Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen

Het algemene doel van deze procedure is om te screenen op agentia geproduceerd door een bacteriestam, die remmend zijn op de tweede bacteriestam. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op een aantal microbiologische gebieden, maar is vooral nuttig in microbiële ecologie, bij het begrijpen van antagonistische bacteriële interacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het goedkoop is en gemakkelijk uit te voeren en te interpreteren.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Aretha, een student in het laboratorium. Om het experiment te beginnen, inoculeer een enkele kolonie van P syringae in 3 milliliter King's Medium B-bouillon, of KB. Incubeer de cultuur overnacht. De volgende ochtend verdunt u de bouilloncultuur 1 op 100 in 3 milliliter verse KB-bouillon.

Incubeer de cultuur drie tot vier uur met schudden bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de cultuur een merkbare toename in troebelheid heeft, en voeg vervolgens Mitomycine C toe. Incubeer de cultuur vervolgens overnacht met schudden bij kamertemperatuur. De volgende dag pelleteert u één tot twee milliliter van de met Mitomycine C geïnduceerde culturen in een tafelmicrocentrifuge.

Verwijder en steriliseer de cultuursupernaten door de supernatant door een filter met een poriegrootte van 0,22 micrometer te laten lopen. Voeg natriumchloride toe om een molaart concentratie te bereiken, en voeg polyethyleenglycol of PEG 8000 toe tot een uiteindelijke concentratie van 10%, tot de steriele supernatant. Draai de monsters herhaaldelijk om totdat zowel het natriumchloride als het PEG volledig zijn opgelost.

Incubeer de monsters een uur in een ijsbad. Centrifugeer vervolgens de monsters. Na het centrifugeren, decanteer de supernatant en re-suspendeer het pellet in buffer door herhaaldelijk te pipetteren.

Verwijder resterend PEG door twee opeenvolgende extracties met een gelijk volume chloroform. Combineer met chloroform met het opnieuw gesuspendeerde pellet en vortex de mengsel gedurende 15 seconden. Centrifugeer vervolgens het mengsel gedurende vijf minuten bij 20.000 keer G.

Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe microfugebuis. Herhaal deze extractie twee keer, totdat er geen witte interface tussen de waterige en organische fase zichtbaar is. Laat resterend chloroform verdampen uit de geëxtraheerde supernatanten in een afzuigkap.

Inoculeer een enkele kolonie van een P syringae-stam in drie milliliter KB, en incubeer de cultuur overnacht met schudden bij kamertemperatuur. De volgende ochtend verdunt u de cultuur 1 op 100 in verse KB. Incubeer de cultuur drie tot vier uur met schudden bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens gesteriliseerde wateragar voor door een suspensie van agar in ultrapuur water te autoclaveren.

Houd de gesmolten zachte agar in een waterbad van 60 graden Celsius voor gebruik. Gebruik een steriele serologische pipet om drie milliliter zachte agar over te brengen naar een steriele kweekbuis. Plaats de kweekbuis terug in het waterbad om het in een gesmolten staat te houden.

Laat de gesmolten agar voor het overgieten afkoelen, maar laat het niet stollen. Het is cruciaal dat de agar in een hete, volledig gesmolten toestand wordt gehouden voorafgaand aan inoculatie. Als dat niet het geval is, zal de overlay een korrelig uiterlijk hebben en moeilijker te interpreteren zijn.

In een steriele kap, inoculeer 100 microliter van de testerstamcultuur in de zachte agar en vortex om te mengen. Roteren de cultuur met de hand gedurende 10 tot 15 seconden, en giet het vervolgens op de bodem van een agarplaat. Kantel de plaat in alle richtingen om ervoor te zorgen dat de zachte agar de bodemagar gelijkmatig bedekt.

Dek de plaat af en laat deze 20 tot 30 minuten stollen. Wees voorzichtig om de plaat niet te verstoren tijdens het stollen. Eenmaal gestold, brengt u twee tot vijf microliter supernatant aan op de overlay.

Laat de platen overnacht bij kamertemperatuur incuberen. Observeer en noteer de resultaten de volgende ochtend. Met deze methode worden twee stammen van P syringae geïnhibeerd door verschillende bacteriocinen.

Stam A is gevoelig voor een bacteriocine met een hoog molecuulgewicht Tailocine, maar niet gevoelig voor een alternatief, laagmoleculair gewicht Bacteriocine. Omgekeerd is Stam B ongevoelig voor het Tailocine, maar gevoelig voor het laagmoleculaire gewicht Bacteriocine. Het Tailocine wordt efficiënt hersteld na PEG-precipitatie, terwijl bacteriocinen met een lager molecuulgewicht dat niet zijn.

Bacteriofaaggemedieerde doding wordt onderscheiden van andere niet-replicatieve antimicrobiële middelen door het vergelijken van een verdunningsreeks. In het geval van door bacteriofagen gemedieerde klaring, lost verdunning van de supernatant op in individuele plaques, of klaringszones, terwijl Bacteriocine-gemedieerde klaring niet oplost in dergelijke plaques. Deze procedure kan worden gebruikt als een initiële screening om remmende agentia te identificeren en kan worden gecombineerd met downstream genetische manipulaties om de bron van deze activiteit te identificeren of te bevestigen.