Name: In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer de bindingsplaats van een DNA-aptameer op ATP in kaart brengen met microschaal thermoforese. Deze methode bepaalt bindingsaffiniteit en stoichiometrie onafhankelijk van molecuulgrootte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen bevestigingen.

1. Voorbereiding van de aptameer werken Stock <ol><li> De instructies van de fabrikant en los het oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sequentie uit referentie 18) in water, tot een 100-uM eindconcentratie. </li><li> Bereid de aptameer werkende oplossing door verdunning van de oligonucleotide voorraad tot 200 nm met bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,01% Tween 20). </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 2 minuten bij 90 ° C, laat het monster onmiddellijk afgekoeld op ijs, en gebruik het monster bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. Bereiding van het ligand verdunningsreeks <ol><li> Voor elk ligand (adenosine trifosfaat (ATP), adenosine difosfaat (ADP), adenosine monofosfaat (AMP), adenine, guanosine trifosfaat (GTP), cytosine trifosfaat (CTP) deoxyadenosinetrifosfaat (dATP) en S-adenosyl methionine (SAM) ; 10 mM voorraad elk) bereiden een 16-stap seriële dilutiop in 200 ul micro reageerbuizen. OPMERKING: Centrifugeren ligand bestanden 5 min bij 14.000 xg kunnen helpen om aggregaten te verwijderen. Klein volume worden lage bindingsreactie buizen aanbevolen adsorptie van moleculen voorkomen dat de buiswanden. </li><li> Begin met een maximale concentratie van ten minste 50 maal hoger dan de geschatte affiniteit en vermindering van de ligand concentratie 50% per verdunningsstap. LET OP: De concentratie finder instrument in de besturingssoftware geïmplementeerd simuleert binding data en helpt bij het vinden van de juiste concentratie bereik voor de verdunningsreeks. </li><li> Vul 20 ul van de ligand voorraad (10 mM) in buis 1. Voeg 10 ui bindingsbuffer aptameer in micro reactiebuizen 2-16. </li><li> Breng 10 pl van de buis 1 aan de buis 2 en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Transfer 10 pi de volgende buis en herhaal deze verdunning voor de resterende buizen. </li><li> Gooi de 10 ul overtollige uit de laatste buis. Vermijd bUffer verwatering effecten. De buffer in de buis 1 en in tubes 2-16 moet identiek zijn. </li></ol> 3. Voorbereiding van de Final Reaction Mix <ol><li> Bereid de individuele bindingsreacties met een volume van 20 pl (10 ui werkoplossing aptameer + 10 ul van de respectievelijke ligand verdunning) te pipetteren fouten te minimaliseren. Een volume van slechts 4 pi is die voldoende is om fi ll het capillair. </li><li> Voeg 10 ul van 200 nM aptameer werkoplossing 10 pi van elke verdunning ligand en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en fi ll de monsters in standaard capillairen door dompelen de capillairen in het monster. Langere incubatietijden kunnen nodig zijn voor sommige interacties; echter 5 min is voldoende voor de meeste. Tik de capillairen alleen aan de zijkanten, niet op het middendeel, waarbij het optisch meting genomen. </li><li> Plaats de capillairen naar ee capillaire lade en start de MST-apparaat. </li></ol> 4. Het starten van de MST Device OPMERKING: Het apparaat biedt twee vooraf geïnstalleerde software pakketten, de &#39;&#39; control &#39;software voor de technische opzet van de experimentele condities en de&#39; &#39;analyse &quot;software voor het interpretatie van de geproduceerde gegevens. <ol><li> Voor het plaatsen van de capillaire lade in de MST-apparaat, start de besturingssoftware en de algehele gewenste temperatuur door &#39;&#39; in staat stellen handmatige controle van de temperatuur &#39;in de&#39; &#39;temperatuurregeling &quot;dropdown menu te selecteren aan te passen. Breng de temperatuur op 25 ° C die manier. OPMERKING: De MST instrumenten kunnen temperatuurgeregelde 22-45 ° C. </li><li> Wacht tot de temperatuur tot het verwachte niveau te bereiken en plaats dan de capillaire lade in de MST-apparaat. </li><li> Stel de LED-kanaal &#39;&#39; red &#39;voor Cy5 kleurstoffen en stel de LED power te winnen a fl uorescencsignaal e van 300 tot 1000 fluorescentie-eenheden op MST via een standaard sensor. 25% LED stroom wordt gebruikt in deze studie. LET OP: 6.000 tot 18.000 fluorescentie-eenheden worden aanbevolen voor de MST met een zeer gevoelige sensor. </li></ol> 5. Capillaire Scan <ol><li> Voer een capillair scan om verschillende aspecten van het monster kwaliteit te controleren door te kiezen voor de capillaire positie op de &quot;controle&quot; software en te klikken op &quot;start cap scan&quot; vóór het begin van het MST meting. </li><li> Inspecteer de capillaire scan op fluorescentie verhoging / quenching en vasthouden effects (U-vormig of afgeplat pieken) in de software. OPMERKING: Meer details over de opsporing en behandeling van fluorescentie en plakken effecten zijn te vinden in de discussie. </li></ol> 6. MST Measurement LET OP: Voordat u de MST meten, zorg ervoor om uit te sluiten plakken effecten, enhancement / blussen effecten, ofpipetteerfouten, en ervoor te zorgen dat het capillair scan geeft aan dat de fluorescentie-signaal die voldoende is. Voor meer informatie, zie de bespreking. <ol><li> Wijs de ligand concentraties van de verdunningsreeks de respectieve positie in de capillaire &#39; &quot;controle&quot; programmatuur Beschouw de verdunningsstap van mengen van de aptameer en ligand. (1: 1). </li><li> Voer de hoogste concentratie van ligand (5 mm) voor capillaire # 1, selecteert u de juiste verdunning type (hier, 1: 1), klikt u op de maximale concentratie, en het gebruik van de functie sleep om de resterende concentraties in de haarvaten # 2- automatisch toe te wijzen 16. De laagste concentratie is 152,6 nM. </li><li> Voer de concentratie van het fluorescerende aptameer (hier, 100 nM) in het respectieve gedeelte van besturingssoftware. </li><li> Gebruik de standaardinstellingen, waarbij de fluorescentie gedurende 5 sec detecteren MST opnemen 30 seconden, en de fluorescentie gedurende nog 5 seconden op nadat de inactivering van de laser t<html> o toezicht achter diffusie van moleculen. </li><li> Stel het laservermogen tot 20% in het betreffende deel van de besturingssoftware. Opmerking: Om de beste signaal-ruisverhouding ontvangen en niet-specifieke effecten te vermijden, wordt een laservermogen van 20-40% aanbevolen. In bepaalde gevallen kan een hogere laservermogen worden verplicht om een ​​goede scheiding van ongebonden en gebonden moleculen te krijgen. </li><li> Sla het experiment na het selecteren van de doelmap en start de MST meting door op de &#39;&#39; toets &#39;Start MST meting. NB: De .ntp bestand wordt in de doelmap worden gegenereerd. Met behulp van deze opstelling, één meting duurt 10-15 min. </li><li> Herhaal de experimentele procedure ten minste tweemaal voor een nauwkeurige bepaling van de EC 50 waarde. meerdere malen Om de technische reproduceerbaarheid te testen, kan dezelfde capillairen worden gescand (technische herhalingen): Let. </li></ol> 7. MST Data Analysis nt &quot;&gt; NB: De analyse software kan de analyse van gegevens over de fl y tijdens de meting De analyse software plot de MST tijd sporen en de veranderingen in de genormaliseerde fluorescentie (F norm) ten opzichte van de ligand concentratie. 37. <ol><li> Start de MST analyse software (MO.Affinity Analysis) en de .ntp bestand uit de doelmap te laden. Selecteer &quot;MST&quot;, zoals het type analyse in de data selectie menu. OPMERKING: Bij ligand-afhankelijke fluorescentie effecten, kunnen de aanvankelijke fluorescentie wordt gekozen voor analyse. </li><li> Voeg de desbetreffende technische of biologische run (s) een nieuwe analyse door middel van drag-and-drop of door op de &quot;+&quot; knop onder de respectieve experimentele run. </li><li> Druk op de knop informatie onder de desbetreffende experimentele run om informatie over de eigenschappen van het experiment, MST sporen, capillaire-scan, capillaire vorm, aanvankelijk fluorescentie, en bleken tarief te verkrijgen. LET OP: Deze ruwe data kan alin latere stappen van de analyse worden gecontroleerd. </li><li> Inspecteer de MST sporen voor aggregatie en neerslag effecten zichtbaar als hobbels en spikes. LET OP: Voor meer informatie over de opsporing en behandeling van aggregatie effecten, lees de discussie. </li><li> Inspecteer de capillaire scan en de capillaire vorm overlay voor adsorptie effecten zichtbaar als afgeplatte of U-vormige pieken. Inspecteer de capillaire scan en de eerste fluorescentie voor fluorescentie-effecten. Visueel te inspecteren het bleken tarief voor fotobleken effecten. </li><li> Schakel de dosis-respons-modus en verander de analyse instelling in &quot;expert&quot; modus door op de bijbehorende knop. Selecteer &quot;T-Jump&quot; als het MST evaluatie strategie. </li><li> Selecteer de &quot;Heuvel&quot; model voor de curve fi tting. De bindende parameters wordt automatisch berekend. Normaliseren van de gegevens door te kiezen voor de respectievelijke soort normalisering in de &quot;resultaten te vergelijken&quot; menu. Exporteer dedata hetzij als een .xls of .pdf. NB: De tabel onder de bindende grafiek geeft een overzicht van de berekende bindende parameters. </li></ol>

<ol><li>Linke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microscale+Thermophoresis+Screening+Approach+for+Fragment-Based+Lead+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery.</a> J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScale+Thermophoresis%3A+Interaction+analysis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
<li>Zillner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein%3A+nucleic+acid+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).</li>
<li>Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+for+the+assessment+of+nuclear+protein-binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities.</a> Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat Commun. 1, 100(2010).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59 (3), 301-315 (2013).</li>
<li>Schubert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Df31+protein+and+snoRNAs+maintain+accessible+higher-order+structures+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin.</a> Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).</li>
<li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> J Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).</li>
<li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+Binding+Aptamers%3A+Selection+Strategies%2C+Characterization%2C+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications.</a> Front Chem. 4, 14(2016).</li>
<li>Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+equilibrium+binding+characterization+of+aptamers+to+small+molecules+using+a+label-free%2C+sensitive%2C+and+scalable+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform.</a> Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).</li>
<li>Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+characterization+of+aptamer+kinetic+and+equilibrium+binding+properties+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance.</a> Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li>
<li>Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ligand+binding+to+a+heterogeneous+RNA+population+in+the+malachite+green+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer.</a> Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).</li>
<li>Burnouf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinITC%3A+a+new+method+for+obtaining+joint+thermodynamic+and+kinetic+data+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry.</a> J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).</li>
<li>Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+amino+acids+by+RNA+aptamers%3A+the+evolution+into+an+L-tyrosine+binder+of+a+dopamine-binding+RNA+motif%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif.</a> RNA. 6 (4), 520-527 (2000).</li>
<li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li>
<li>Huizenga, D. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+aptamer+that+binds+adenosine+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A DNA aptamer that binds adenosine and ATP.</a> Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).</li>
<li>Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allosteric+self-splicing+ribozyme+triggered+by+a+bacterial+second+messenger%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger.</a> Science. 329 (5993), 845-848 (2010).</li>
<li>Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+ligand+binding+by+an+adenine-sensing+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch.</a> Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).</li>
<li>Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+heterogeneous+free+state+in+the+formation+of+a+specific+RNA-theophylline+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex.</a> Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).</li>
<li>Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+fluorescence+anisotropy+sensors+for+adenosine+triphosphate+by+comprehensive+screening+tetramethylrhodamine+labeled+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides.</a> Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence+anisotropy+method+for+detection+of+lead+%28II%29+ion+by+a+G-quadruplex-inducible+DNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer.</a> Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+an+in+vitro-evolved+RNA+aptamer+reveals+homogeneous+ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics.</a> J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705(2010).</li>
<li>Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+as+a+sensitive+tool+to+detect+subtle+modifications+in+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins.</a> PLoS One. 7 (2), 31948(2012).</li>
<li>Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+thermophoresis+for+quantifying+the+buffer+dependence+of+aptamer+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).</li>
<li>Entzian, C., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+small+molecule-aptamer+interactions+using+MicroScale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST).</a> Methods. 97, 27-34 (2016).</li>
<li>Valenzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Identification+of+DNA+Aptamers+to+Tyramine+Using+in+Vitro+Selection+and+High-Throughput+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing.</a> ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).</li>
<li>Jauset Rubio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Conglutin+dual+aptamers+binding+distinct+aptatopes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes.</a> Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Binding+Studies+Using+MicroScale+Thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis.</a> Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).</li>
<li>Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Selection+and+Interaction+Studies+of+a+DNA+Aptamer+Targeting+Protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A.</a> PLoS One. 10 (7), 0134403(2015).</li>
<li>Kinghorn, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Affinity+Maturation+by+Resampling+and+Microarray+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection.</a> Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).</li>
<li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).</li>
<li>Braun, D., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+DNA+by+thermophoretic+depletion+and+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection.</a> Phys Rev Lett. 89 (18), 188103(2002).</li>
<li>Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophoresis+of+DNA+determined+by+microfluidic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).</li>
<li>He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylate+Charge+Regulates+Sensor+Kinase+CheS3+To+Control+Cyst+Formation+in+Rhodospirillum+centenum%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum.</a> MBio. 6 (3), 00546(2015).</li>
<li>Brvar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+discovery+of+substituted+4%2C5%27-bithiazoles+as+novel+DNA+gyrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors.</a> J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).</li>
<li>Pogorelcnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4%2C6-Substituted-1%2C3%2C5-triazin-2%281H%29-ones+as+monocyclic+catalytic+inhibitors+of+human+DNA+topoisomerase+IIalpha+targeting+the+ATP+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site.</a> Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).</li>
<li>Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+signaling+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of signaling aptamers.</a> Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).</li>
<li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Ramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cocaine-antibody+interactions+in+buffer+and+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum.</a> PLoS One. 7 (7), 40518(2012).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+and+interaction+mechanisms+study+of+novel+glucopyranoside+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives.</a> Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+recognition+of+the+granuphilin+C2A+domain+with+PI%284%2C5%29P2%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lipids%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2.</a> Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).</li>
<li>Harazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+of+UDP-N-Acetylglucosamine+2-Epimerase%2FN-Acetylmannosamine+Kinase+%28GNE%29+and+Alpha-Actinin+2+Is+Altered+in+GNE+Myopathy+M743T+Mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant.</a> Mol Neurobiol. , (2016).</li>
</ol>

CE en TS zijn medewerkers van 2bind GmbH, dat biofysische analytische diensten levert. Publicatie vergoedingen voor deze video-artikel worden betaald door 2bind GmbH.

Kwaliteitscontroles: Aspecifieke plakken / adsorptie van monstermateriaal op oppervlakken en aggregatie effecten, een wezenlijke invloed op de kwaliteit van de affiniteit gegevens. Slechts enkele state-of-the-art technologieën bieden een nauwkeurige en snelle opties te controleren en deze te vermijden. MST biedt geïntegreerde kwaliteitscontroles die detecteren en helpen om deze problemen te overwinnen, waardoor de stapsgewijze optimalisatie van de technische installatie. Belangrijke informatie ...

Interactie tussen moleculen is de basis van de natuur. Vandaar dat wetenschappers op vele terreinen van fundamenteel en toegepast onderzoek proberen om de fundamentele principes van de moleculaire interacties van verschillende soorten te begrijpen. Microschaal Thermophoresis (MST) kunnen wetenschappers de snelle, nauwkeurige, kostenefficiënte en op kwaliteit gecontroleerde karakterisering van moleculaire interacties uit te voeren in een oplossing, met een vrije keuze van buffers. Er zijn al meer dan 1.000 publicaties met behulp van MST, van 2016 alleen al, de beschrijving van verschillende soorten analyses, met inbegrip van de bibliotheek screenings, bindende event validaties, de concurrentie assays, en experimenten met meerdere bindende partners 1-8. Over het algemeen MST maakt de studie van de klassieke bindingsparameters, zoals bindingsaffiniteit (pM tot mM), stoichiometrie en thermodynamica, van elke soort moleculaire interactie. Een groot voordeel van MST is het vermogen binding gebeurtenissen onafhankelijk van de grootte van de interactiepartners bestuderen. zelfs challenging interacties tussen kleine nucleïnezuur aptameren (15-30 nt) en targets zoals kleine moleculen, geneesmiddelen, antibiotica, of metabolieten kunnen worden gekwantificeerd. De huidige state-of-the-art technologieën te karakteriseren aptameer-target interacties ofwel lab-intense en zeer complexe of niet te kwantificeren aptameer-klein molecuul interacties 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) gebaseerde assays 11,12 en echt label-free calorimetrische benaderingen, zoals Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC) 13-15, isocratische elutie 16, evenwicht filtratie 17,18, in-line sonderen 19, gel- shift assays, stoppunt fl ow fluorescentie-spectroscopie 20,21, fluorescentie anisotropie (FA) 22,23, single-molecule fluorescentie beeldvorming 24,25, en Bio-layer interferometrie (BLI) 26 zijn ook ofwel onnauwkeurig of niet verenigbaar met aptameer-klein molecuul interacties. andere principal vraagstukken van deze methoden zijn lage gevoeligheid, hoge monster verbruik, immobilisatie, massatransport beperkingen op oppervlakken, en / of buffer beperkingen. Slechts een paar van deze technologie te bieden geïntegreerde schakelaars voor aggregatie en adsorptie effecten. MST is een krachtig hulpmiddel voor wetenschappers om deze beperking op de interactie tussen aptameren en kleine moleculen 27-29, alsmede andere doelen zoals eiwitten 30-33 bestuderen overwonnen. De technologie is gebaseerd op de beweging van moleculen door temperatuurgradiënten. Deze gerichte beweging, genaamd &quot;thermophoresis,&quot; afhankelijk van de grootte, lading en hydratatie shell van het molecuul 34,35. De binding van een ligand aan het molecuul direct ten minste één van deze parameters verandert, wat resulteert in een veranderde mobiliteit thermophoretic. Liganden met kleine maten kan geen aanzienlijke gevolgen in termen van grootte veranderen van de niet-gebonden aan de gebonden toestand, maar ze kunnen dr hebben<html> amatic effecten op de hydratatie shell en / of kosten. De veranderingen in de thermophoretic beweging van moleculen na interactie met de bindende partner maakt de kwantificering van fundamentele bindingsparameters 2,7,34,36,37. Zoals weergegeven in figuur 1A, de MST inrichting bestaat uit een infrarood laser gefocust op het monster in de glazen capillairen met dezelfde optiek als voor fluorescentiedetectie. De thermophoretic beweging van eiwitten via de intrinsieke fluorescentie van tryptofaan 6 of een fluorescent gelabelde interactiepartner 3,8 kan worden bewaakt terwijl de laser wordt een temperatuurgradiënt (AT van 2-6 ° C). Het resulterende temperatuurverschil in de ruimte, AT, leidt tot de uitputting of accumulatie van moleculen in het gebied van verhoogde temperatuur, die kan worden gekwantificeerd door de Soret coëfficiënt (S T): g &quot;/&gt; c hete geeft de concentratie in het verwarmde gebied, en c koud de concentratie in de oorspronkelijke koud gebied. Zoals getoond in figuur 1B, een typische MST experiment resulteert in een MST bewegingsprofiel (tijddiagram), bestaande uit verschillende fasen, die gescheiden kunnen worden door hun respectieve tijdschema. De initiële fluorescentie gemeten in de eerste 5 s bij afwezigheid van de temperatuurgradiënt de precieze start fluorescentie definiëren en controleren fotobleken of photoenhancement. De temperatuursprong (T-Jump) vertegenwoordigt de fase waarin de fluorescentieveranderingen voor thermophoretic beweging. Deze initiële afname in fluorescentie afhankelijk warmte-afhankelijke veranderingen van fl uorophore kwantumopbrengst. De thermophoresis fase volgt, waarbij de fluorescentie afneemt (of verhogingen) door de thermophoretic beweging van de molecules tot de steady-state verdeling wordt bereikt.Het omgekeerde TJump en gelijktijdige terugdiffusie van fluorescerende moleculen zoals aangegeven in figuur 1B nadat de laser is uitgeschakeld worden waargenomen. Om bij fundamentele bindingsparameters worden verschillende molaire verhoudingen van de interactiepartners geanalyseerd en vergeleken. Gewoonlijk worden 16 verschillende ratio&#39;s bestudeerd in een MST experiment, terwijl de optische zichtbaar molecuul constant wordt gehouden en wordt geleverd met een toenemende hoeveelheid van de niet-gelabelde ligand. De interactie tussen de twee bindingspartners induceert veranderingen in de thermophoresis, en dus de genormaliseerde fluorescentie, F norm, die wordt berekend als volgt: <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F warme en koude F vertegenwoordigen gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in de gedefinieerde tijdstippen van het MST sporen. Bindende affiniteiten (Kd of EC 50 waarden) kan worden berekend door curve fitting (figuur 1C). Over het geheel genomen MST is een krachtig hulpmiddel om de moleculaire interacties van welke aard dan ook te bestuderen. Dit manuscript biedt een protocol bij de uitdagende interactie te karakteriseren tussen de kleine molecule adenosine trifosfaat (ATP; 0,5 kDa) en de 25-nt korte ssDNA aptameer DH25.42 (7,9 kDa). In de loop van het manuscript wordt de bindingsplaats van de aptameer aan het ATP molecuul in kaart gebracht naar de adenine groep van ATP.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, België</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>A2383</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>A2754</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>A2252</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>A8626</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>A7007</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>11934511001</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>C1506</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>G8877</td><td>10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 &deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115</td><td>NanoTemper Technologies, München, Duitsland</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel MST-apparaat met standaarddetector, Monolith NT115 pico is MST-apparaat met gevoelige detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, München, Duitsland</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Duitsland</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, voorgeïnstalleerd op het apparaat</td><td>NanoTemper Technologies, München, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, München, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op atp gebruik van microschaal thermophoresis

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Karakterisering van moleculaire interacties in termen van fundamentele bindingsparameters zoals bindingsaffiniteit, stoichiometrie en thermodynamica is een essentiële stap in de fundamentele en toegepaste wetenschap. MicroScale Thermophoresis (MST) is een gevoelige biofysische methode om deze belangrijke informatie te verkrijgen. Deze technologie, die zich baseert op een fysisch effect genaamd thermoforese, dat de beweging van moleculen door temperatuurgradiënten beschrijft, maakt een snelle en nauwkeurige bepaling van bindingsparameters in oplossing mogelijk en biedt de vrije keuze van buffercondities (van buffer tot lysaten/sera). MST maakt gebruik van het feit dat een vrije molecuul een ander thermoforetisch bewegingspatroon vertoont dan een molecuul dat in complex is met een bindingspartner. De thermoforetische beweging verandert op het moment van moleculaire interactie als gevolg van veranderingen in grootte, lading en hydratatieomhulsel. Door de bewegingsprofielen van verschillende moleculaire verhoudingen van de twee bindingspartners te vergelijken, kan kwantitatieve informatie zoals bindingsaffiniteit (pM tot mM) worden bepaald. Zelfs uitdagende interacties tussen moleculen van kleine afmetingen, zoals aptameren en kleine verbindingen, kunnen worden bestudeerd met behulp van MST. Aan de hand van de goed bestudeerde modelinteractie tussen de DH25.42 DNA aptamer en ATP, biedt dit manuscript een protocol om aptamer-kleine molecuulinteracties te karakteriseren. Deze studie toont aan dat MST zeer gevoelig is en het mogelijk maakt om de bindingsplaats van de 7,9 kDa DNA aptamer op de adenine van ATP in kaart te brengen.

Bij deze studie werd MST aangebracht op de bindingsplaats van de DH25.42 DNA aptameer 18 karakteriseren op ATP. In tegenstelling tot andere studies karakteriseren van de interactie van ATP of ATP lijkende kleine moleculen eiwitten willekeurig gemerkt met één of meer fluoroforen 38-40 Deze studie omvat een gemerkte versie van het 7,9 kDa ssDNA aptameer met een Cy5 molecuul op het 5&#39;- uiteinde . Verschillende ATP derivaten en verwante moleculen, alle verschillend ...

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Het algemene doel van dit experiment is om interacties tussen DNA-aptameren en kleine moleculen te karakteriseren, inclusief het in kaart brengen van de bindingsplaats, met behulp van microscale thermophorese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de basisbindingsparameters van moleculaire interacties. Het belangrijkste voordeel van deze technologie is dat deze onafhankelijk is van de grootte van de interactiepartner, waardoor kwaliteitscontroledata van uitdagende interacties tussen aptameren en kleine moleculen verkregen kunnen worden.Hoewel deze methode inzicht kan geven in interacties tussen aptameren en kleine moleculen, kan deze ook worden toegepast op andere moleculaire interacties, zoals interacties tussen geneesmiddel en target of antigeen/antilichaam. Bereid voor het starten van de procedure een 100 micromolar stockoplossing van de Cy5-gelabelde DNA DH25.42 aptamer in gedestilleerd water. Verdun vervolgens de stockoplossing van de aptamer tot 200 nanomolar met bindingsbuffer.Incubeer de aptameer-werkoplossing gedurende twee minuten bij 90 °C. Koel de oplossing op ijs af tot kamertemperatuur. Label vervolgens low-binding microcentrifugebuisjes van 200 µL en zet deze klaar voor een seriële verdunning in 16 stappen van het te testen ligand.Pipetteer 20 µL van een 10 mM stockoplossing van ligand en bindingsbuffer in buis 1. Pipetteer 10 µL bindingsbuffer in buizen 2 tot en met 16. Draag vervolgens 10 µL ligand-stock van buis 1 over naar buis 2 en meng dit goed met de pipetteerpipet.Breng 10 µL van het verdunde mengsel over naar buis 3 en meng dit goed. Zet de seriële verdunning op deze manier voort, waarbij indien nodig wordt gecorrigeerd voor verdunningseffecten van de buffer, en gooi de overtollige 10 µL uit buis 16 weg wanneer u klaar bent. Voeg 10 µL van de aptameer-werkoplossing toe aan elke verdunning en meng dit goed met de pipet.Incubeer de monsters vijf minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens elk mengsel op in een schone standaardcapillair, waarbij u er op let dat u de capillair alleen aan de uiteinden aanraakt. Plaats de capillairs in de houder van het plateau in aflopende volgorde van concentratie.Start het MST-apparaat op en open de software voor instrumentbesturing. Schakel de handmatige temperatuurregeling in en stel de temperatuur van het instrument in op 25 graden Celsius. Zodra het instrument de juiste temperatuur heeft bereikt, plaatst u de capillairhouder.Stel het LED-kanaal in op rood voor het Cy5-gelabelde aptameer. Stel het LED-vermogen zo in dat een fluorescentiesignaal van 500 eenheden wordt bereikt. Voer vervolgens een capillaire scan uit om de capillaire posities te bepalen en controleer de kwaliteit van het monster.Als de resulterende pieken U-vormig of afgeplat zijn, bereid dan nieuwe monsters voor in gecoate capillairen om hechteffecten te minimaliseren. Vul in de software van het MST-instrument de ligandconcentratie en het verdunningstype voor de eerste capillair in. Klik en sleep om de concentraties en verdunningen voor de overige capillairen in te vullen.Voer de concentratie van het aptameer in het uiteindelijke mengsel in. Zorg ervoor dat de experimentmethode is ingesteld om fluorescentie gedurende vijf seconden te detecteren, de MST gedurende 30 seconden te registreren en vervolgens de fluorescentie gedurende vijf seconden te registreren nadat de laser is uitgeschakeld. Stel het laservermogen in op 20%. Stel het bestandspad in en slaag het experimentbestand op.Start vervolgens de MST-meting. Verkrijg op deze manier ten minste drie metingen. Om de data-analyse te starten, opent u de MST-analysesoftware en laadt u het experimentbestand.Selecteer MST als analysetype. De analyse-software maakt het mogelijk om technische herhalingen te vergelijken waarbij alle metingen van dezelfde set capillairen waren. Ook biologische herhalingen van een andere set capillairen kunnen aan de analyse worden toegevoegd.Klik op de informatieknop onder de eerste meting. Inspecteer de MST-curves op bulten of pieken die duiden op aggregatie- of precipitatie-effecten. Inspecteer vervolgens de capillairscan en de overlay van de capillairvorm op afgeplatte of U-vormige pieken die duiden op hechtings- of adsorptie-effecten.Aangezien aggregaten en absorptie-effecten snel detecteerbaar zijn in MST, maakt de methode een snelle optimalisatie van de technische opstelling mogelijk om een optimale datakwaliteit te waarborgen. Controleer in de capillaire scan en de initiële fluorescentie op ligand-afhankelijke fluorescentie-quenching of enhancement-effecten. Inspecteer de verandering in fluorescentie over de tijd op tekenen van fotobleken of foto-enhancement.Zodra de datakwaliteit is geverifieerd, schakelt u over naar de dosis-responsmodus. Selecteer de expertanalyse-instelling in de T Jump MST-evaluatiestrategie. Selecteer vervolgens het Hill-model voor curve-fitting om de bindingsparameters automatisch te berekenen.Select in het menu voor het vergelijken van resultaten een normalisatietype. Exporteer de genormaliseerde gegevens als een spreadsheet- of PDF-bestand. In deze procedure werd MST gebruikt om de bindingsinteracties van een enkelstrengs DNA-aptameer met een selectie van kleine molecuulliganden te onderzoeken.De MST-curves zijn gefit met de Hill-vergelijking en de waarden voor de halve maximale effectieve concentratie zijn bepaald. In vijf onafhankelijke biologische herhalingsmetingen van het aptameer met ATP vertoonde de interactie tussen het ATP-aptameer een negatieve bindingsamplitude van 6 tot 13 eenheden en een gemiddelde EC50-waarde van ongeveer 52,3 micromolair. De gegevens voor elk ligand zijn genormaliseerd naar de fractie gebonden moleculen en vervolgens vergeleken.De EC50-waarden voor ADP, AMP en SAM vergeleken met ATP suggereren dat het aantal fosfaatgroepen hoogstens een geringe invloed heeft op het bindingsgedrag van het aptameer. Verwijdering van de ribose-C2-hydroxylgroep vertoonde eveneens slechts een gering effect op de bindingsaffiniteit van het aptameer. Het aptameer bond niet in afwezigheid van een paringsgroep of wanneer de paringsgroep was veranderd in guanine.Het aptameer bond wel aan adenine alleen, wat verder aantoont dat de adeninegroep de belangrijkste bindingsplaats voor het aptameer is. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in enkele minuten tot uren essentiële informatie over basisbindingsparameters verschaffen.

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

SELEX protocollen bestaan ​​uit meerdere ronden van selectie, die elk vereisen regeneratie van gebonden liganden, die op hun beurt behoefte aan vaste primer sequenties aan weerszijden van de willekeurige bibliotheek regio's. Deze vaste primer sequenties kunnen interfereren met de selectieprocedure (vals positieven en negatieven). Hier presenteren wij een primer-vrij protocol.

Primer-Free aptameer Selection behulp van een random DNA-bibliotheek

This video demonstrates microscale thermophoresis for studying the protein-lipid interaction. The assay detects the interaction between molecules by quantifying the thermophoretic movement of fluorescent-labeled proteins in response to a temperature gradient. The fluorescent molecule is mixed with different concentrations of the non-fluorescent lipid molecules, and the mixture of molecules in the solution is loaded into capillaries. A temperature gradient is applied to the samples in the...

Microscale Thermophoresis to Study Protein-Lipid Interactions in Solution

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.

Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.

Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie

Dit protocol schetst het ontwerp van gesplitste hybridisatiesondes die gebruik maken van fluorescerende oplichtende aptameer DAP-10-42 als signaalreporter en hun toepassing voor nucleïnezuurdetectie en differentiatie tussen doelen met single-nucleotidesubstituties.

Gesplitste hybridisatiesonde die gebruik maakt van een DNA-fluorescerende oplichtende aptameer als signaalreporter voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse

Leer de bindingsplaats van een DNA-aptameer op ATP in kaart brengen met microschaal thermoforese. Deze methode bepaalt bindingsaffiniteit en stoichiometrie onafhankelijk van molecuulgrootte.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Meer video's verkennen