Name: Cryosectioning aaneengesloten Regios van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer cryosectie van aaneengesloten muis skeletspierregio's voor histologische en moleculaire analyse. Deze methode correleert histologische en genexpressiedata uit één weefselbron.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre en Junna Luan verzorgden de technische bijstand. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health onder toekenningnummer AR065077. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteur en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

<ol><li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+skeletal+muscle+regeneration+plus+mild+alterations+in+mature+fiber+type+specification+in+Fktn-Deficient+Dystroglycanopathy+Muscular+Dystrophy+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice.</a> PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).</li>
<li>Bartoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+therapeutic+gene+transfer+in+animal+models+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies.</a> Gene Ther. 13, 20-28 (2006).</li>
<li>Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+RNA+preparation+options+for+archived+myocardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung+Circ%22%5BJournal%5D)">Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies.</a> Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).</li>
<li>Beedle, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fukutin+deletion+impairs+dystroglycan+processing+and+recapitulates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy.</a> J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).</li>
<li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-week+rapamycin+treatment+improves+muscular+dystrophy+in+a+fukutin-deficient+mouse+model+of+dystroglycanopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy.</a> Skeletal Muscle. 6, 20(2016).</li>
<li>AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: 
 <a target="_blank" href="www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx">www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx</a> 1-102 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+RNA+extraction+kits+for+preparation+of+DNA-free+total+RNA+from+Salmonella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells.</a> BMC Res. Notes. 3, 211(2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+Myf5+to+support+myogenic+differentiation+without+myogenin%2C+MyoD%2C+and+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4.</a> Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).</li>
<li>Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+skeletal+muscles+with+altered+timing+of+expression+of+the+basic+helix-loop-helix+muscle+regulatory+factor+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4.</a> Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+chloroform+by+bromo-chloropropane+in+the+single-step+method+of+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation.</a> Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).</li>
<li>Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+RNA+from+tough+tissues+with+high+proteoglycan+content+by+cryosection%2C+second+phase+separation+and+high+salt+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation.</a> J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).</li>
<li>Guo, D., Catchpoole, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+RNA+following+cryosections+of+archived+frozen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue.</a> BioTechniques. 34, 48-50 (2003).</li>
<li>Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible+mouse-on-mouse+immunohistochemical+staining+technique+adaptable+to+biotin-free+reagents%2C+immunofluorescence%2C+and+multiple+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining.</a> J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).</li>
<li>Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+gene+analysis+of+130+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+with+a+special+reference+to+muscle+mRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis.</a> Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
</ol>

De auteur verklaart dat ze geen concurrerende financiële belangen heeft.

De beste resultaten met deze methode te realiseren, houdt inbedding hars beperkt tot het onderste deel of helft van de spier weefsel tijdens cryopreservatie dat buitensporige hars het verzamelen van de samengevoegde cryosecties zal vertragen en kunnen verhogen inbedding hars verontreiniging in de RNA-isolatie. Ook zorgvuldige aandacht tijdens homogenisatie naald is belangrijk om de opbrengst te maximaliseren en de kans op verstopping van de naald te minimaliseren. Het protocol kan worden gemodificeerd door een Luer-Lok ...

Het doel van deze techniek is om meerdere experimentele analyses maken van verschillende modaliteiten, zoals histologie en genexpressie, vanuit een single skeletspier bronweefsel. Microscopie toepassingen zijn het gevoeligst voor conserveringstechnieken, die zorgvuldig moet worden geregeld om de vorming van ijskristallen artefacten tijdens cryopreservatie beperken proeven. Aldus wordt methodeontwikkeling gebaseerd op de tibialis anterior (TA) spier bevroren gedeeltelijk bedekt met inbedding hars in een -140 ° C vloeibare stikstof gekoeld 2-methylbutaan bad bronmateriaal zowel immunofluorescentie microscopie en genexpressie analyses. De noodzaak om dezelfde grondstof voor diverse technische benaderingen is bijzonder belangrijk voor intramusculaire injectie gebaseerde experimenten waarbij de linker en rechter spieren vertegenwoordigen verschillende omstandigheden, een experimenteel en bediend. Bijvoorbeeld, bij spierregeneratie studies, een muSCLE wordt ingespoten met een toxine om wijdverspreide weefselbeschadiging veroorzaken terwijl de contralaterale spier fungeert als een vehikel geïnjecteerd control 1. Evenzo gentherapie studies spieraandoeningen typisch beginnen validatie van de gentherapie vector die door intramusculaire injectie worden vergeleken met lege vector, verbonden vector of het voertuig aan de contralaterale zijde 2. Daarom is het niet mogelijk om elke TA spier bron naar een andere toepassing. Gemeenschappelijke strategieën om deze kwestie zijn: i) een andere spiergroep gebruikt voor elke toepassing, ii) aanvullende muizen gebruiken, of iii) een stuk van de spier voor elke toepassing af te snijden. Echter aanzienlijke verschillen tussen spiergroepen bemoeilijken vergelijking van de gegevens van afzonderlijke toepassingen en meer dieren te verhogen en kosten zijn slecht onderbouwd als alternatieven bestaan. Het verdelen van de spier na de sectie voor verschillende toepassingen bron is de beste optie in veel gevallen. De spier stukken vaak te klein om verpulvering gebruikt onder vloeibare stikstof of mechanisch malen technieken voor homogenisatie 2-5. Spier- een zeer structureel weefsel vol extracellulaire matrix en contractiele eiwitten, onvoldoende mechanische homogenisering leidt tot een lage opbrengst van latere DNA, RNA of eiwit. De werkwijze die hier worden beschreven kunnen kleine hoeveelheden weefsel uit een hand spier geschikt voor verschillende toepassingen, en het opnemen van cryosectioning en naald trituratie verbetert mechanische homogenisering betere RNA opbrengst.

<table><tbody><tr><td>Kurk</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Snijd in kleine vierkantjes met een scherp mes.</td></tr><tr><td>Kunststof coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Wordt gebruikt om de spier tijdens het bevriezen te oriënteren.</td></tr><tr><td>Lage temperatuur thermometer</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutaan</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Let op: gevaarlijke chemische stof. Bewaren in een brandbare kast.</td></tr><tr><td>Inbeddingshars: "cryomatrix"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>Andere inbeddingsharsen kunnen worden vervangen door cryomatrix.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 met wegwerp mesdrager</td><td>Elke werkende cryostat zou voldoende moeten zijn voor het protocol.</td></tr><tr><td>Wegwerp cryostatmes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Gebruik een geschikt mes of mes voor de te gebruiken cryostat.</td></tr><tr><td>RNAse decontaminatieoplossing: "RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Verfkwast</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Gebruik om cryosecties te hanteren. Kan worden gevonden in winkels met eenvoudige kunstbenodigdheden.</td></tr><tr><td>Scheermesje</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasje</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>RNA organische extractie reagens: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Let op: TRIzol is een gevaarlijke chemische stof. Opmerking: Alleen organische extractiereagentia worden aanbevolen voor RNA-extractie uit skeletspier.</td></tr><tr><td>18 gauge naald</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>22 gauge naald</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge naald</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>Optioneel. Kan worden gebruikt voor een derde ronde van monster trituratie in het RNA-extractieprotocol.</td></tr><tr><td>1 ml spuit</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>Voor monsters met een zeer hoge waarde wordt een Luer-Lok-spuit aanbevolen (bijv. VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropentaan (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Voor 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>Meng 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. </td></tr><tr><td>Voor 70% ethanol in DEPC water: DEPC-behandeld water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>Meng 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.</td></tr><tr><td>RNA zuiveringskit: PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Laatste stappen van RNA-voorbereiding.</td></tr><tr><td>DNase/Rnase-vrij water&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td>DEPC-behandeld water kan ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Spectrofotometer: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Behandel gezuiverd RNA om eventuele DNA-besmetting te verwijderen voor downstream toepassingen.</td></tr><tr><td>Hydrofobe pen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS voor immunofluorescence protocol.</td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Rehydreer normaal donkey serum volgens de instructies van de fabrikant en verdun vervolgens een aliquot tot 5% voor immunofluorescence.  Normaal geitenserum kan ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>eMHC antilichaam</td><td>University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Collageen VI antilichaam</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-konijn AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Waterige montage media: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Gebruik alleen montage media die zijn ontworpen voor fluorescerende toepassingen met anti-fade eigenschappen.</td></tr><tr><td>Glazen coverslip</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>Gebruik voor het monteren van dia's aan het einde van het immunofluorescentieprotocol</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express, of meer geavanceerde producten</td><td>Freeware ImageJ zou ook moeten werken voor handmatige telling. Meer geavanceerde software met segmentatiemogelijkheden kan gedeeltelijke automatisering van het proces mogelijk maken; bijv., ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Sectieafbeeldingen samenvoegen en in kaart brengen: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxine</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 is stopgezet. Andere opties voor cardiotoxine zijn EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; of Ge Script # RP17303; maar deze zijn niet gevalideerd.</td></tr><tr><td>reverse transcriptiekit: Superscript III First-strand synthese systeem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>Elke gevalideerde, hoogwaardige reverse transcriptie reagens kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Standaard PCR: GoTaq Flexi polymerase systeem</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>Elk gevalideerd, hoogwaardig Taq polymerase systeem kan worden gebruikt. Als DNA-sequencing moet worden gebruikt voor enige toepassing stroomafwaarts van de PCR, dan moet een hoog nauwkeurigheid PCR-systeem worden gebruikt in plaats daarvan.</td></tr><tr><td>SYBR groen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>Voor gebruik in qPCR wanneer geen specifiek qPCR mastermix wordt gebruikt. Gebruik met SuperROX (voor Applied Biosystems instrumenten) en GoTaq Flexi polymerase en buffers.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX is stabieler in de PCR-reactie, dus het wordt bij voorkeur gebruikt als een qPCR passieve referentiekleurstof over ROX (carboxy-X-rhodamine). Voor qPCR met Applied

cryosectioning aaneengesloten regio&#39;s van een enkele muis skeletspieren voor gene expression en histologische analyses

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

Bij deze methode worden opeenvolgende cryosecties verzameld zowel microscopie toepassingen voor weefsel histologie en verrijking van RNA voor genexpressie met behulp aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Doorgaans is het een uitdaging om voldoende homogenisering van kleine skeletspieren monsters te bereiken omdat buffer volumes te laag voor een efficiënte slijpen toepassingen kunnen zijn, maar zonder voldoende mechanische verstoring, het dichte weefsel architectuur van de spier grenzen penetratie van buffer reagentia, uiteindelijk veroorzakend lage RNA opbrengst. Door het volgen van het protocol hier gemeld, zijn 30 micrometer secties verzameld en samengevoegd waardoor cryosectioning en de daaropvolgende naald homogenisatie mechanisch verstoren van de spieren, het verhogen van de oppervlakte blootgesteld buffer penetratie. De primaire beperkingen van de techniek zijn dat het een cryostaat vereist, en het is relatief lage doorzet. Echter, hoge kwaliteit RNA verkregen uit kleine monsters van samengevoegde muscle vriescoupes, waardoor deze methode toegankelijk voor veel verschillende skeletspieren en andere weefsels. Bovendien maakt deze techniek gepaard analyses (bijvoorbeeld weefsel histopathologie en genexpressie) van aangrenzende gebieden van een skeletspier zodat metingen direct vergelijkbaar tussen toepassingen experimentele onzekerheid te verminderen en replicatieve dierproeven noodzakelijk reduceren tot een kleine weefsel voor bron meerdere toepassingen.

Cryosectie Muscle RNA ligt hoog in kwaliteit en voldoende rendement voor de meeste toepassingen Analyses van zestien skeletspier RNA preparaten worden weergegeven in Tabel 1 gebruik 19,4-41 mg samengevoegde tibialis anterior (TA) spierweefsel 8 controlemuizen. Zowel het linker (L) en rechter (R) TA spieren werden bereid regeneratie proeven met spieren verzameld 3 dagen na longitudinale intramusculaire injectie va...

Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.

Cryosectioning aaneengesloten Regio&#39;s van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Het algemene doel van deze procedure is om analyse van histologische en moleculaire parameters mogelijk te maken van aangrenzende secties van een enkel weefsel. Met deze methode kunnen we helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van de biologie en ziekte van skeletspieren. Zoals, wat zijn de regeneratieve effecten na spierletsel, en wat zijn de effecten van virale genoverdracht door intramusculaire injectie?Het voordeel van deze methode is dat histologische en moleculaire gegevens direct gecorreleerd kunnen worden van een enkel weefsel. Dat maakt effectievere gegevensanalyse en beter gebruik van experimenteel weefsel mogelijk. Vijf minuten voor het voltooien van de dissecties, koel het cryopreserveringsbad.Wanneer de weefselmonsters klaar zijn om ingebed te worden, breng eerst inbeddingshars aan op het onderste derde tot de helft van het weefsel, waar de spier de kurk ontmoet. Dit moet netjes gebeuren om harsinterferentie met de downstream stappen te verminderen. Daarna, laat de kurk onmiddellijk vallen in het 2-Methylbutaanbad gekoeld tot min 140 graden Celsius.Neem tot acht weefselpreparaten per batch op. In het bad, roer de weefsels gedurende 30 seconden, krab de bodem van de beker om te voorkomen dat de weefselkurken in de oplossing bevriezen. Na 30 seconden, trek met een metalen gereedschap een weefselkurk uit de 2-Methylbutaan.Verwijder vervolgens snel het ondersteunende deksel. Dep het overtollige 2-Methylbutaan terug in het bad en laat vervolgens de weefselkurk in het buitenste stikstofbad vallen. Nadat alle weefsels in het vloeibare stikstof zijn overgebracht, verplaats ze naar een container en bewaar ze op min 80 graden Celsius.Na het voorbereiden van de cryostaat en het monteren van een weefselmonster, gebruik de grove en fijne bedieningselementen om het monster naar de mes te laten oprukken tot het het mes raakt. Reset het totaal van de sectiedikken op dit punt op nul. Stel vervolgens de cryostaat in op de trimfunctie met een sectiedikte van 30 microns.En snijd secties af tot de gewenste weefseldiepte. Om cryosecties efficiënt te verzamelen voor RNA-extractie, open eerst de verzamelbuis en plaats deze dicht bij de mesdrager. Gebruik daar een voorgekoelde, schone borstel om elke sectie op te nemen en deze naar de buis over te brengen.Gepoolde 30-micron muis tibialis anterior secties genomen van 400 tot 4.000 micron weefseldiekte leveren typisch 25 tot 50 milligram spier op. Als inbeddingshars de cryosectie omringt, zet de handrem vast en gebruik een scheermes om kleine stukjes hars eraf te scheren tot er slechts een dunne laag rond de bovenkant van de spier aanwezig is. Snijd altijd hars met het mes in de richting van de spier weg.Een dunne laag inbeddingshars belemmert de downstream RNA-extractie niet substantieel. Als dikkere inbeddingshars aanwezig is, gebruik borstels om deze van de spier te verwijderen voordat de cryosectie in de verzamelbuis wordt gebracht. Tijdens het sectieproces, wanneer histologische secties gewenst zijn, stel de snededikte opnieuw in op zeven micron met behulp van de cryostaatbedieningselementen.Snijd vervolgens en gooi vier tot zeven secties af om een consistente, gelijkmatige weefseloppervlakte te verkrijgen en noteer deze weefseldiekte. Snijd nu een goede sectie en oriënteer deze op het oppervlak van de mesdrager. Gebruik een microscoopglaasje op kamertemperatuur om de sectie op te nemen en breng het glaasje terug naar kamertemperatuur.Verzamel alle gewenste secties en noteer vervolgens de uiteindelijke weefseldiekte. Nadat de sectie is voltooid, noteer snel het gewicht van de gepoolde cryosecties voor RNA-isolatie. Breng de buis onmiddellijk terug naar de cryostaatkamer om de temperatuur van de secties rond de min 20 graden Celsius te houden.Begin door de gepoolde cryosecties snel over te brengen naar ijs en voeg ongeveer één milliliet organisch RNA-extractiemiddel toe per 50 milligram cryosecties. Hoe eerder het reagens wordt toegepast, hoe minder de RNA degradeert. Gebruik vervolgens een spuit van één milliliter met een 18-gauge naald om de cryosecties te homogeniseren zonder te veel bellen te maken door herhaaldelijk een oplossing op te trekken en deze op de buiswanden uit te spuiten.Gebruik de naaldpunt om verklumpte stukken te verspreiden. Na elke vijf slagen, breng het monster kort terug naar het ijs om het koel te houden. Eenmaal gehomogeniseerd, gebruik een 22-gauge naald om het monster voorzichtig te trituren met vijf extra slagen.Breng vervolgens het monster terug naar het ijs. Herhaal dit proces drie of vier keer om een zeer fijn verspreide weefselhomogeniteit te verkrijgen. Zodra het uiteindelijke homogenaat is gemaakt, laat het vijf minuten op kamertemperatuur incuberen om moleculaire complexen te verstoren.Voeg vervolgens in een afzuigkap 0,1 milliliter BCP toe per milliliter RNA-isolatiereagens. Schud vervolgens de buis krachtig gedurende 15 seconden. Gebruik geen vortex.Incubeer vervolgens het monster gedurende twee tot drie minuten op kamertemperatuur. Na de korte incubatie, centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000g en vier graden Celsius. Verzamel vervolgens voorzichtig de heldere bovenste fase die het RNA bevat.Breng het over naar een schone buis en voeg een gelijk volume van 70% ethanol toe, gemaakt in diep zeewater. Na kort te hebben gevormd, laat het 10 minuten op kamertemperatuur incuberen en volg vervolgens het tekstprotocol. RNA-preparaten van skeletspieren werden gemaakt van de muis tibialis anterior.Drie dagen eerder werden sommige spieren geïnjecteerd met 10 micromolar cardiotoxine en andere met zoutoplossing. De zuiverheid en opbrengst van het RNA uit deze monsters was uitstekend. De RNA-opbrengst was aanzienlijk hoger in tibialis anterior spieren na toxineletsel.Weefselintegriteit en RNA-productie

cryosectioning-contiguous-regions-single-mouse-skeletal-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

De neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gewijzigd in een verscheidenheid aan omstandigheden die soms kunnen resulteren in synaptische falen. Dit rapport beschrijft op fluorescentiemicroscoop gebaseerde methoden om dergelijke structurele veranderingen te kwantificeren.

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

Hier demonstreren we de meest efficiënte methoden voor het invriezen, inbedden, cryosecteren en kleuren van spierbiopten om bevriezingsartefacten te voorkomen.

Do&#39;s en Don&#39;ts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van ruimtelijk verschillende muis colonische epitheliale oppervlaktecellen van de onderliggende crypt-basiscellen.

Cryosectioning Methode voor Microdissection van Murine colonslijmvlies

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Een laser Capture microdissection (LCM)-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Het hier gerapporteerde LCM-protocol kan echter worden gebruikt om genexpressie in cellen van een hard weefsel te bestuderen.

Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

Dit protocol beschrijft de laser Capture micro dissectie voor de isolatie van kraakbeen en bot uit verse bevroren delen van de muis embryo. Kraakbeen en botten kunnen snel worden gevisualiseerd door Cresylacetaat-Violet kleuring en precies worden verzameld om RNA van hoge kwaliteit te leveren voor transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.

Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer cryosectie van aaneengesloten muis skeletspierregio's voor histologische en moleculaire analyse. Deze methode correleert histologische en genexpressiedata uit één weefselbron.

Cryosectioning aaneengesloten Regio's van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses

Meer video's verkennen