvolgende cryosneden.
- RNA-extractie uit samengevoegde cryosneden.
- Histologische analyse van aangrenzende weefselsneden.
Belangrijkste resultaten
- Hoogwaardig RNA kan worden verkregen uit 20 - 30 mg samengevoegde cryosecties.
- Histologische en moleculaire gegevens kunnen effectief met elkaar worden gecorreleerd.
- De methode verbetert de analyse van experimentele weefsels.
- Kernvragen in de biologie van skeletspieren kunnen worden beantwoord.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuuste benadering voor het bestuderen van de spierbiologie.
- Het maakt een effectieve data-analyse mogelijk vanuit een enkele weefselbron.
- Toekomstige studies kunnen deze methode benutten voor diepgaandere inzichten in spierregeneratie en genoverdracht.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Deze methode maakt een directe correlatie mogelijk tussen histologische en moleculaire gegevens van aangrenzende secties skeletspierweefsel, waardoor de experimentele onzekerheid en het aantal gebruikte dieren in discovery-workflows worden verminderd. Door de RNA-opbrengst uit kleine weefselmonsters te verbeteren via het poolen van cryosecties en homogenisatie met een naald, ondersteunt deze methode de validatie van targets en het mechanistisch verminderen van risico's in vroegstadiummodellen voor musculoskeletale aandoeningen. De aanpak vergroot de voorspellende betrouwbaarheid door fenotypische observaties te koppelen aan veranderingen in genexpressie binnen hetzelfde biologische systeem.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door histopathologische letselmarkers te correleren met veranderingen in genexpressie in hetzelfde weefsel.
- Operationele waarde: Vermindert de noodzaak voor herhaalde dierproeven door matchende histologie- en moleculaire gegevens te verkrijgen uit één enkele skeletspier.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het beperken van risico's bij target-identificatie via afgestemde fenotypische en moleculaire read-outs, wat het vertrouwen in de interpretatie van het ziektemechanisme verhoogt.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt gestandaardiseerde weefselpreparatie voor downstream RNA-extractie, waardoor consistente genexpressieprofilering over verschillende experimentele condities mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Faciliteert de gereedheid van assays door homogene lysaten te genereren uit samengevoegde cryosneden, geschikt voor qPCR- of sequencing-workflows.
- Schaalbaarheid: Maakt de verwerking van meerdere weefsels per batch mogelijk met behulp van een cryostaat, wat medium-throughput discovery-applicaties ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt een naadloze overgang mogelijk van ontdekkingshistologie naar moleculaire validatie met behulp van aangrenzende weefselregio's, waardoor de correlatie van biomarkers wordt versterkt.
- Relevantie van preklinische modellen: Ondersteunt de evaluatie van regeneratieve responsen en effecten van gentherapie in letselmodellen door middel van overeenkomstige structurele en moleculaire analyse.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Verbetert go/no-go-beslissingen door de variabiliteit te verminderen tussen histologische en moleculaire eindpunten die uit hetzelfde monster zijn afgeleid.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm door hypothese-gestuurde analyse van de biologie van skeletspieren mogelijk te maken, waarbij histologische screening de moleculaire follow-up vanuit dezelfde weefselbron informeert.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en doelwitvalidatie door structurele fenotypes (bijv. fibrose, regeneratie) te koppelen aan transcriptionele responsen in aangrenzende secties.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde pools van cryosneden die dienen als reproduceerbare inputs voor RNA-extractie en downstream analytische assays.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metrieken voor RNA-opbrengst en -kwaliteit die vergelijking tussen behandelingsgroepen en experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt histopathologische letselscores met moleculaire signaturen van regeneratie of genoverdracht, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor weefselpreparatie dat toepasbaar is op meerdere skeletspieren en ziektemodellen, waardoor redundante protocolontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door biologische ruis te verminderen via overeenkomstige histologische en moleculaire gegevens uit identieke weefselregio's.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via pooling van cryosneden en gecontroleerde homogenisatie met een naald, waardoor technische variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de dataopbrengst per dier te maximaliseren, waardoor de behoefte aan replicatiestudies in campagnes voor target-validatie wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk door concordant fenotypisch en moleculair bewijs, wat het risico op falen in een laat stadium door mechanische misuitlijning verlaagt.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het bedienen van een cryostaat en het inkapselen van weefsel om de kwaliteit van de coupes te waarborgen en te voorkomen dat hars de daaropvolgende RNA-extractie hindert.
- Afhankelijk van toegang tot een cryostaat en een infrastructuur voor vloeibare stikstof voor weefselconservering en coupesnijden bij gecontroleerde temperaturen.
- Maakt standaardisatie van de coupedikte (30 µm voor RNA, 7 µm voor histologie) en verzamelprotocollen tussen gebruikers noodzakelijk om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Aanpassing aan andere weefseltypes kan optimalisatie van de parameters voor het snijden en homogenisatietechnieken vereisen, afhankelijk van de weefseldichtheid en architectuur.
- Praktische beperkingen omvatten een relatief lage doorvoersnelheid en de noodzaak van zorgvuldige hantering om RNA-degradatie tijdens het verzamelen en verwerken van de coupes te voorkomen.
