Name: Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Leer de soft-agar overlay-techniek voor het screenen van bacteriële remstoffen met P. syringae. Deze kosteneffectieve methode identificeert antagonistische interacties en ondersteunt microbiële ecologie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door de Agriculture and Food Research Initiative competitieve subsidie 2015-67012-22773 van het USDA National Institute of Food and Agriculture aan K.L.H.

1. Voorbereiding van de Supernatant te worden getest Activity <ol><li> Bereid een 0,5 mg / ml voorraadoplossing van mitomycine C door oplossen van de geschikte hoeveelheid in steriele 0,1 M MgSO4 buffer (bijvoorbeeld 1 mg mitomycine C / 2 ml buffer). Store voorraad bij 4 ° C in een lichte beschermde container (mitomycine C is lichtgevoelig). </li><li> Inoculeer een enkele kolonie van P. syringae in 3 ml medium B King&#39;s (KB) bouillon 14. Incubeer overnacht onder schudden (200 opm) bij kamertemperatuur (21-25 ° C). </li><li> De volgende ochtend, verdunnen de bouillon cultuur 1/100 in 3 ml vers KB bouillon. Incubeer gedurende 3-4 uur onder schudden bij kamertemperatuur. Voeg mitomycine C (0,5 ug / ml, eindconcentratie). Incubeer de kweek gedurende de nacht onder schudden bij kamertemperatuur. OPMERKING: mitomycine C veroorzaakt dubbelstrengs DNA breuken, waardoor de cel SOS-reactie stimuleren, wat leidt tot de productie van zowel bacteriofaag en bacteriocinen. </li><li> Pellet 1-2 ml mitomycine C geïnduceerde kweken door centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 5 minuten in een tafelmodel microcentrifuge. </li><li> Verwijderen en steriliseren kweeksupernatanten hetzij door het passeren van het supernatant door een 0,22 um poriegrootte filter of door behandeling van het supernatant met chloroform (100 ui chloroform per 1 ml supernatant). <ol><li> Bij gebruik van chloroform, vortex het mengsel gedurende 15 seconden en laat incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Na incubatie gecentrifugeerd mengsel bij 20.000 xg gedurende 5 minuten. OPMERKING: Chloroform efficiënt doodt cellen door solubiliseren hun membranen. Het voordeel van chloroform scheidingsfilter sterilisatie is dat het goedkoper en gemakkelijker opschalen als verwerking vele (&gt; 20) monsters tegelijk. Er kan een mogelijkheid dat een bepaalde dodende activiteit verloren na chloroform behandeld ten gevolge van verdeling in de organische fase. </li><li> Verwijder de bovenste, waterige fase met een 1 ml pipet een nieuwe, steriele 1,5 of 2,0 mlmicrofugebuis. Zorg ervoor dat u een van de lagere chloroformlaag over te dragen (het is beter om minder van de waterfase te verwijderen om overdracht te voorkomen). </li><li> Incubeer de overgedragen bovenstaande afgetopte in een zuurkast om de resterende chloroform te verdampen (enkele uren). WINKEL supernatanten bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Scheiding en concentratie van hoog molecuulgewicht bactericide verbindingen met polyethyleenglycol (PEG) Neerslag <ol><li> Om de steriele supernatant, voeg NaCl en PEG 8000-1 M en 10% eindconcentraties respectievelijk. Herhaaldelijk keren de steekproef totdat zowel het NaCl en PEG volledig is opgelost. Incubeer monsters in een ijsbad gedurende 1 uur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer monsters bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Een pellet moet onder in de centrifugebuis vormen. Decanteer het supernatant en resuspendeer de pellet in gewenste volume (zoals 1/10 of 1/100 van het oorspronkelijke volume supernatantume) buffer (10 mM Tris, 10 mM MgSO4, pH 7,0) door herhaaldelijk pipetteren. </li><li> Resten PEG door twee achtereenvolgende extracties met een gelijk volume chloroform. <ol><li> Combineer chloroform met de geresuspendeerde pellet en vortex gedurende 10 tot 15 sec, centrifugeer het mengsel bij 20.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microfugebuis. Herhaal deze extractie totdat geen wit interface tussen de waterige en organische fase zichtbaar (gewoonlijk 2 extracties in totaal). Laat resterende chloroform te verdampen uit gehaald supernatanten in een zuurkast. </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding van Overlay en testen Supernatanten voor Activity <ol><li> Inoculeer een enkele kolonie van P. syringae stam te testen op gevoeligheid in 3 ml KB, incubeer overnacht onder schudden bij kamertemperatuur. </li><li> De volgende ochtend, terug te verdunnen van de cultuur 1/100 in de frisse KB. Incubeer 3-4 uur onder schudden bij kamertemperatuur temperatuopnieuw. </li><li> Bereid gesteriliseerd water agar door autoclaaf een suspensie 0,35-0,7% (w / v) agar in ultrapuur water. LET OP: Een voorraad van zacht water agar kan worden gesmolten in een magnetron en herhaaldelijk hergebruikt, is vers overlay niet moeten worden voorbereid voor elk experiment. Als er water agar wordt hergebruikt, is het essentieel om ervoor te zorgen dat volledig gesmolten is na de magnetron. Zo niet, dan zal de overlay een korrelige structuur op stollende dat de interpretatie moeilijk zal maken te hebben. Als dit gebeurt, smelt de agar gedurende enkele minuten langer in de magnetron dan voorheen gedaan. </li><li> Handhaaf de gesmolten zachte agar in een 60 ° C waterbad voor gebruik. Met behulp van een steriele serologische pipet, overdracht 3 ml zachte agar in een steriele cultuur buis. Zet de cultuur buis waterbad te handhaven in een gesmolten toestand. </li><li> Om de overlay giet, eerst laat de gesmolten agar afkoelen (het moet warm maar niet heet om aan te raken voelen), maar niet laten stollen. </li><li> In een steriele kap, enten 100 pide tester stam cultuur in de zachte agar en vortex te mengen. Draai cultuur met de hand gedurende 10-15 sec, en giet op een bodem agar (KB agar). Tilt de plaat in alle richtingen te zorgen voor de zachte agar gelijkmatig bedekt de bodem agar. NB: De onderste agar kan elk gestold (1,5% agar) medium waarop de test stam groeit krachtig zijn. Voor een standaard 100 mm petrischaal Gebruik ~ 20 ml gesmolten medium. De bodem agar kan van tevoren worden bereid enkele weken (als bij 4 ° C gehouden zonder drogen) of kan op dezelfde dag worden voorbereid. Indien bereid op dezelfde dag als het uitvoeren van de overlay, het beste tot vóór stap 3,4 te doen. </li><li> Bedek de plaat en laat deze 20-30 minuten stollen. Wees voorzichtig niet om de plaat te storen tijdens het stollen. </li><li> Eenmaal verhard, spot 2-5 ul van supernatant (gegenereerd in de punten 1 en 2, boven) op de overlay. Laat de platen incubeer overnacht bij kamertemperatuur geroerd. Observeren en recordresultaten de volgende ochtend. Noteer hetkan nuttig zijn uitgevoerd en ter plaatse van een seriële verdunning van de supernatant worden. Hierdoor kunnen de onderzoekers een onderscheid te maken tussen de bacteriofaag en bacteriocineproducerende clearing activiteiten. In dit geval is het raadzaam om 1 uit te voeren: 5 of 1:10 verdunningen. </li></ol>

<ol><li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+of+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li>
<li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth%27s+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li>
<li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li>
<li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colicin+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+and+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li>
<li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+Microbial+Invasions%3A+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li>
<li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li>
<li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li>
<li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li>
<li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+of+Plant-Associated+Bacteria%22%5BJournal%5D)">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li>
<li>Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols">Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols</a> (2013).</li>
<li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Inst+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652(1936).</li>
<li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li>
<li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeng%2C+NCK+%22Bacteriocins%22">Bacteriocins</a>. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li>
<li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De soft-agar overlay techniek die hier beschreven is op grote schaal toegepast voor vele decennia door onderzoekers geïnteresseerd in bacteriofagen of bacteriocinen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn dat het eenvoudig, goedkoop en relatief gemakkelijk te interpreteren. Door de zachte agar overlay met PEG-precipitatie en seriële verdunning kunnen antimicrobiële middelen worden gescheiden in hoge versus lage gewicht moleculair middelen en replicatieve versus niet-replicatieve agentia (bijvoorbeeld bacteriofaag vs. tailocin respectievelijk). Tenslotte incorporatie van gerichte genetische manipulatie (deletie en complementatie) van vermeende bacteriocineproductie of profaag loci kan stevig de overeenkomst van een bepaalde antagonistische verbinding stellen. We hebben onlangs gebruik gemaakt van deze methode om te beschrijven een nieuwe bacteriofaag afgeleid bacteriocineproductie voorkomt onder Pseudomonas syringae stammen 9. De groei van de media en de voorwaarden vermeld in dit protocol werken goed voor Pseudomonas syringae en waarschijnlijk voldoende voor andere Gram-negatieve bacteriën die krachtig groeien onder deze omstandigheden. Echter, de onderzoekers gebruik van deze methode wil je de timing, kweekmedium, inductie-methode, en de incubatie temperatuur voor hun systeem te optimaliseren. De kritische parameters omvatten het induceren van de productie van cultuur terwijl in de logaritmische groeifase en zaaien de soft-agar overlay voldoende logaritmische fase kweek een bacteriële gelijkmatige verdeling ontstaat, maar niet overdreven cultuur, die potentiële clearing zones verduisteren. Er zijn vele bacteriocinen die niet als onderdeel van de SOS respons geïnduceerd, maar worden geïnduceerd door middel van op peptide gebaseerde quorum sensing systemen (vooral Gram-positieve bacteriocines 15), dus een onderzoeker zou willen verschillende inductie methoden screenen (zoals modificeren voedingswaarde van inducerend medium, of waardoor langere incubatie van de producerende stam). Tijdens gebruikdeze techniek, moet de zachte agar overlay grondig gesmolten en gehandhaafd op 55-60 ° C vóór de toevoeging van de stam zaaien. We hebben verschillende experimenten waarbij de soft-agar werd niet grondig smolt (hoewel visueel bleek te zijn) en resulteerde in een overlay met een korrelige uitstraling gehad. Resultaten van een korrelig overlay kan nog interpreteerbaar algemeen, maar dit is afhankelijk van de sterkte van de remming (zwakkere remming zal moeilijker waar te nemen zijn). Een laatste verstorende variabele te overwegen bij het gebruik van deze techniek is dat de temperatuur van het gesmolten agar tijd afkoelen vóór inoculatie met het zaaien stam, om te voorkomen dat het doden van de seeding stam wordt toegestaan. Om dit probleem te voorkomen, we zorgen voor de soft-agar is warm, maar niet heet, aan te raken. Langs deze lijnen, hebben we ook opgemerkt dat, indien we geven onvoldoende tijd voor een seeding cultuur te acclimatiseren aan de gesmolten agar, voorafgaand aan het gieten van de overlay, we herstellen het algemeen slecht bacteriële gGROEI, waardoor de interpretatie van specifieke remming moeilijk of onmogelijk te interpreteren. Dit is waarom we toestaan ​​10-15 extra seconden incubatie tussen vortexen en het gieten van de overlay. De wisselwerking tussen het handhaven van de agar in een volledig gesmolten toestand (warmer is beter) maar niet dodelijk voor het zaaien stam (warmer is beter) één die waarschijnlijk zullen door een onderzoeker te bepalen door middel van trial and error. Als een PEG precipitatie stap wordt gebruikt, zou het nuttig zijn om een ​​negatieve controle waarbij een steriel kweekmedium identiek is verwerkt om de kweeksupernatant worden omvatten. Dit garandeert dat dodende activiteit niet het gevolg van overblijvende PEG of chloroform in het monster supernatant. Aangezien zowel bacteriofagen en bacteriocinen vaak zeer specifiek te zijn, is het niet ongewoon om geen duidelijke dodende activiteit problemen met een bepaalde combinatie van stammen. Dit kan resulteren uit verschillende stamspecifieke resistance mechanismen, een wezen dat de tester stam ofwel ontbreekt of heeft een onbekende versie van de receptor die nodig is voor het richten van een bepaalde bacteriocine of bacteriofaag. Een alternatieve methode is bacteriocine screeningswerkwijze is beschreven door Kawai et al. , Maar lijdt aan nadelen en is niet op grote schaal aangenomen 16. In het bijzonder, deze techniek vereist het observeren bouillon monsters op tijdstippen dat belastend kan zijn, en staat niet toe dat de discriminatie tussen bacteriofaag-afgeleide en bacteriocineproducer afgeleide doden activiteiten. De belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat deze niet goed geschikt is voor organismen die niet robuust doen toenemen (en dus zal gemakkelijk herkenbaar zones van klaring ontbreekt) of die de haven of prophages bacteriocinen die niet robuust worden geproduceerd onder laboratoriumomstandigheden. Aanpassing van deze techniek om bacteriocins geproduceerd in het milieu monsters zouden zowel uitbreiding van het hulpprogramma op te sporenvan deze techniek en de bevordering van het wederzijds inzicht in de rol van bacteriocines binnen de natuurlijke omgeving.

Onlangs is er aanzienlijke belangstelling voor het verdiepen ons begrip van microbiële ecologie (met name het microbiomes van verschillende omgevingen), evenals nieuwe antibacteriële stoffen voor gebruik bij de bestrijding van antibioticaresistente pathogenen 1,2. Een tussendeur thema tussen deze belangen is het begrijpen van antagonistische interacties tussen bacteriestammen in hun natuurlijke omgeving. Er zijn tal van manieren waarop bacteriën tegenwerken concurrenten 3. Bacteriocinen, een diverse groep van eiwitachtige, antibacteriële stoffen, zijn lang bestudeerd voor hun rol bij het mediëren interbacterial antagonisme, met twee van de meest bestudeerde soort zijn Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli 4,5 6 belangrijke humane pathogenen. Naast bacteriocins, kunnen geïnduceerde prophages ook fungeren als anticompetitor agenten, waardoor een stam binnen te vallen in een niche die al wordt gekoloniseerd 7. Pseudomonas syringae is een plant pathogeen bekend dankzij haar antibacteriële middelen, waaronder enkel eiwit bacteriocins 8, bacteriofaag-tail afgeleide bacteriocinen 9 (aangeduid tailocins), alsmede niet-eiwitachtige secundaire metabolieten 10 produceren. Onlangs is er interesse is in het begrijpen hoe deze antimicrobiële middelen invloed op de ecologie van dit organisme, maar ook hoe ze kunnen worden ingezet om plantenziekte 11 beheersen. Een veel gebruikte werkwijze voor het bestuderen van zowel bacteriocinen en bacteriofaag het soft-agar overlay techniek. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Gratia in 1936 op staatssteun in het opsommen van bacteriofaag 12,13. Hierbij wordt de toepassing van de soft-agar overlay werkwijze beschrijven we, in combinatie met gerichte genetische manipulatie en polyethyleenglycol (PEG) precipitatie, onderscheiden drie verschillende antimicrobiële middelen (een bacteriofaag, een hoogmoleculaire bact moleculaireriocin en een gering gewicht bacteriocine molecuulgewicht) bij eenmalige bacteriestam. Het voordeel van deze aanpak is dat het relatief eenvoudig en goedkoop, en daarom, ondanks dat beslist &#39;low-tech&#39;, nu nog steeds veel toegepast.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogeen. Gebruik passende PPE (d.w.z. handschoenen, oogbescherming en een mondkapje), vooral bij het bereiden van de stockoplossing.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Acute giftig, ademhalingsgevaar. Gebruik passende PPE (handschoenen en oogbescherming), behandel open containers in een chemisch afzuigkap.&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethyleen Glycol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologisch geclassificeerde agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

het gebruik van de soft-agar overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

De soft-agar overlay techniek werd oorspronkelijk meer dan 70 jaar geleden ontwikkeld en is op grote schaal gebruikt in verschillende gebieden van microbiologisch onderzoek, met inbegrip van het werk met bacteriofagen en bacteriocinen, eiwitachtige antibacteriële middelen. Deze werkwijze is relatief goedkoop, met minimale benodigde middelen. Deze techniek bestaat uit het spotten supernatant van een donor stam (potentieel herbergt een toxische verbinding (en)) op een gestold zachte agar overlay die is geënt met een bacteriële teststam (potentieel gevoelig voor de toxische verbinding (en)). We gebruik gemaakt van deze techniek voor het screenen van een bibliotheek van Pseudomonas syringae stammen voor intraspecifieke doden. Door het combineren van deze benadering met een precipitatiestap en doelgen deleties kunnen meerdere toxische stoffen door dezelfde stam te onderscheiden. De twee antagonistische agenten meestal hersteld met behulp van deze techniek zijn bacteriofagen en bacteriocinen. Deze twee middelen kunnen worden onderscheiden met behulp vantwee eenvoudige aanvullende tests. Het uitvoeren van een seriële verdunning op een supernatant die bacteriofaag zal resulteren in individuele plaques steeds minder in aantal met een grotere verdunning, terwijl seriële verdunning van een supernatant die bacteriocineproductie zal resulteren een clearing zone die wordt gelijkmatig troebeler met een grotere verdunning. Daarnaast zal een bacteriofaag een clearing zone produceren wanneer gespot op een nieuwe zachte agar overlay geënt met dezelfde stam, terwijl een bacteriocine een clearing zone niet zal produceren wanneer overgebracht naar een verse zachte agar gazon, vanwege de verdunning van het bacteriocine.

De combinatie van de zachte agar overlay en PEG-precipitatie kunnen worden gebruikt om verschillende antimicrobiële middelen door dezelfde stam te identificeren en te karakteriseren. Figuur 1 toont twee stammen van P. syringae (A en B) die worden geremd door een derde stam van dezelfde soort. De twee stammen zijn echter geremd door verschillende bacteriocinen. De clearing zone op stam A vertoont een scherpe rand, terwijl de clearing zone op stam B groter is, en vertoont een niet-scherpe grens. Genetische manipulatie in de producerende stam die specifiek hetzij de tailocin (tailocin deficiënt) of laag molecuulgewicht inactiveren bacteriocine (bacteriocineproductie deficiënt) bevestigen dat de types A en B zijn gevoelig voor verschillende bacteriocins. Figuur 2 toont dat bacteriofaag-gemedieerde doding te onderscheiden is van andere niet-replicatieve antimicrobiële middelen door het vergelijken van een verdunningsreeks. Omdat zowel bacteriocinen enprofaag kan worden geïnduceerd door mitomycine C behandeling, kunnen de activiteiten van deze twee middelen sterk op elkaar lijken (vooral als de geactiveerde faag overvloedig). Bij bacteriofaag-gemedieerde clearing zal verdunning van de supernatant oplossing in afzonderlijke plaques (heldere zones) terwijl bacteriocineproducer gemedieerde clearing niet oplost in dergelijke plaques. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Figuur 1: Fenotypische onderscheiding van meerdere antimicrobiële agentia door dezelfde stam. Stam A is gevoelig voor een hoog gewicht bacteriocineproductie moleculair (tailocin), maar geen alternatief met een laag molecuulgewicht bacteriocineproductie, zoals blijkt uit het ontbreken van het opruimen in de tailocin deficiënte stam, maar niet de bacteriocineproducerende deficiënte stam. Omgekeerd, stam B ongevoelig voor de tailocin, maar is gevoelig voor het lage gewicht bacteriocine molecuulgewicht. De tailocin is efficiently herstelde na PEG-neerslag, terwijl lagere molecuulgewicht bacteriocines niet. WT = wild type. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Figuur 2: Het onderscheid tussen niet-replicatieve antimicrobiële stoffen en bacteriofagen. (A) verdunning van een hoge titer van bacteriofagen resultaten in individuele plaques die minder talrijk geworden (hoge titer top, lage titer onderaan). (B) Verdunning van bacteriocinen resultaten in uniform minder clearing dat niet is opgelost in afzonderlijke plaques. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We beschrijven een eenvoudige methode voor het screenen van bacterieculturen op de productie van verbindingen die remmend werken op andere bacteriën.

Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Het algemene doel van deze procedure is het screenen op stoffen die worden geproduceerd door een bacteriële stam en die remmend werken op een tweede bacteriële stam. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in diverse microbiologische vakgebieden, maar is bijzonder nuttig in de microbiële ecologie om antagonistische bacteriële interacties te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze goedkoop is en eenvoudig uit te voeren en te interpreteren.Aretha, een student in het laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om het experiment te beginnen, inoculeert u een enkele kolonie P syringae in 3 milliliters King's Medium B-bouillon, of KB. Incubeer de cultuur gedurende de nacht. De volgende ochtend verdunt u de bouilloncultuur in een verhouding van 1 op 100 in 3 milliliters verse KB-bouillon.Incubeer de cultuur gedurende drie tot vier uur onder schudding bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de cultuur een merkbare toename in troebelheid vertoont en voeg vervolgens Mitomycine C toe. Incubeer de cultuur daarna een nacht onder schudding bij kamertemperatuur. Pelleteer de volgende dag één tot twee milliliter van de met Mitomycine C geïnduceerde culturen in een tafelmodel microcentrifuge.Verwijder en steriliseer de cultuursupernatanten door de supernatant door een filter met een poriegrootte van 0,22 micrometer te leiden. Voeg natriumchloride toe aan de steriele supernatant om een concentratie van één molair te bereiken, en voeg polyethyleenglycol, of PEG 8000, toe tot een eindconcentratie van 10%. Keer de monsters herhaaldelijk om totdat zowel het natriumchloride als de PEG volledig zijn opgelost.Incubeer de monsters gedurende één uur in een ijsbad. Centrifugeer vervolgens de monsters. Schenk na het centrifugeren het supernatant af en resuspendeer het pellet in buffer door herhaaldelijk te pipetteren.Verwijder residuele PEG door twee opeenvolgende extracties met een gelijk volume chloroform. Voeg deze chloroform samen met het resuspendeerde pellet toe en vortex het mengsel gedurende 15 seconden. Centrifugeer het mengsel vervolgens bij 20, 000 ×g gedurende vijf minuten.Overbreng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis. Herhaal deze extractie twee keer, totdat er geen witte interface meer zichtbaar is tussen de waterige en organische fase. Laat het resterende chloroform uit de geëxtraheerde supernatanten verdampen in een zuurkast.Inoculeer een enkele kolonie van een P syringae-stam in drie milliliter KB en incubeer de cultuur overnight onder schudding bij kamertemperatuur. Verdun de cultuur de volgende ochtend 1 op 100 in vers KB. Incubeer de cultuur gedurende drie tot vier uur onder schudding bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens gesteriliseerde wateragar door een suspensie van agar in ultrapuur water te autoclaveren.Houd de gesmolten soft agar vóór gebruik in een waterbad van 60 graden Celsius. Breng met een steriele serologische pipette drie milliliters soft agar over naar een steriele kweekbuis. Plaats de kweekbuis terug in het waterbad om deze in gesmolten toestand te houden.Laat de gesmolten agar afkoelen voordat u de overlay giet, maar zorg dat deze niet stolt. Het is essentieel dat de agar in een hete, volledig gesmolten toestand blijft voordat de inoculatie plaatsvindt. Zo niet, dan krijgt de overlay een korrelig uiterlijk en wordt de interpretatie bemoeilijkt.Inoculeer in een steriele laminaire flowkap 100 µL van de cultuur van de teststam in de zachte agar en vortex tot menging. Draai de cultuur 10 tot 15 seconden met de hand rond en giet deze vervolgens op de bodem van een agaplaat. Kantel de plaat in alle richtingen om ervoor te zorgen dat de zachte agar de bodemagar gelijkmatig bedekt.Dek de plaat af en laat deze 20 tot 30 minuten stollen. Zorg ervoor dat de plaat tijdens het stollen niet wordt verstoord. Zodra de laag is gestold, worden twee tot vijf microliters supernatant op de overlay geplaatst.Laat de platen een nacht incuberen bij kamertemperatuur. Observeer en noteer de resultaten de volgende ochtend. Met deze methode worden twee stammen van P syringae geremd door verschillende bacteriocinen.Stam A is gevoelig voor het bacteriocine Tailocin met een hoog molecuulgewicht, maar niet gevoelig voor een alternatief bacteriocine met een laag molecuulgewicht. Omgekeerd is Stam B ongevoelig voor Tailocin, maar wel gevoelig voor het bacteriocine met een laag molecuulgewicht. Tailocin wordt efficiënt teruggewonnen na PEG-precipitatie, terwijl bacteriocinen met een lager molecuulgewicht dat niet zijn.Bacteriofaag-gemedieerde doding wordt onderscheiden van andere niet-replicatieve antimicrobiële middelen door een verdunningsreeks te vergelijken. In het geval van bacteriofaag-gemedieerde klaring leidde verdunning van het supernatant tot de vorming van individuele plaques, of klaringzones, terwijl bacteriocine-gemedieerde klaring niet resulteerde in dergelijke plaques. Deze procedure kan worden gebruikt als initiële screening om inhiberende agentia te identificeren en kan worden gecombineerd met daaropvolgende genetische manipulaties om de bron van deze activiteit te identificeren of te bevestigen.

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Bij het werken met media en reagentia die worden gebruikt om cultuur micro-organismen, moet een aseptische techniek worden toegepast om ervoor te zorgen besmetting tot een minimum beperkt. Verschillende platen methoden worden routinematig gebruikt voor het isoleren, propageren of sommen bacteriën en faag, die opgenomen procedures die de steriliteit van experimentele materialen handhaven.

Aseptische Laboratoriumtechniek: Plating Methoden

Source: Rugjee, K. N., et al. Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the screening of cyclic di-GMP modulators using genetically modified bacteria that express green fluorescent protein (GFP) under the control of a c-di-GMP-sensitive promoter. Fluorescence is measured in a multi-well plate containing different test compounds. Compounds that inhibit c-di-GMP...

Screening of Cyclic di-GMP Modulators Using Bacteria Expressing a Fluorescent Reporter Protein 

Source: Hockett, K. L., and Baltrus, D. A. Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure for detecting bacteriocin-mediated killing by spotting supernatant from an antibiotic-induced donor strain onto a soft agar overlay containing a test strain. Clear zones formed after incubation indicate bacterial inhibition.

Soft Agar Overlay Assay for Detecting Bacteriocin-Mediated Killing in Pseudomonas syringae

This video showcases the deferred growth inhibition assay, used to investigate how antimicrobial compounds produced by one type of bacteria affect another competing bacterial strain.

A Deferred Growth Inhibition Assay to Evaluate the Effect of Bacteria-Derived Antimicrobial Compounds

Concurrentie in Streptococcus pneumoniae wordt gemedieerd door bacteriocine, kleine antimicrobiële peptiden met remmende activiteit tegen pneumokokken en andere verwante soorten.  Hier beschrijven we een geoptimaliseerde bacteriële overlay-assay die de karakterisering van bacteriocine-activiteit en remmingsspectrum, bacteriocine-specifieke immuniteit en detectie van uitgescheiden quorum sensing-peptiden mogelijk maakt.

Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines

Dit artikel beschrijft de high-throughput assay die met succes heeft bewezen grote bibliotheken van kleine moleculen te screenen op hun potentiële vermogen om cellulaire niveaus van cyclisch di-GMP manipuleren Pseudomonas aeruginosa, die een nieuw krachtig hulpmiddel voor antibacteriële geneesmiddelen en beproeving in.

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

De uitgestelde groeiremtest kan worden gebruikt om het competitie-effect door één bacterieel isolaat op een ander te beoordelen. Remmen wordt gekwantificeerd door de zone van opruiming rond het remmer-producerende isolaat te meten, of kwalitatief beoordeeld door de zichtbare mate van remming te bepalen.

Latente Groei Remming Assay aan de kwantificering van bacteriën afgeleide Antimicrobials over het mededingingsbeleid

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.

High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen

Leer de soft-agar overlay-techniek voor het screenen van bacteriële remstoffen met P. syringae. Deze kosteneffectieve methode identificeert antagonistische interacties en ondersteunt microbiële ecologie-onderzoek.

Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen

Meer video's verkennen