Shunt Chirurgie, Right hartkatheterisatie, en Vasculaire Morphometry in een diermodel voor Flow-geïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie
11 februari 2017
Dit protocol beschrijft een chirurgische procedure om een model te creëren voor stromingsgeïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie (PAH) bij ratten en de procedures om de belangrijkste hemodynamische en histologische eindpunten in dit model te analyseren.
De algemene doelen van deze procedures zijn het creëren van een model voor stroming-geïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie bij ratten, en het analyseren van de belangrijkste hemodynamische en histologische eindpunten door middel van rechterkatheterisatie en vasculaire morfometrie. We presenteren de creatie van een rattenmodel voor stroming-geassocieerde pulmonale hypertensie die wordt gekenmerkt door een nieuw intimal-type vasculair hermodellering vergelijkbaar met de humane pulmonale arteriële hypertensie, en die wordt geïnduceerd door een klinisch goed herkende trigger, namelijk verhoogde pulmonaire bloedstroom. Deze kenmerken zullen de translatie van de bevindingen in dit model naar de menselijke ziekte verbeteren.
We tonen ook gestandaardiseerde methoden voor hemodynamische evaluatie en karakterisering van histopathologie met behulp van kwantitatieve morfometrie. De implicaties van deze technieken strekken zich uit naar de ontdekking en evaluatie van nieuwe behandelingsstrategieën en staan de beoordeling van de specifieke effecten op pulmonaire hemodynamiek en vasculaire morfologie toe. Het demonstreren van de procedures zullen Annemieke Smit-Van Oosten en Michel Weij, microchirurgen van dit laboratorium, zijn.
Voordat u begint met de operatie, schuurt u de huid van een geanesthetiseerde rat met chloride hexadeen voor desinfectie en injecteert u buprenorfine subcutaan voor postoperatieve analgesie. Gebruik vervolgens een schaar om een middenlijnsnede langs de buik te maken, beginnend een centimeter onder het diafragma, zich uitstrekkend tot net boven de genitaliën. Breng de darmen over op een steriel gaasje bevochtigd met 0,9%zoutoplossing naar de linkerkant van het dier en bedek het orgaan met meer vochtig, steriel gaas.
Gebruik nieuwe wattenstaafjes om de membranen te scheiden die de abdominale aorta en de vena cava inferior aan het omringende weefsel bevestigen. Gebruik onder een dissectiemicroscoop splintertangen om het perivasculare aortavet net boven de bifurcatie aan de rechterkant van de aorta te verwijderen, waar de naald zal worden ingebracht. Scheid vervolgens de aorta en vena cava vanaf twee millimeter superieur van de site, de naaldinbrengplaats, om ruimte te creëren voor een beamerklem.
Plaats nu een losse 5-O-naald rond de aorta en plaats een Kocherklem op de naald om spanning op de ligatuur superieur aan de incisie te creëren. Plaats de beamerklem net superieur aan de naald en gebruik een nieuwe swap om de vena cava zo distaal mogelijk te comprimeren om de stroom te obstructeren. Buig vervolgens een 18 gauge naald naar een hoek van 45 graden met de bevel naar buiten, en houd de naald 90 graden ten opzichte van het dier, steek de naaldpunt in de aorta net boven de bifurcatie met de bevel naar links gericht.
Dissecteer de membranen die de aorta en de vena cava omsluiten net genoeg om een goede zichtbaarheid van het inbrenggebied voor de shunt te creëren, aangezien over-dissectie ervoor zorgt dat de shunt lekt. Manipuleer de punt van de naald naar links en steek de naald in de vena cava totdat deze binnenin het vat kan worden waargenomen. Om trombose te voorkomen, gebruikt u een nieuw katoenen staafje om het resterende bloed uit de aorta door de inbrengplaats te duwen en gebruikt u een steriel gaas om het gebied rond de shunt te drogen.
Verwijder de naald en breng onmiddellijk een druppel weefsellijm aan op de punctieplaats. Verwijder vervolgens de klem van de aorta en los handmatig de ligatuur op de aorta proximaal aan de shunt. De vena cava distaal van de shunt zou helderrood moeten worden en turbulentie creëren op de shuntplaats.
Na verificatie van de shunt, brengt u de darmen terug in de buikholte en sluit u de spier- en huidlagen met resorbeerbare 4-0-naden. Ventileer vervolgens het dier met 100%zuurstof voor herstel van de anesthesie. Voor rechterkatheterisatie, desinfecteert u de nek met chloride hexadeen en gebruikt u een nummer 10 scalpelmes om een 1,5 centimeter incisie te maken in de rechter ventrale zijde van de nek van het rechter sleutelbeen tot het onderkaaksbeen.
Gebruik onder de dissectiemicroscoop een schaar om het weefsel te spreiden, gebruik vervolgens pincetten om het weefsel voorzichtig uit elkaar te trekken totdat de halsslagader verschijnt. Dissecteer de membranen rond de halsslagader met behulp van splintertangen. Plaats vervolgens een losse 5-O-naald rond het vat en tape de ligatuur aan het ventilatiemasker om de spanning op de ader te verhogen.
Stroomafwaarts van de inbrengplaats, plaats een losse ligatuur rond het vat. Gebruik vervolgens de handgrepen van de forceps om het uiteinde van een 20 gauge naald lichtjes te buigen met de bevel naar binnen en introduceer het uiteinde van de naald in de ader. Plaats snel een canule met een katheter in het vat en verwijder de naald, sluit de stroomafwaartse ligatuur rond de canule om de canule op zijn plaats te bevestigen.
Leidt nu de canule en de katheter in de halsslagader, manoeuvreert de canule onder het sleutelbeen om de rechter atrium binnen te gaan. Richt het uiteinde van de canule naar het hart om het rechter ventrikel binnen te gaan. Een rechter ventrikeldrukcurve zou op de bedmonitor moeten verschijnen.
Wanneer de rechter ventrikeldrukcurve constant is, registreert u de systolische en diastolische rechterventrikeldruk een, en manipuleert u het uiteinde van de canule naar links en omhoog. Laat de katheter in de canule voortschrijden, laat vervolgens de katheter in de hoofdpulmonale ader voortschrijden. Wanneer de pulmonale arteriële drukcurve constant is, registreert u de systolische, diastolische en gemiddelde pulmonale arteriële drukwaarden.
Laat vervolgens de katheter in de canule voortschrijden totdat de bal op het uiteinde van de katheter in een longslagader vast komt te zitten. De daling van de drukcurve zou op de bedmonitor moeten worden waargenomen. Wanneer de wigdrukcurve constant is, registreert u de systolische, diastolische en gemiddelde wigdrukwaarden.
Trek vervolgens langzaam de katheter terug en, geleid door de krommen op de bedmonitor, registreert u de respectieve waarden voor PA- en RV-druk. Wanneer de katheter het rechter ventrikel bereikt, trekt u de canule en katheter lichtjes terug en meet u de gemiddelde rechter
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een chirurgische procedure om een model voor stroomgeïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie (PAH) bij ratten te creëren, samen met methoden om hemodynamische en histologische eindpunten te analyseren. Het model bootst de kenmerken van menselijke PAH na, waardoor translationeel onderzoek wordt bevorderd.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculaire fysiologie
- Onderzoek naar pulmonale hypertensie
- Chirurgische technieken in diermodellen
Achtergrond
- Door flow geïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie is een aanzienlijk gezondheidsprobleem.
- Diermodellen zijn essentieel voor het begrijpen van ziektemechanismen en het testen van behandelingen.
- Deze studie richt zich op een ratmodel dat de menselijke PAH weerspiegelt.
- Gestandaardiseerde evaluatiemethoden zijn cruciaal voor de reproduceerbaarheid.
Doel van de studie
- Het creëren van een betrouwbaar ratmodel voor het bestuderen van flow-geïnduceerde PAH.
- Het analyseren van hemodynamische veranderingen en vasculaire remodeling.
- Het faciliteren van de ontdekking van nieuwe behandelstrategieën voor PAH.
Gebruikte methoden
- Chirurgische aanleg van een shunt om PAH te induceren.
- Rechterhartkatheterisatie voor hemodynamische beoordeling.
- Kwantitatieve morfometrie voor histopathologische analyse.
- Gestandaardiseerde protocollen voor desinfectie en analgesie voor het welzijn van de dieren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van een door flow geïnduceerd PAH-model in ratten.
- Karakterisering van hemodynamische veranderingen na de operatie.
- Identificatie van vasculaire remodellering van intima-type.
- Vestiging van betrouwbare methoden voor toekomstig onderzoek.
Conclusies
- Het ratmodel simuleert effectief de menselijke PAH-condities.
- Gestandaardiseerde methoden verhogen de betrouwbaarheid van de resultaten.
- Dit model kan helpen bij het evalueren van nieuwe therapeutische benaderingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol vestigt een ratmodel voor stroomgeïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie dat de progressie van de menselijke ziekte weerspiegelt, wat preklinische evaluatie mogelijk maakt van therapeutische kandidaten die gericht zijn op vasculaire remodellering. Door hemodynamische beoordeling te combineren met kwantitatieve vasculaire morfometrie, ondersteunt deze aanpak mechanische risicoreductie en targetvalidatie in drug discovery-pipelines voor pulmonale hypertensie. De reproduceerbaarheid en translationele aansluiting van het model vergroten het voorspellende vertrouwen voor go/no-go-beslissingen in vroegstadium cardiovasculaire programma's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot stroomgestuurde vasculaire remodellering en de vorming van neointimale laesies.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd systeem voor functionele targetvalidatie via meetbare hemodynamische en histologische eindpunten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door het modelleren van een klinisch relevante trigger — verhoogde pulmonale bloedstroom — die gekoppeld is aan ernstige PAH-fenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor Assay: Genereert ziekterelatief longslagaderweefsel dat geschikt is voor downstream compound-screening en biomarkeranalyse.
- Kwantitatieve Resultaten: Levert wanddikte, wand-lumenverhoudingen en occlusiescores die dosis-respons evaluatie en compound-profilering mogelijk maken.
- Herbruikbaarheid van het Platform: Vestigt een reproduceerbare vasculaire morfometrie-workflow die schaalbaar is over meerdere studiearmen en compound-testcycli.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Recapituleert menselijke intimaal-type vasculaire remodeling en progressieve vasculaire occlusie, wat de translationele continuïteit versterkt.
- Mechanische risicoreductie: Maakt beoordeling van compound-effecten op zowel hemodynamische druk als vasculaire morfologie mogelijk, waardoor ambiguïteit over het werkingsmechanisme wordt verminderd.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt longitudinale monitoring van vroege mediale hypertrofie tot eindstadium neointimale laesies, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling informeert.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert hemodynamische functionele beoordeling met structurele vasculaire analyse, waardoor het wordt gepositioneerd tussen targetvalidatie en preklinische effectiviteitstests in workflows voor het ontdekken van pulmonale hypertensie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing van door flow geïnduceerde pathways en verduidelijkt de mechanismen die mediale hypertrofie en neointimale vorming aansturen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten van vasculaire morfometrie die een betrouwbare evaluatie van verbindingen tussen verschillende laboratoria ondersteunen.
- Analytica: Biedt kwantitatieve hemodynamische (RV-druk, PA-druk, wedge-druk) en morfometrische (wanddikte, occlusiescore) readouts voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege vasculaire veranderingen met preklinische ziektestadia via histopathologische scoring die is afgestemd op de progressie van PAH bij mensen.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd chirurgisch en analytisch platform dat toepasbaar is op meerdere therapeutische modaliteiten en doelwitklassen in cardiovasculair onderzoek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door een toename van de longdoorbloeding te koppelen aan meetbare vasculaire remodellering en functionele beperkingen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor shuntcreatie, catheterisatie en morfometrie.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door een klinisch gevalideerde trigger voor PAH te modelleren en vroege vasculaire pathologie vast te leggen.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van effecten op zowel de hemodynamische functie als de vasculaire structuur.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist microsurgische expertise in het aanleggen van vasculaire shunts en rechterhartcatheterisatie in knaagdiermodellen.
- Afhankelijk van precisie-instrumentarium, waaronder 18-G en 20-G naalden, canules met ball-tip katheters en dissectiemicroscopen.
- Noodzaak van gestandaardiseerde postoperatieve zorg en analgesieprotocollen om modelconsistentie en naleving van het dierenwelzijn te waarborgen.
- Omvat stappen die afhankelijk zijn van training, zoals shuntverificatie via observatie van turbulentie en bevestiging van de wigdruk tijdens catheterisatie.
- Beperkt door de technische complexiteit van overlevingschirurgie met dubbele procedure, wat de doorvoer in screeningcampagnes met een groot volume kan beïnvloeden.
