Name: Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Leer hoe je orthotopische niercelcarcinoomtumoren in muizen opzet via intrarenale implantatie van Renca-cellen. Deze methode maakt kwantitatieve evaluatie van tumorprogressie en longmetastasen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Cancer Institute (R15CA173657 AW en R01CA109446 naar TSG), de Simmons Cancer Institute (AW), en de Universiteit van Minnestoa Klim 4 Kidney Cancer Foundation (naar TSG). Wij danken Dr. Kristin Anderson voor hulp bij de immunofluorescentie.

Het volgende protocol beschrijft een procedure voor het induceren van experimentele en controle op de groei van experimentele orthotope niertumoren en eventuele spontane metastasen. Alle volgende procedures worden gedaan in overeenstemming met de institutionele beleid en goedgekeurde procedures met betrekking tot het humane gebruik van proefdieren. 1. Onderhoud van cellijnen <ol><li> Handhaaf murine renale adenocarcinoom cellijn, Renca, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% penicilline-streptomycine en 1 mM elk van niet-essentiële aminozuren, L-glutamine en natriumpyruvaat (aangeduid met compleet RPMI). Kweekcellen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: Zoals voor alle vastgestelde cellijn, is het raadzaam om lage passage nummer Renca-cellen gebruikt voor transfectie en daaropvolgende implantatie één fenotypische en genetische veranderingen die kunnen optreden na langdurige cult minimaliserenure. <ol><li> Gebruik een transposon systeem Renca-cellen manipuleren om stabiel tot expressie green fluorescent protein (GFP) en vuurvlieg luciferase. <ol><li> Onder toepassing van een kationisch liposoom gebaseerd transfectiereagens, co-transfecteren Renca-cellen met een transposase expressievector (pPGK-SB11) en een transposon vector codeert voor de expressie van vuurvlieg luciferase, evenals een fusiegen dat codeert voor GFP en het zeocine resistentiegen beide onder transcriptionele controle van een bidirectionele promoter (pKT2 / Lubig) 19. </li><li> Twee dagen later, bord de getransfecteerde cellen bij een beperkende verdunning en de cellen te laten groeien in compleet RPMI aangevuld met zeocine (300 ug / ml). Bevestigen GFP expressie in elke kloon door flowcytometrie. Deze cellen worden genoemd Renca-GL. OPMERKING: beperken van verdunningsklonering de geselecteerde cellen zijn afgeleid van een enkele cel toe. </li></ol></li></ol></li><li> Om Renca cellen intrarenally implantaten, bereiden Renca cellen into een eencellige suspensie met 2 x 10 6 cellen / ml in Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). <ol><li> Renca verwijderen hechtende cellen uit de weefselkweekfles behulp van 0,25% trypsine in HBSS. Na -5 minuten, voeg volledig RPMI aan de kolf met het trypsine te neutraliseren en zet de cellen om een ​​centrifugebuis voor het wassen. Centrifugeer de cellen bij 300 relatieve centrifugale kracht g (RCF xg) gedurende 5 minuten bij 25 ° C. </li><li> Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in HBSS. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zet het volume met HBSS om 2 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Trek de cellen in een 1 ml spuit uitgerust met een 18-gauge naald om afschuifspanning te voorkomen op de cellen. Vervang de 18-gauge naald met een 28-gauge naald vóór de injectie van de tumorcellen. Een injectie van 0,1 ml levert 2 x 10 5 cellen in de nier. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgische Area Voorbereiding <ol><li> Bereid een steriele chirurgischegebied van een bio kast door een steriele chirurgische laken op een verwarmingskussen. Verzamel alle benodigdheden, zoals forceps, scalpel, schaar, oogdruppels, 5% povidon-jood antiseptische en steriel gaas. Autoclaaf alle instrumenten voor gebruik. </li><li> Voer de operatie met behulp van een aseptische tip techniek. Steriliseren instrumenten tussen dieren met een kraal sterilisator. Draag steriele handschoenen, een laboratoriumjas en een gezichtsmasker. </li></ol> 3. Bereiding van dieren <ol><li> Verdoven de muizen met ketamine / xylazine (87,5 mg / kg en 12,5 mg / kg, ip) volgens de institutionele richtlijnen. Bepaal verdoving diepte door het uitvoeren van een teen-snuifje. </li><li> Wanneer het dier wordt beschouwd als niet-responsief, bereid de injectieplaats (bijvoorbeeld linker flank) aan Balb / c muizen door plukken (met de vingers) of scheren (via scheren) van de vacht. </li><li> Verplaats de muizen van de operatie prep gebied (bijvoorbeeld de huiskooi) op de chirurgische stippellijn toepassing dierenarts zalf op deogen om uitdroging te voorkomen. Breng ruim zwabberen de voorbereide incisie site met 5% povidonjood antiseptische. </li><li> Injecteren bupivacaine hydrochloride (0,1 ml van een 2,5 mg / ml oplossing sc) in het gebied waar de incisie wordt gemaakt als een pre-operatieve analgesie. </li><li> Voeg een insnijding (~ 1,0-1,5 cm) op de linkerflank van de dieren met een steriele scalpel of schaar voorzichtig om te voorkomen dat het buikvlies dringen. Scheid de dermis van het buikvlies met steriele schaar. Dep de incisie site met steriel gaasje om geen bloed te verwijderen. </li><li> Houd de muis met beide handen vast, met de linker hand op het hoofd en de rechterhand houden om de flank te ondersteunen. </li><li> Identificeer de milt via het peritoneum en met één vinger van de rechterhand, palperen muis van onderaf; de nier is nu zichtbaar door het peritoneum zijn. Houd een stevige greep van het dier om de spanning aan de overkant van het buikvlies en de nieren te bieden. </li><li> Laat een tweede persoon te injecteren de tumor cells (bereid in paragraaf 1.2.) door de intacte peritoneum in het midden van de nier met een 1 ml injectiespuit voorzien van een 28-gauge naald. Leveren langzaam 0,1 ml (2 x 10 5) cellen. Zodra de cellen zijn geïnjecteerd, houdt de naald op zijn plaats gedurende 5-10 s met het terugstromen van cellen te verminderen. Het is belangrijk om de behoefte aan uiterst voorzichtig mee tijdens deze stap, als de persoon die het injecteren van de cellen van de naald zal brengen in de nabijheid van de vingers van de persoon die de muis. </li><li> Verwijder de naald en sluit de incisie met een dun laagje cyanoacrylaat weefsellijm. </li><li> Leg het dier weer in een schone kooi met een steriele papieren handdoek. Laat de dieren om te herstellen op een verwarmingselement. Laat de dieren niet onbeheerd achter tijdens de herstelperiode. Laat de dieren niet terug naar woonomstandigheden tot ze rechtop en borstbeen. Volg de institutionele richtlijnen in alle procedures het gebruik van proefdieren. </li></ol> 4. Bioluminescent Imaging <ol><li> Monitor tumorgroei door bioluminescentie beeldvorming. OPMERKING: Procedurele informatie voor het uitvoeren van bioluminescente beeldvorming kan worden verkregen van Lim et al. 20 De luciferase-signaal kan worden gedetecteerd zo vroeg als 24 uur na tumorcel implantatie. Aangezien er geen extern zichtbare tumor in dit model, is het essentieel om tumorgroei periodiek. Afhankelijk van het experiment ontworpen, kan orthotope tumorgroei verlopen gedurende variërende tijdsduur. Een voordeel van het gebruik van de luciferase expressie Renca-cellen die tumorgroei herhaaldelijk kan worden gevolgd hetzelfde dier regelmatig gedurende de duur van het experiment en een specifieke ondervraging van tumordragende en tumorvrij organen kan worden gedaan op een bepaald eindpunt. <ol><li> Injecteren luciferine (0,1 ml van een 15 mg / ml oplossing in steriel PBS) ip en laat circuleren gedurende 10 minuten voordat de muis in de bioluminescentie beeldvormingssysteem. Plaats de mo<html> Gebruik met zijn rug naar boven opgerold lichtjes op de zijkant, teneinde de geïnjecteerde nieren naar boven hebben. </li><li> Meet de tumorlast in fotonen uitgezonden per seconde (foton flux) binnen een gedefinieerd gebied van belang (ROI) met behulp van beeldanalyse software. </li></ol></li><li> Kwantificering van de tumor belasting in individuele organen. OPMERKING: Kwantificering kan worden uitgevoerd op bepaalde tijdstippen in individuele organen na verwijdering uit muizen geëuthanaseerd. <ol><li> Injecteren muizen met luciferine, zoals in stap 4.1. </li><li> Na 10 min, euthanaseren de muizen met een erkende procedure. </li><li> Ontleden de organen van belang (bijvoorbeeld, de nieren en de longen; zie punt 5 hieronder). Breng het weefsel 35 x 10 mm petrischalen en plaats ze in de bioluminescentie beeldvormingssysteem. </li><li> Meet de tumorlast in fotonen uitgezonden per seconde (foton flux) bij een gedefinieerde roi behulp van beeldanalyse software. </li></ol></li></ol><html> e_title &quot;&gt; 5. Organ Harvest <ol><li> Bij een gedefinieerde eindpunt voor de afzonderlijke experimenten, euthanize tumordragende muizen volgens institutionele richtlijnen voorkeur (bijvoorbeeld CO2, cervicale dislocatie, verdoving overdosis). Vermijd echter cervicale dislocatie als longen moeten worden verzameld na Oost-Indische inkt inflatie. </li><li> Voer een grove beoordeling van primaire renale tumorgroei bij de geïnjecteerde nieren door het meten van het natte gewicht van de organen. <ol><li> De tumormassa (in g) bepalen, isoleer 21 en wegen van de tumordragende nieren en de contralaterale nier van dezelfde muis, waar het verschil in de nier gewicht bepaalt de tumormassa. ontleden zorgvuldig verwijderd eventueel overtollig bindweefsel uit de uitgesneden nieren voor het meten van hun gewicht. </li></ol></li><li> Beoordeelt de mate van tumor metastase naar de longen door het opblazen van de longen met Indische inkt voorafgaand aan excisie en onmiddellijk vaststelling van de longen in oplossing Fekete&#39;slass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Handmatige berekening van metastatische laesies op het longoppervlak kan dan worden uitgevoerd. <ol><li> Maak een middellijn incisie met een schaar te beginnen bij het midden van de buik, door de ribbenkast, en omhoog door de nek / speekselklieren. Verwijder voorzichtig de ribbenkast met een schaar en forceps, zonder het longweefsel. </li><li> Expose de trachea door het verwijderen van het bindweefsel. </li><li> Bereid een 3 ml spuit met een 18-gauge naald gevuld met 10% Indische inkt oplossing in HBSS. </li><li> Met behulp van pincet voorzichtig draad een zijden hechtdraad onder de luchtpijp. Dit zal worden gebruikt om af te hechten de luchtpijp eenmaal opgeblazen. </li><li> Steek de naald in de luchtpijp en langzaam druk de spuit aan de longen met Oostindische inkt oplossing te blazen. Ongeveer 1-1,5 ml Indische inkt oplossing volledig opblazen van de longen. </li><li> Knijp de trachea afgesloten door binden verschillende knopen, met het hechtmateriaal onder de naald om de terugstroming van de inkt verhinderen. </li><li> afneeme de naald voorzichtig weggesneden het bindweefsel om de opgeblazen longen verwijderd. </li><li> In een chemische zuurkast plaats de longen in een 15 ml conische buis met 5 ml oplossing Fekete&#39;s (35 ml 95% EtOH, 15 ml dH 2 O, 5 ml formaldehyde en 2,5 ml ijsazijn in een 100 ml glazen fles) 23. </li><li> Laat de longen te repareren / ontkleuring voor 24-48 uur bij kamertemperatuur voorafgaand aan het handmatig tellen ontkleurd tumornodulen. </li><li> Verwijder het intacte longen na ontkleuren en zorgvuldig ontleden vaste longen door het uitsteeksel in een 35 x 10 mm petrischaal. Tel het aantal tumornodules (witte nodules) op elk uitsteeksel onder een dissectiemicroscoop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).</li>
<li>Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+for+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors for kidney cancer.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).</li>
<li>Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+incidence+of+small+renal+masses%3A+a+need+to+reassess+treatment+effect%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).</li>
<li>Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+and+future+perspectives+of+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma.</a> Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).</li>
<li>Rini, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+cancer%3A+therapeutic+advances+through+understanding+the+molecular+basis+of+response+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance.</a> Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).</li>
<li>Acquavella, N., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+trying+but+failing+to+improve+the+only+curative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy.</a> J. Immunother. 36, 459-461 (2013).</li>
<li>Salup, R. R., Wiltrout, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+immunotherapy+of+established+murine+renal+cancer+by+interleukin+2-stimulated+cytotoxic+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes.</a> Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).</li>
<li>Ko, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+differential+suppression+of+myeloid-derived+suppressor+cell+subsets+by+sunitinib+is+compartmentally+constrained%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained.</a> Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).</li>
<li>Kusmartsev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+regulates+expression+of+VEGFR1+in+myeloid+cells%3A+link+to+tumor-induced+immune+suppression+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma.</a> J. Immunol. 181, 346-353 (2008).</li>
<li>Rocha, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+gene+therapy+enhances+the+efficacy+of+IL-2+in+suppressing+metastatic+renal+cell+carcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice.</a> Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).</li>
<li>Shanker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+metastatic+solid+tumors+with+bortezomib+and+a+tumor+necrosis+factor-related+apoptosis-inducing+ligand+receptor+agonist+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).</li>
<li>VanOosten, R. L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tumor-specific+CD8%2B+T+Cells+after+intratumoral+Ad5-TRAIL%2FCpG+oligodeoxynucleotide+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy.</a> Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).</li>
<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+in+different+anatomical+sites+can+sculpt+and+vary+the+tumor+microenvironment+to+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy.</a> Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+potency+of+regulatory+T+cell-mediated+immunosuppression+in+kidney+tumors+compared+to+subcutaneous+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors.</a> Oncoimmunology. 3, 963395(2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+tumors+can+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between tumors can affect responses to therapy.</a> Oncoimmunology. 4, 975572(2015).</li>
<li>Norian, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+metastatic+renal+cell+carcinoma+after+adenovirus-encoded+TNF-related+apoptosis-inducing+ligand+%28TRAIL%29%2FCpG+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy.</a> PLoS One. 7, 31085(2012).</li>
<li>Matin, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+response+to+renal+cryoablation+in+an+in+vivo+orthotopic+renal+cell+carcinoma+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model.</a> J. Urol. 183, 333-338 (2010).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+source+of+transposase+for+Sleeping+Beauty-mediated+gene+insertion+and+expression+in+somatic+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues.</a> Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).</li>
<li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG-mediated+modulation+of+MDSC+contributes+to+the+efficacy+of+Ad5-TRAIL+therapy+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).</li>
<li>James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24711083">Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+alters+dendritic+cell+function+in+the+presence+and+absence+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth.</a> J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).</li>
<li>Brincks, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triptolide+enhances+the+tumoricidal+activity+of+TRAIL+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma.</a> FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+intravascular+staining+redefines+lung+CD8+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses.</a> J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

We presenteren een protocol voor een orthotope RCC muismodel. Implantatie van muizen renale adenocarcinoom tumorcellen in de muis nier levert een klinisch relevante model mRCC. Dit model levert een primaire tumor in de nieren en metastasen in de longen, die beide kenmerken van geavanceerde RCC. De beschrijving hierin gepresenteerde specifiek is voor het Renca cellijn immunocompetente Balb / c muizen. Met deze orthotope model hebben we aangetoond dat de Renca tumoren reageren op immunotherapie, aantonen van de bruikbaarh...

Niercelcarcinoom (RCC) is goed voor het merendeel van de kwaadaardige nier tumoren en ongeveer 3% van alle volwassen maligniteiten wereldwijd 1, 2. Wegens gebrek aan symptomen, verkeerde diagnose en onvoldoende screeningsmethoden voor RCC, bijna 30% van de patiënten ten tijde van de diagnose te stellen met metastatische RCC (mRCC), met een extra 20-30% van de patiënten progressie naar een metastatische fase 2. Deze gevallen leiden tot ~ 13.500 sterfgevallen per jaar 1, 3. Hoewel vroege detectie en behandeling van primaire RCC is verbeterd, de snelheid van RCC-gerelateerde dood blijft toenemen, wat suggereert dat metastatische ziekte is grotendeels verantwoordelijk voor de sterfte 3. Ontwikkeling van behandelingen bij RCC heeft geboekt in het afgelopen decennium met de ontdekking en de implementatie van gerichte therapieën en immuuntherapie. Helaas, progressievrije overleefdeal en totale overleving van gevorderde gevallen nog steeds ruim onder 2 jaar voor de meeste patiënten 4, 5, 6. Deze statistieken rechtvaardigen de noodzaak voor verder onderzoek naar de identificatie en ontwikkeling van effectieve behandelingen voor RCC. Om adequaat te bevorderen therapeutische interventies voor mRCC worden translationeel relevante pre-klinische modellen van de ziekte voor het eerst nodig is. Ontwikkeling van een relevante en consistente model om de menselijke conditie van geavanceerde RCC recapituleren moet een aantal belangrijke vragen: 1) Is het model anatomisch relevant; 2) Is de tumor vooruitgang vergelijkbaar met de humane pathologie; 3) Doe uitzaaiingen ontstaan ​​uit de primaire tumor; en 4) Kan de primaire en metastatische progressie van de tumor worden gevolgd in de tijd? Afhankelijk van het type behandeling onderzocht, muis RCC tumorcellijnen, humane RCC tumorcellijnen en humane RCC-patiënten afgeleide xenogvlotten kunnen in immunocompetente of immunodeficiënte muizen. Een gastheer met een intact en functioneel immuunsysteem nodig voor de studies die een aspect van immunotherapie, in het gebruik van de goed beschreven Renca cellijn afgeleid van een spontane renale adenocarcinoom van Balb / c muizen 7. De meeste studies injecteren Renca-cellen subcutaan (sc), die een gemakkelijke maat lokale tumor vormt, of intraveneus (iv) in Balb / c muizen experimentele long &quot;metastasen&quot; 8, 9, 10, 11, 12 te produceren. Gebruik van een sc-geïmplanteerde Renca tumor model humane RCC heeft een aantal beperkingen, met inbegrip van onnauwkeurige innervatie van vasculatuur 13 verschillen in micro 14, 15, en noch orgaanschade / tumor cellulaire communicatie 13, 16. Bovendien zijn veel sc tumoren (in het bijzonder Renca) niet uitzaaien naar distale organen remmen van de studie van een gebeurtenis die een gemeenschappelijke klinische kenmerken 17. MRCC te bestuderen, kunnen Renca-cellen worden iv geïnjecteerd om tumorlast te vestigen in de longen the zetel van uitzaaiingen in RCC patiënten. De iv injectie methode voor het inleiden uitgezaaide tumoren, maar staat niet toe dat het onderzoek naar hoe, wanneer of waarom de cellen zijn gemigreerd van de primaire orgel (dat wil zeggen, de nieren) naar de verre plaats. Een model met zowel primaire als metastatische ziekte duidelijk in hetzelfde dier is cruciaal voor de voortgang en de behandeling van gevorderde ziekte te bestuderen, vooral omdat metastasen typisch de oorzaak van mortaliteit bij deze patiënten. Ons laboratorium heeft een muizenmodel van mRCC dat alle van de hierboven genoemde functies bevat ontwikkeld. Om pr vast te stellenimary, orthotope tumoren worden Renca cellen direct geïmplanteerd in de nier van de dieren door de doorzichtige peritoneum. Een kleine incisie in de linkerflank maakt visualisatie van de milt (als landmark) en de linker nier. Met een kleine naald maat worden Renca tumorcellen direct geïnjecteerd in de nier door het peritoneum van orthotope implantatie. Vergeleken met andere werkwijzen voor het implanteren Renca-cellen onder de niercapsule 18 deze wijze van implanteren zorgt voor een hogere doorvoersnelheid, aangezien het tamelijk non-invasieve, hoeft hechten vereisen, is een lage pijn klasse en tijdbesparende bij geoefend. Dit goed gekarakteriseerd model leidt tot reproduceerbare primaire tumorbelasting (~ 99% opbrengst rate) in het geïnjecteerde nieren en metastatische tumor belasting in de longen. De belangrijkste voordelen van dit model zijn onder meer de syngene aard, waardoor voor immunotherapie onderzoeken; haar spontane metastasen, om te studeren eendvanced ziekte; en de orthotope implantatie, de anatomische invloed van ziekteprogressie en behandeling modelleren. Therapieën gericht op targeting RCC zouden veel baat hebben bij het gebruik van dit model tijdens de preklinische ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>Artificial tears ophthalmic ointment</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>CBGBIW011019</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)</td><td>Purdue Products, L.P.</td><td>NDC 67618-155-32</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection)</td><td>Hospira</td><td>0409-1587-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Venture</td><td>908291</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>NDC 57319-609-02</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-111</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Caliper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Chartpak Inc</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sleeping Beauty (SB) transposon system</td><td>Neuromics</td><td>SBT0200</td><td></td></tr><tr><td>Renca</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr></tbody></table>

een syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor kwantitatieve en longitudinale evaluatie van de preklinische therapieën

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Niercelcarcinoom (RCC) van invloed op&gt; 60.000 mensen in de Verenigde Staten elk jaar, en ~ 30% van de RCC patiënten hebben meerdere uitzaaiingen op het moment van de diagnose. Gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) is ongeneeslijk, met een mediane overleving van slechts 18 maanden. Immuun-interventies (bijvoorbeeld, interferon (IFN) en interleukine (IL) -2) induceren duurzame reacties in een fractie van mRCC patiënten en multikinaseremmer remmers (bijv sunitinib of sorafenib) of anti-VEGF-receptor monoklonale antilichamen (mAb) zijn grotendeels palliatieve, als complete remissies zijn zeldzaam. Dergelijke tekortkomingen in de huidige therapieën voor mRCC patiënten de reden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsprotocollen. Een sleutelcomponent in de preklinische testen van nieuwe therapieën voor mRCC een geschikt diermodel. Gunstige eigenschappen dat het menselijk herhalen omvat een primaire niertumor, nier tumormetastasen en een intact immuunsysteem één therapie gedreven immunologische onderzoeken effector reacties en de vorming van tumor geïnduceerde immuno-onderdrukkende factoren. Dit rapport beschrijft een orthotope mRCC muismodel dat al deze functies heeft. We beschrijven een intrarenaal implantatietechniek met de muis renale adenocarcinoom cellijn Renca, gevolgd door de beoordeling van tumorgroei in de nier (primaire plaats) en de longen (metastatische lokalisatie).

<html> De succesvolle implantatie van Renca-cellen leidt tot de ontwikkeling van tumoren in de nier en metastase naar de longen van de muizen. Na de excisie van de tumor-dragende en de contralaterale nieren werden vochtige doekje gewicht (g) gemeten om de tumorbelasting basis van gewichtstoename (figuur 1) tonen. Renca tumoren kunnen worden geïdentificeerd door immunohistochemie met cytokeratine 8 en 18 kleuring (figuur 2). Voor longitudinale studies, wer...

Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen van orthotope renale tumoren bij muizen door middel van intrarenale implantatie van tumorcellen voor de studie naar tumorgroei en metastase en de effectiviteit van anti-tumortherapieën. Deze methode kan worden gebruikt om cruciale vragen in het vakgebied van de urologische oncologie te beantwoorden, zoals de effectiviteit van een nieuwe therapie in een preklinisch model van nierkanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat intrarenale tumorimplantatie een primaire, naar de longen metastaserende renale tumor creëert die de klinische pathogenese van het renale celcarcinoom nabootst.Om de Renca-tumorcellen voor te bereiden, wordt de celcultuur eerst losgemaakt met 0,25% Trypsine en HBSS na spoelen met PBS. Neutraliseer de reactie na vijf minuten met compleet RPMI-medium. Breng de cellen over naar een conische buis voor centrifugatie en resuspendeer het pellet in vers HBSS.Pas na het tellen het volume aan naar een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter in HBSS, en trek de cellen op in een spuit van 1 milliliter die is voorzien van een naald met een diameter van 18 gauge. Plaats vervolgens een steriel chirurgisch laken over een warmtemat en bevestig het juiste sedatieniveau via een teenknijptest. Verwijder het haar van de linkerflank van de muis en breng veterinaire zalf aan in de ogen.Reinig vervolgens de implantatieplaats met 5% povidonjodium-antisepticum en gebruik een steriel scalpel om een enkele incisie van één tot anderhalve centimeter te maken in de linkerflank, waarbij u er zorg voor draagt dat het peritoneum niet wordt gepenetreerd. Scheid met een schaar de dermis van het peritoneum en dep de incisieplaats met steriel katoengas om eventueel bloed te verwijderen. Pak vervolgens de kop met de linkerhand vast en ondersteun de flank met de rechterhand om de milt door het peritoneum te lokaliseren.Palpeer de muis van onderaf met één vinger van de rechterhand. De nier zou zichtbaar moeten worden. Terwijl het dier stevig wordt vastgehouden om spanning over het peritoneum en de nier te creëren, laat u een assistent langzaam 0.1 milliliters van de Renca-cellen door het intacte peritoneum in het centrum van de nier injecteren.Houd de naald vijf tot 10 seconden op zijn plaats om de terugstroom van de cellen te verminderen. Sluit vervolgens de incisie met een dunne laag cyanoacrylaat-weefsellijm. Gebruik aan het einde van het experiment een schaar om een midline-incisie te maken, beginnend bij de middenbuik door de ribbenkast, de nek en de speekselklieren.Verwijder met een schaar en een pincet voorzichtig de ribben zonder het longweefsel te beschadigen, en verwijder het bindweefsel om de trachea bloot te leggen. Vul een spuit van drie milliliter, voorzien van een naald van 18 gauge, met 10% India Ink en PBS. Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig een zijden hechtdraad onder de trachea door te rijgen en maak vervolgens een losse knoop.Steek vervolgens de naald voorzichtig in de trachea en blaas de longen langzaam op met één tot anderhalf milliliter van de India Ink-oplossing. Trek de knoop rond de trachea strak aan om terugstroom van de inkt te voorkomen, verwijder daarna de naald en snijd voorzichtig het bindweefsel weg om de opgeblazen longen te verwijderen. Fixeer de longen in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter Fekete-oplossing in een chemische zuurkast bij kamertemperatuur.Verwijder na 24 tot 48 uur de intacte, ontkleurde longen en trek de lobben voorzichtig uit elkaar in een petrischaal van 35 bij 10 millimeter. Tel vervolgens het aantal witte tumornoduli onder een dissectiemicroscoop. Een succesvolle intrarenale implantatie van Renca-cellen bij muizen resulteert in tumorontwikkeling in de nier en metastasering naar de longen, waarbij tumordragende dieren een aanzienlijke tumorlast vertonen, gemeten aan het verhoogde gewicht van de tumor-geïmplanteerde nieren.Zoals waargenomen, kunnen Renca-tumoren worden geïdentificeerd door immunohistochemische kleuring voor Cytokeratin 8 en 18. De implantatie van een luciferase-expresserende Renca-cellijn maakt het mogelijk om de tumorlast in de nier en metastasering naar de longen te volgen via bioluminescent imaging, wat verder is bevestigd door longinflatie met India-inkt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan vijf minuten per muis worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de nier via het peritoneum duidelijk te identificeren om een nauwkeurige intrarenale tumorimplantatie te waarborgen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals preklinische drugstests, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals in welke mate een nieuw geneesmiddel de groei of metastase van intrarenale tumoren beïnvloedt. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u intrarenale tumorcelimplantatie uitvoert voor het tot stand brengen van orthotope niertumoren in de muis.Vergeet niet dat het werken met levende dieren en chirurgische instrumenten gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het volgen van institutionele richtlijnen voor het omgaan met dieren en het handhaven van een steriel chirurgisch gebied en steriele instrumenten.

a-syngeneic-mouse-model-metastatic-renal-cell-carcinoma-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In this video, we develop an orthotopic mouse model of renal cell carcinoma. This model results in reproducible primary tumors in the injected kidney and metastatic tumors in the lung, allowing the evaluation of disease progression and treatment.

Generating Renal Cell Carcinoma Model: A Protocol to Develop Orthotopic RCC Murine Model by Intrarenal Implantation of Cancer Cells

Dit orthotopisch model van menselijke prostaatkanker maakt kwantificering van tumorgrootte circulerende tumorcellen en de vorming van verschillende metastase naar de longen. Omdat de cellen van het belangrijkste orgaan moet ontsnappen, in de bloedsomloop, en implantaat in een tweede locatie, dit model effectief recapituleert het scenario bij de mens.

Een orthotope muizenmodel van menselijke prostaatkankercellen Metastasis

Modellen van spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (RCC) ziekteprogressie kan worden gebruikt voor het evalueren behandelingen klinisch relevante omgeving. Dit protocol toont verschillende procedures voor orthotopic nier tumorcelimplantatie, goede nefrectomie, en ten slotte schetst een necropsy gids voor visuele en bioluminescente scoren van metastatische last en lokalisatie.

Modelleren Spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) bij muizen na nefrectomie

Een preklinische, muizenmodel van levermetastasen uitgevoerd via een hemispleen injectietechniek.

Een preklinisch muizenmodel van levermetastasen

De metastatische verspreiding van kanker de belangrijkste oorzaak van kankersterfte. Wij bieden een uitgebreide beschrijving van ons overleven chirurgie methodologie voor de oprichting van een "patiënt-achtige" orthotoop syngeen muis modelsysteem voor het bestuderen van de mechanismen van metastase in vaste orgel tumoren.

Een &quot;Patiënt-Like&quot; Orthotope Syngene Mouse Model van Hepatocellular carcinoom metastase

Dit protocol beschrijft de generatie van muizen orthotope blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen en de monitoring van tumorgroei.

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Dit is een effectieve methode om te screenen op suppressors of drivers van kankermetastase. Cellen, getransduceerd met een expressiebibliotheek, worden geïnjecteerd in het kippen chorioallantoïsche membraan vasculatuur om gemetastaseerde kolonies te vormen. Kolonies met verminderde of verhoogde invasiviteit worden verwijderd, uitgebreid, opnieuw geïnjecteerd om hun fenotype te bevestigen en ten slotte geanalyseerd met behulp van sequencing met hoge doorvoer.

Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

Dit artikel beschrijft een workflow van technieken die worden gebruikt voor het testen van nieuwe kandidaat-mediatoren van melanoommetastase en hun werkingsmechanisme (s).

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Een grote uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor longkanker is het modelleren van de micro-omgeving van de tumor naarmate de regionale ziekte evolueert naar gemetastaseerde ziekte. Hier beschrijven we een eenvoudige methode om een orthotopisch syngeen model van longkanker op te stellen dat het mogelijk maakt om in vivo de ziekte in de loop van de tijd te volgen.

Een minimaal invasieve methode voor het genereren van een syngeen orthotopisch muismodel van longkanker

Leer hoe je orthotopische niercelcarcinoomtumoren in muizen opzet via intrarenale implantatie van Renca-cellen. Deze methode maakt kwantitatieve evaluatie van tumorprogressie en longmetastasen mogelijk.

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën (Video) | JoVE Journal

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Meer video's verkennen