In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Het algemene doel van dit experiment is om DNA-aptamer-kleine molecuulinteracties te karakteriseren, inclusief bindingsplaatsmapping, met behulp van microschalige thermoforesis. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen over fundamentele bindingsparameters van moleculaire interacties te beantwoorden. Het grote voordeel van deze technologie is dat het onafhankelijk is van de grootte van de interactiepartner, waardoor kwaliteitscontrolegegevens van uitdagende interacties tussen aptamers en kleine moleculen kunnen worden verkregen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in aptamer-kleine molecuulinteracties, kan deze ook worden toegepast op andere moleculaire interacties zoals drug-doelwit- of antigeen/antilichaaminteracties. Om de procedure te beginnen, bereid een 100 micromolare stamoplossing van de Cy5-gelabelde DNA DH25.42 aptamer in gedistilleerd water. Verdun vervolgens de aptamer-stamoplossing tot 200 nanomolar met bindingsbuffer.

Incubeer de aptamer-werkoplossing gedurende twee minuten op 90 graden Celsius. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur op ijs. Label vervolgens en zet 200 microliter microcentrifugebuisjes met lage binding uit voor een 16-stappen sequentiële verdunning van de te testen ligand.

Pipetter 20 microliter van een 10 millimolare stamoplossing van ligand en bindingsbuffer in buisje 1. Pipetter 10 microliter bindingsbuffer in buisjes 2 tot en met 16. Breng vervolgens 10 microliter ligand-stamoplossing over van buisje 1 naar buisje 2 en meng goed met de pipet.

Breng 10 microliter van de verdunde mengsel over naar buisje 3 en meng goed. Ga door met de sequentiële verdunning op deze manier, corrigeer indien nodig voor bufferverdunningseffecten, en gooi het overtollige 10 microliter uit buisje 16 weg als je klaar bent. Voeg 10 microliter van de aptamer-werkoplossing toe aan elke verdunning en meng goed met de pipet.

Incubeer de monsters gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Trek vervolgens elk mengsel in een schone standaard capillair, zorg ervoor dat je de capillair alleen aan de uiteinden aanraakt. Plaats de capillairen in de houder van de tray in aflopende volgorde van concentratie.

Start het MST-apparaat en open de instrumentbesturingssoftware. Schakel handmatige temperatuurregeling in en stel de instrumenttemperatuur in op 25 graden Celsius. Zodra het instrument de juiste temperatuur heeft, plaatst u de capillairenbak.

Stel het LED-kanaal in op rood voor Cy5-gelabelde aptamer. Stel de LED-vermogen in om een fluorescentiesignaal van 500 eenheden te bereiken. Voer vervolgens een capillairscan uit om de capillairposities te verkrijgen en controleer de monsterskwaliteit.

Als de resulterende pieken U-vormig of afgeplat zijn, bereid nieuwe monsters voor in gecodeerde capillairen om plakeffecten te minimaliseren. Vul in de MST-instrumentsoftware de ligandconcentratie en verdunningstype in voor de eerste capillair. Klik en sleep om de concentraties en verdunningswaarden voor de resterende capillairen in te vullen.

Voer de concentratie van de aptamer in de uiteindelijke mix in. Zorg ervoor dat de experimentmethode is ingesteld om fluorescentie gedurende vijf seconden te detecteren, de MST gedurende 30 seconden te registreren en vervolgens de fluorescentie gedurende vijf seconden na het uitschakelen van de laser te registreren. Stel het laservermogen in op 20% Stel het bestandspad in en sla het experimentbestand op.

Start vervolgens de MST-meting. Verkrijg op deze manier ten minste drie metingen. Om met de gegevensanalyse te beginnen, opent u de MST-analysesoftware en laadt u het experimentbestand.

Selecteer MST voor het analysetype. De analysesoftware maakt het mogelijk om technische herhalingen te vergelijken waarbij alle metingen van dezelfde set capillairen waren. Biologische herhalingen van een andere set capillairen kunnen ook aan de analyse worden toegevoegd.

Klik op de informatieknop onder de eerste meting. Inspecteer de MST-sporen op hobbels of pieken die duiden op aggregatie- of precipitatie-effecten. Inspecteer vervolgens de capillairscan en capillairvorm-overlay op afgevlakte of U-vormige pieken die duiden op plak- of absorptie-effecten.

Aangezien aggregaten en absorptie-effecten snel detecteerbaar zijn in MST, stelt de methode in staat om de technische setup snel en snel te optimaliseren om optimale gegevenskwaliteit te garanderen. Controleer op ligand-afhankelijke fluorescentie-quenching of verbeteringseffecten in de capillairscan en initiële fluorescentie. Inspecteer de verandering in fluorescentie in de tijd op tekenen van fotobleken of foto-versterking.

Zodra de gegevenskwaliteit is geverifieerd, schakel naar de dosisresponsmodus. Selecteer de deskundige analyse-instelling in de T Jump MST evaluatiestrategie. Selecteer vervolgens het hill-model voor curvefitting om automatisch de bindingsparameters te berekenen.

Selecteer in het vergelijkresultatenmenu een normalisatietype. Exporteer de genormaliseerde gegevens als spreadsheet of PDF-bestand. In deze procedure werd MST gebruikt om de bindingsinteracties van een enkele streng DNA-aptamer met een selectie van kleine molecuulliganden te onderzoeken.

De MST-curves werden gepast met de hill-vergelijking en de half-maximale effectieve concentratiewaarden werden bepaald. In vijf onafhankelijke biologische herhalingsmetingen van de aptamer met ATP, vertoonde de ATP-aptamer-interactie een negatieve bindingamplitude van 6 tot 13 eenheden en een gemiddelde EC50-waarde van ongeveer 52,3 micromolar. De gegevens voor elke ligand werden genormaliseerd naar de fractie gebonden moleculen en vervolgens vergeleken.

De EC50-waarden voor ADP, AMP en SAM in vergelijking met ATP suggereren dat het aantal fosfaatgroepen hoogstens een kleine invloed heeft op het aptamer-bindingsgedrag. Verwijdering van de robo C2-hydroxalgroepering vertoonde ook slechts een kleine invloed op de aptamer-bindingsaffiniteit. De aptamer bond niet in de afwezigheid van een paargroep of als de paargroep werd gewijzigd in guanine.

De aptamer bond wel aan adenine alleen, wat verder aangeeft dat de adenine-groep de belangrijkste bindingsplaats voor de aptamer is. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek essentiële informatie over fundamentele bindingsparameters leveren in minuten tot uren als deze goed wordt uitgevoerd.