Name: Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Leer capillaire zone-elektroforese voor analyse van monoclonale antilichamen met een neutrale capillair. Dit protocol verbetert analytische vaardigheden en zorgt voor betrouwbare kwaliteitsbeoordeling in therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Wiley voor de toegestane toestemming om de concepten van de volgende publicatie te gebruiken voor deze tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analyse van recombinante monoklonale antilichamen door capillaire zone-elektroforese. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dit werk werd ondersteund door CONACyT, Mexico, subsidie 230551.

1. Voorbereiding van de Solutions <ol><li> Bereid de BGE-oplossing. <ol><li> Bereid 100 ml van een oplossing bestaande uit 0,05% (m / v) hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), 200 mM ε-amino n-capronzuur (EACA) en 30 mM lithium acetaat. OPMERKING: HPMC is een veerkrachtig polymeer, giet het poeder in een glazen beker, voeg 80 ml water en tenslotte de voeg roerstaaf. Ga door het toevoegen van de resterende reagentia als normaal. Draag een veiligheidsbril bij het hanteren van lithium-acetaat als het irritatie van de ogen kan veroorzaken. </li><li> Breng de pH waarde 4,8 ± 0,1 met 50% (v / v) azijnzuur. Laat de oplossing stabiliseren 5 min en indien nodig aan. </li><li> Voeg water toe tot een totaal van een eindvolume van 100 ml volumetrische kolf. </li><li> Filtreer door een hydrofiel membraan met een 0,2 micrometer poriegrootte. </li><li> Bewaar bij 2-8 ° C gedurende maximaal 7 dagen. </li></ol></li><li> Bereid de interne standaard. <ol><li> Bereid 1 mlvan een oplossing bestaande uit 1% (m / v) histamine. </li><li> Filtreer door een hydrofiel membraan met een 0,2 micrometer poriegrootte. </li><li> Bewaar bij 2-8 ° C tot 1 dag. </li></ol></li></ol> 2. Monstervoorbereiding <ol><li> Bereid 180 pi mAb monster verdund met Tris buffer (50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethaan, pH 8,0) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml. </li><li> Voeg 20 pl 1% (m / v) histamine. </li><li> Mengen en centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 sec. </li><li> Plaats een micro flesje in een universele flacon. </li><li> Breng het monster in de micro flesje en de dop op de universele flacon. Verdeel het monster naar boven om te voorkomen dat de invoering van eventuele luchtbellen. </li><li> Bewaar bij 2-8 ° C tot 1 dag. </li><li> Plaats de universele flacon (met micro injectieflacon met monsteroplossing) in het monster inlegbak. </li></ol> 3. Bereiding van CE System. <ol><li> CE-systeem schoonmaken. LET OP: th Conductis procedure ten minste eenmaal per week om elektrische lekstromen afgeleid van ophoping van stof en vuil te voorkomen. Afhankelijk van de toepassing (bijvoorbeeld, gebruik van een BGE met verhoogde viscositeit of hoge zoutconcentratie, monsters met verhoogde viscositeit) elektroden en Openingshefboom vereisen vaker worden gereinigd om kruisbesmetting sample overdracht te voorkomen. <ol><li> Schakel de schakelaar van de CE-instrument en open de voordeur. </li><li> Reinig het oppervlak van het monster te dekken, monster houden systeem (monster en buffer trays), cartridgekap, klem bar, interface blok en elektroden met een met water bevochtigde geweven vegen. Herhaal de procedure met een met ethanol bevochtigd af te vegen en droog zijn voor gebruik. </li><li> Spoel de opening hefbomen grondig met water. Reinig het oppervlak met een niet-geweven doekje. Herhaal de procedure met een met ethanol bevochtigd af te vegen en droog voor de installatie. </li><li> Maak de twee uiteinden van de glasvezelkabel voorzichtigly met een met water bevochtigde microfiber doekje. Herhaal de procedure met een met ethanol vochtige doek. </li></ol></li><li> Cartridge montage. <ol><li> Neem een ​​nieuwe neutrale capillair (50 urn inwendige diameter) uit de verpakking. </li><li> Band naar beneden één uiteinde van de capillaire beschermingsbuizen op de werkbank. Ontrollen, strek en trek de capillaire uit de slang. </li><li> Plak een stukje plakband of papier naar de werkbank en voeg meting markeringen als volgt: lengte van de detector (30 cm), capillaire venster (0,2 cm) en lengte het uitlaateinde (10 cm) (dat wil zeggen 40,2 cm totale lengte, 30,0 cm effectieve lengte). </li><li> Lijn de capillaire venster om het 0,2 cm meten merk in het referentiedocument. Bevestig het capillair met tape en markeer de capillaire eindigt op 2 mm buiten de meting merken. </li><li> Snijd de beschermkap op de capillaire inlaat einde (het einde verst van het raam) in een enkele rechte beweging mbv de vlakke rand van het splitsen van steen.<ol><li> Dompel het capillaire uiteinde in een universele afgedekt flesje gevuld met water om permanente schade aan de capillaire binnenste bekleding voorkomen. Herhaal deze procedure telkens het capillairuiteinde is blootgesteld aan de omgevingstemperatuur langer dan 1 minuut. </li></ol></li><li> Plaats de capillaire inlaateinde naar de uitlaatzijde van de cartridge. </li><li> Duw en trek de capillair door de patroon zolang tot de capillaire venster gecentreerd op het venster cartridge. </li><li> Steek de stekker opening (100 urn x 200 pm) in het venster cartridge. OPMERKING: Controleer of wit licht door het raam bij blootstelling aan een witte lichtbron. Als het licht dat passeert een bruinig uiterlijk, zo nodig aanpassen. </li><li> Plaats het capillair in de voorgevormde koelvloeistof buizen voor totaal capillaire lengte van 40,2 cm (met vooraf geïnstalleerde buis moer ferrule en O-ring aan beide einden in die volgorde). </li><li> Duw de capillair door de coolant tubing zolang tot het capillair wordt aan de andere kant van de buis. </li><li> Steek het uiteinde van de koelvloeistof slang in de uitlaatzijde van het patroon en draai de slang vast. </li><li> Plaats de capillaire inlaateinde naar de inlaatzijde van de cartridge. </li><li> Duw en trek de capillair door de patroon zolang tot het capillair aan de inlaatzijde van de cassette verschijnt. </li><li> Steek het uiteinde van de koelvloeistof slang in de inlaatzijde van het patroon en draai de slang vast. </li><li> Snijd de beschermkap op de capillaire uitlaat einde (het einde dichtstbijzijnde vanuit het raam) in een enkele rechte beweging mbv de vlakke rand van het splitsen van steen. </li><li> Steek de seal-houder clips over de capillaire uiteinden en druk op om te breken in de juiste positie. Inspecteer de capillaire eindigt. Als ze niet eens, herhaal de procedure. </li><li> Plaats de capillaire lengte sjabloon aan de rand van de werkbank. </li><li> Plaats de cartridge naar beneden against de capillaire lengte template en lijn de capillaire eindigt met de referentie-lijnen op de mal. Als de capillaire meting merken (zie 3.2.4) niet af te stemmen op de referentie-lijnen, aan te passen als dat nodig is. </li><li> Houd het capillair tegen de capillaire lengte template en snijd beide uiteinden van het capillair mbv de vlakke rand van het splitsen steen 2 mm onder de referentielijnen op de mal. </li><li> Inspecteer de capillaire eindigt met een vergrootglas. Als capillaire uiteinden zijn niet glad, polijsten ze met behulp van de zachte gezicht van de klieven steen. </li><li> Plaats de opening O-ring in de opening plug gat met behulp van de insertie gereedschap O-ring. </li><li> Installeer afgedekt universele flesjes gevuld met water in de patroonhuls en plaats cartridge in geval onmiddellijk met capillaire uiteinden ingevoegd in flesjes. Voor korte en lange termijn opslag te houden bij 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Bereiding van buffer trays. <ol><li> Vullen en plaats afgedekt universal flacons in de buffer en uitlaat trays (figuur 1). Herhalen flacon posities in banen 2, 3, 4 en 5 overeenkomstig het aantal monsters te analyseren, het plaatsen van een baan voor zes injecties monster. LET OP: Vermijd bevochtigen van de flacon caps om de huidige lekkage te voorkomen. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Figuur 1: Positie en vul niveau van universele flacons in de buffer inlaat en uitlaat trays. Vul niveaus: 1/1 = 1400 pi, 3/4 = 1300 pi en 1/2 = 1000 pi. Afkortingen: W = water, HCl = 0,1 M zoutzuur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="4"><li> CE systeemcomponenten montage. <ol><li> Installeer de UV-detector. </li><li> Installeer de opening van hefbomendoor te drukken tot in de interface blok. </li><li> Installeer de glasvezelkabel. Steek de corresponderende einde te maken aan de klem en bar, terwijl beide uiteinden, draai met de klok mee. Sluit het andere uiteinde aan de UV-detector. LET OP: Behandel de glasvezelkabel met zorg tijdens deze procedure, omdat het buigen kon haar breuk veroorzaken. </li><li> Het monster en de buffer trays in de sample houder systeem en vastklikken. </li><li> Plaats de capillaire cartridge in de interface blok en, terwijl u de klem bar aan beide uiteinden, draai de knoppen. </li></ol></li></ol> 4. Instrument Methoden Set-up <ol><li> Maak de conditionering, hardlopen en afsluiten instrument werkwijzen volgens de volgende parameters en Tabel 1: Spanning, max: 30,0 kV; Huidige, max: 300,0 uA; Cartridge temperatuur: 20,0 ° C; Sample bewaartemperatuur: 10,0 ° C; UV-detector oorspronkelijke voorwaarden: Golflengte: 214 nm; Data rate: 4 Hz; Filter: Normaal; Piekbreedte (points): 16-25; Absorptie signaal: Direct. LET OP: Data acquisitie percentage kan worden verhoogd tot 25 Hz met het oog op de dekking van de smalle scheiding zones te verbeteren. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> Conditioning methode time programma </td></tr><tr><td> Tijd (min) </td><td> Evenement </td><td> Waarde </td><td> Duur </td><td> Inlet flacon </td><td> Outlet flacon </td><td> Overzicht </td><td> Comments </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> vooruit </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> vooruit </td> &lt;td&gt; Water </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> vooruit </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Aparte - Voltage </td><td> 15,0 KV </td><td> 10,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min ramp, normale polariteit </td><td> Scheiden </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2758 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> vooruit </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> Wacht </td><td> - </td><td> 0.0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse tips </td></tr><tr><td colspan="8"> Running methode time programma </td></tr><tr><td> Tijd (min) </td><td> Evenement </td><td> Waarde </td><td> Duur </td><td> Inlet flacon </td><td&gt; Outlet flacon </td><td> Overzicht </td><td> Comments </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vooruit, In / Out flacon inc 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vooruit, In / Out flacon inc 6 </td><td> Water </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 4.0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vooruit, In / Out flacon inc 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Injecteren - Pressure </td><td> 34 mbar </td><td> 20,0 sec </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Override, Forward </td><td> sample Injection </td></tr><tr><td> - </td><td> Wacht </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out flacon inc 6 </td><td> wash tips </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Aparte - Voltage </td><td> 15,0 KV </td><td> 30,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min ramp, normale polariteit, In / Out flacon inc 6 </td><td> sample Scheiding </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> Autozero </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> stop data </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vooruit, In / Out flacon inc 6 </td><td> Water </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> Wacht </td><td> - </td><td> 0.0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out flacon inc 6 </td><td> Rinse tips </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> Einde </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Einde </td></tr><tr><td colspan="8"> Shutdown methode time programma </td></tr><tr><td> Tijd (min) </td><td> Evenement </td><td> Waarde </td><td> Duur </td><td> Inlet flacon </td><td> Outlet flacon </td><td> Overzicht </td><td> Comments </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> vooruit </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spoel - Pressure </td><td> 2068 mbar </td><td> 6.0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> vooruit </td><td> Water </td></tr><tr><td> - </td><td> Lamp - Off </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Wacht </td><td> - </td><td> 0.0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse tips </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Conditioning, hardlopen en shutdown tijd programma&#39;s. 5. Data Acquisition en Processing <ol><li> Programmeer de sample set. <ol><li> Programmeer de capillaire voor het conditioneren van het gebruik van de meetversterker methode. Wanneer de capillair voor het eerst programma vier herhalingen; anders programmeren slechts twee herhalingen van de voorbereidende werkwijze. </li><li> Programmeer de monsters worden geanalyseerd met behulp van de lopende instrument methode. </li><li> Programmeer het capillair voor opslag met behulp van de shutdown instrument methode en herhaal de procedure aangegeven in paragraaf 3.2.22. </li></ol></li><li> Voer het experiment. </li><li> Exporteer de electroferogrammen. </li><li> Bereken de migratie tijd en het percentage inhoud van de elementaire, de belangrijkste eennd zure isovormen behulp hoogteverschil lijn integratie van de elektroferogram profiel. </li></ol>

<ol><li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li>
<li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic%2C+Electrophoretic%2C+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+identity%2C+charge+variants%2C+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li>
<li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li>
<li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li>
<li>Altria, K. D. Troubleshooting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltria%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Vol+52.+Capillary+Electrophoresis+Guidebook%3A+Principles%2C+Operation+and+Applications%22">Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications</a>. Altria, K. D. , Chapter 10 (1996).</li>
<li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li>
<li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li>
</ol>

De auteurs Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz en Emilio Medina-Rivero zijn werknemers van Probiomed S.A. de C.V., dat biosimilare producten ontwikkelt, produceert en op de markt brengt. Alle auteurs zijn betrokken bij de ontwikkeling van biosimilare producten voor Probiomed.

In deze tutorial, benadrukken we het belang van goede praktijken bij het uitvoeren van CZE analyses van mAb&#39;s om de kans te vergroten om te slagen. Echter, wanneer CZE wordt gebruikt op een routine-basis, problemen ontstaan onvermijdelijk 12. Voor het beste resultaat, is het belangrijk om de noten die in het hele protocol werden opgenomen te volgen, omdat ze de analist om te overwinnen en het oplossen van moeilijke stappen zal helpen. Een belangrijke overweging om optimale res...

Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn biotherapeutic eiwitten met toenemende belangstelling als gevolg van hun vermogen om op te treden tegen verschillende chronische en degeneratieve ziekten 1. Net als andere biomoleculen, mAb&#39;s zijn gevoelig voor verschillende fysicochemische modificaties ondergaan in alle stadia van hun levenscyclus (dat wil zeggen, van biosynthese het eindproduct). Dergelijke modificaties omvatten, maar zijn niet beperkt tot: deamidatie, glycosylering, oxidatie, cyclisatie, isomerisatie, aggregatie en proteolytische splitsing 2. Vandaar, analytische technieken in staat om intrinsieke isovormen op te lossen zijn nodig om mAb&#39;s heterogeniteit en stabiliteit te monitoren om de kwaliteit specificaties vast te stellen. Capillaire elektroforese (CE) is een krachtige scheidingstechnologie uitgevoerd outinside een smalle kwartsglas buis (um bereik) gevuld met een achtergrondelektrolyt (BGE). Bij toepassing van een elektrisch veld (tot 30.000 V), geladen molecuuls migreren naar de elektrode met tegengestelde lading (bijvoorbeeld elektro-driven scheiding). Het gebruik van hoge spanningen CE toelaat snel en analyses van doelmatigheid die hoger dan klassieke gelelektroforese zijn. Capillaire zone elektroforese (CZE) is een CE-gebaseerde techniek routinematig gebruikt in de biofarmaceutische industrie voor de kwaliteit van het product beoordelen 3-9. In tegenstelling tot andere vormen van CE (bijvoorbeeld, capillaire gelelektroforese, capillaire iso-elektrische focussering) of chromatografie gebaseerde werkwijzen kunnen CZE worden uitgevoerd zonder denatureringsmiddelen of vaste-fase-interfaces, waardoor de analyse van de inherente heterogeniteit van mAbs dichtbij hun natieve toestand 10 . CZE scheiding van mAb isovormen plaatsvindt in een gesmolten-silica capillaire bedekt met een hydrofiel polymeer (neutrale capillair) en is gebaseerd op hun verschillende elektroforetische mobiliteit die wordt geregeerd door lading, massa, grootte en vorm (of hydrodynamisch volume) 11. mAb resten gedetecteerd wanneerze gemobiliseerd en door het detectievenster, die wordt waargenomen door een ultraviolet (UV) detector bij 214 nm 4. De succesvolle implementatie van deze analysetechniek is afhankelijk van de juiste aandacht voor details voor en tijdens het experiment. anderszins handelen zullen de kosten en tijd te verhogen om de analyse uit te voeren, wat uiteindelijk leidt tot constante mislukking en frustratie. Hier presenteren we een stap-voor-stap handleiding voor een succesvolle analyse van mAb heterogeniteit voeren door CZE door de uitgebreide uitleg over de bereiding van oplossingen en monsters, de voorbereiding van de CE-systeem, het instrument methoden opgericht, de data-acquisitie en de verwerking. Ten behoeve van deze oefening een recombinant volledig menselijke anti-tumor necrosis factor alpha (anti-TNFa) mAb gebruikt als model eiwit; echter kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor de analyse van andere eiwitten gezien korte modificaties. EENdditionally, een aantal aanbevelingen om te verzachten mogelijke problemen worden voorgesteld. De lezer wordt aangemoedigd om strikt volgen van het voorgestelde protocol, als de kans om te slagen zal toenemen.

<table><tbody><tr><td>Glacial azijnzuur</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACS-kwaliteit zoutzuur</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine dihydrochloride</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(Hydroxypropyl)methylcellulose&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-aminocaproïnezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50,0 mM,&nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Farmaceutisch Analysesysteem</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Neutral capillair&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Vial, Micro, 200 &micro;l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Universele viaalkappen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Universele vlaaskjes</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Kabel, optiek, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis Detector Module</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td><td>Beckman Coulter</td><td>144738</td><td></td></tr></tbody></table>

capillaire elektroforese scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Biotherapeutische eiwitten, zoals monoklonale antilichamen (mAbs), zijn haalbare alternatieven voor de behandeling van chronische-degeneratieve ziekten. De biologische activiteit van deze eiwitten hangt af van hun fysisch-chemische eigenschappen. Het gebruik van hoogwaardige technieken zoals chromatografie en capillaire elektroforese is beschreven voor de analyse van fysisch-chemische heterogeniteit van mAbs. Tegenwoordig vormt de capillaire zone-elektroforese (CZE) techniek een van de meest resolutieve en gevoelige analyses voor de analyse van biomoleculen. Bovendien wordt de elektro-gedreven scheiding in CZE beheerst door uitgebreide eigenschappen van materie en biedt het het voordeel van het analyseren van eiwitten in de buurt van hun natuurlijke toestand. Echter, de succesvolle implementatie van deze techniek voor routinematige analyse hangt af van de vaardigheden van de analist in de kritische stappen tijdens de voorbereiding van monsters en systemen. Het doel van deze tutorial is om de stappen te detailleren om te slagen in de CZE-analyse van mAbs. Verder kan dit protocol worden gebruikt voor de ontwikkeling en verbetering van de vaardigheden van het personeel dat betrokken is bij laboratoria voor analytische eiwitchemie.

Figuur 2 toont de typische elektrische stroom profiel van een 200 mM EACA, 30 mM lithium acetaat, pH 4,8 BGE met anti-TNFa mAb monster verdund met Tris buffer (50 mM, pH 8,0). Zoals kan worden waargenomen, de huidige is stabiel tijdens de analyse en kan oscilleren tussen waarden van 30 tot 35 uA. Figuur 3 toont de CZE elektroferogram van een blanco monster waarin de gedetecteerde piek overeenkomt met de histamine interne standaard. Het wordt verwacht voo...

Hier presenteren we een uitgebreid capillaire zone-elektroforeseprotocol voor de beoordeling van intrinsieke fysisch-chemische heterogeniteit van monoklonale antilichamen als een kwaliteitskenmerk.

Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Tegenwoordig is de techniek van capillaire cel-elektroforese een van de meest resolutieve en gevoelige methoden voor de analyse van biomoleculen zoals monoklonale antilichamen. De succesvolle implementatie van deze techniek hangt echter af van de kennis en vaardigheden van de analist bij de kritieke stappen tijdens de monster- en systeemvoorbereiding. Deze handleiding is gericht op het uitvoeren van een succesvolle analyse, met een gedetailleerde uitleg over de bereiding van oplossingen en monsters, de voorbereiding van het capillaire elektroforese-systeem, de instelling van de instrumentmethode en de besluitvorming en verwerking van gegevens.Over het algemeen kan dit protocol worden gebruikt voor de ontwikkeling en verbetering van de vaardigheden van het personeel dat betrokken is bij het inrichten van analytische scheikundige laboratoria. Weeg de hoeveelheid HPMC af om een uiteindelijke concentratie van 0,05 procent in 100 milliliter te verkrijgen. Aangezien HPMC een basisch elastisch polymeer is, schenkt u als eerste stap het bindmiddel in een glazen bekerglas en voegt u langzaam 80 milliliter water toe om het poeder te ontmengen.Spoel vervolgens de bevochtigingsbak uit met water om poederresten te verwijderen. Voeg de resterende reagentia zoals gebruikelijk toe en roer de oplossing. Stel de pH-waarde in op 4,8 met 50 procent azijnzuur.Laat de oplossing vijf minuten stabiliseren. Pas daarna de pH aan indien nodig. Voeg water toe tot een eindvolume van 100 milliliters.Filter de bereide BG-oplossing door een neutrofilisch membraan en giet deze in een glazen fles. Label de glazen fles vervolgens op de juiste wijze en bewaar deze onder koeling. Voeg als eerste stap bij de voorbereiding van het monster 162 µL sporenelementenbufferoplossing toe aan een buisje van 1,5 mL.Voeg vervolgens 18 µL toe van een eerder bereid MAP-monster met een concentratie van 10 mg/mL. Voeg als derde stap 20 µL toe van een eerder bereide histamine-oplossing van 1% om een eindvolume van het monster van 200 µL te verkrijgen. Bereid in de volgende stap het monster gedurende vijf seconden voor.Centrifuge vervolgens vijf seconden. Aspireer het totale volume van het monster. Doseer dit naar boven in een micro-vial om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.Sluit tot slot het vial af met de dop en bewaar dit in de koelkast. Zet het CE-instrument uit door op de aan/uit-schakelaar te drukken. Open vervolgens de voorklep.Plaats een nieuw absorberend doekje onder het interfaceblok. Spoel de elektroden door het interfaceblok met water met behulp van een spoelfles. Laat het water door de gaten druppelen en droog het interfaceblok grondig af.Verwijder voorzichtig het overtollige water van de elektroden met het pluisje. Zorg ervoor dat u tijdens deze procedure de elektroden niet aanraakt. Verwijder het pluisje uit het monsterhoudersysteem.Reinig het oppervlak van de monsterbakken met een nieuw, met water bevochtigd pluisvrij doekje. Reinig ook het oppervlak van de bufferbakken. Schuif de bufferbakken omhoog, til het monsterhoudingsysteem op en reinig het oppervlak hiervan met het doekje.Plaats de bufferbakken terug in hun positie. Maak daarna het interfaceblok grondig schoon. Reinig de klembalk en de behuizing van de UV-lamp.Controleer tot slot het systeem voor gebruik. Spoel de openingshendels af met water met behulp van een spoelfles. Reinig het oppervlak grondig met een nieuwe, pluisvrije doek om stof en opgehoopte zouten te verwijderen.Zorg er ten slotte voor dat u ze test voordat u ze installeert. Reinig de twee uiteinden van de glasvezelkabel met een met water bevochtigde microvezeldoek en bevestig de lichtpod tussen de uiteinden. Haal een nieuwe neutrale capillaire uit de verpakking.Breng nu één uiteinde van de beschermbuis van de capillair naar de werkbank. Rol de plastic buis uit en maak deze recht, en trek de capillair voorzichtig uit de buis. Bevestig een stuk papier aan de werkbank met de volgende meetmarkeringen.Lijn het capillaire venster als volgt uit met het nulpunt van de centimetermaataanduidingen: Fixeer daarna de uiteinden van de capillair met tape aan de werkbank. Markeer de uiteinden van de capillair twee millimeter buiten de maataanduidingen. Snijd de beschermkap af aan het uiteinde van de capillair dat het verst van het venster verwijderd is.Dompel het capillaire uiteinde onder in een CE-vial gevuld met water om permanente beschadiging van de innerlijke coating van het capillair te voorkomen. Haal het capillair uit de vial en voer dit uiteinde voorzichtig in de uitgangszijde van de cartridge. Zodra het capillair aan de andere zijde verschijnt, trekt u hoeveelheden naar buiten tot het capillaire venster als volgt gecentreerd is ten opzichte van het venster van de cartridge.Draai daarna de cartridge om en plaats de apertuurplug in het venster van de cartridge door deze vast te drukken tot hij in positie klikt. Wees voorzichtig om het capillaire venster tijdens deze procedure niet te breken. Bevestig dat er licht door het venster gaat wanneer het wordt blootgesteld aan de brede lichtbron.Voer de capillair in de vooraf gevormde koelmiddelleiding met de vooraf geïnstalleerde leidingmoeren en o-ring. Duw de capillair door de leiding totdat deze aan de andere zijde verschijnt. Steek vervolgens het uiteinde van de leiding in de uitlaatzijde van de cartridge en draai de leidingmoeren vast.Steek het capillaire inlaatuiteinde in de inlaatzijde van de cartridge. Zodra het capillair aan de andere zijde zichtbaar is, trek deze indien nodig verder door. Plaats vervolgens het uiteinde van de slang aan de inlaatzijde van de cartridge en draai de slangmoeren vast.Snijd de beschermkap bij het capillaire uiteinde dat het dichtst bij het venster ligt af. Plaats vervolgens de klemmen voor de celhouder over de capillaire uiteinden door ze aan te drukken tot ze in positie klikken, als volgt. Snijd de capillaire uiteinden af onder de referentielijnen op de verlengingsplaten van de capillairen.Controleer de uiteinden van de capillair zorgvuldig met een vergrootglas. Als de uiteinden van de capillair niet glad zijn, polijst deze dan met de Cleven-steen. Plaats de O-ring van de opening in het blauwe gat van de opening.En plaats deze zorgvuldig met behulp van het o-ring invoeginstrument. Installeer vervolgens CE-vials gevuld met water in de cassettehouder, plaats de cassette onmiddellijk in de houder met de capillaire uiteinden in de vials en bewaar deze onder koeling. Stel het pipetvolume in.Voeg het juiste volume water toe aan de bufferinlaat op traycoördinaten A1, B1 en F6, en aan de bufferuitlaat op traycoördinaten A1, B1, C1, E6 en F6. Voeg 0,1 normaal HCl toe aan de bufferinlaat op traycoördinaten C1 en E6. Voeg BGE toe aan de bufferinlaat op traycoördinaten D1 en E6, en aan de bufferuitlaat op traycoördinaat D1. Sluit ten slotte alle CE-vials in de bufferinlaat- en uitlaattrays af met dopjes. Vermijd tijdens de procedure dat de dopjes van de vials nat worden om koolstoflekkage te voorkomen. Open de frontdeur van het CE-instrument.Installeer eerst de UV-detector en zet deze vast door de schroef met de klok mee te draaien. Til de binnendeur op en installeer de openingshendels door deze omhoog in het interfaceblok te drukken. Steek de glasvezelkabel in de klem en draai deze met de klok mee.Verbind het andere uiteinde met de detector. Ga zorgvuldig om met de glasvezelkabel, aangezien buigen kan leiden tot breuk. Plaats de monsterlade in het monsterhoudersysteem en klik deze op zijn plaats.Volg dezelfde procedure en plaats de bufferbakken in het monsterhoudersysteem. Til de klemstang op en plaats de capillaire cartridge in het interfaceblok. Druk de klemstang aan beide uiteinden naar beneden en draai de knoppen met de klok mee vast.Sluit de binnendeur en sluit de voordeur. Zet vervolgens het CE-instrument aan door op de aan/uit-schakelaar te drukken. Maak de methode voor het conditioneren van het instrument aan.Configureer de parameters in de sectie voor initiële condities, inclusief de spanning, de cartridge, de bewaartemperatuur van de monsters en de triggerinstellingen. Selecteer 2014 als de acquisitiegolflengte. Definieer de acties die door het instrument moeten worden uitgevoerd door de parameters in de tijdgeprogrammeerde cellen te configureren.Inclusief de specifieke instellingen voor elke spoel-, injectie- en scheidingsstap. Voer deze procedure uit om de methoden voor conditionering, analyse en het uitschakelen van het instrument te maken. De volgende stap is het aanmaken van een nieuwe sequentie.Programmeer de capillaire voor conditionering met behulp van de conditioneringsmethode. Indien de capillaire voor het eerst wordt gebruikt, programmeer dan vier herhalingen. Programmeer anders twee herhalingen.Programmeer vervolgens de te analyseren monsters met de analysemethode. Programmeer tot slot de capillair voor opslag met de shut-down methode. De analyse via capillaire cel-elektroforese is binnen 30 minuten voltooid.Het eerste resultaat komt overeen met de histamine interne standaard als maat voor de adequate systeemprestatie. Dit wordt gevolgd door kenmerkende basische, hoofd- en zure piekvormen van het geëvalueerde monoklonale antilichaam. De volledige scheiding verloopt onder een constante stroom van rond de 30 microampères.Exporteer na het uitvoeren van het experiment de ruwe gegevens uit de grab-software en importeer deze via de empower-software voor verwerking. Het percentage van elke ijsvorm wordt verkregen na verticale dropline-integratie van het elektrofereogramprofiel. Hier hebben we een gedetailleerde stapsgewijze handleiding weergegeven voor het uitvoeren van de analyse van monoklonale activiteiten die zijn gegenereerd door capillaire cel-elektroforese.Naast verschillende aanbevelingen om potentiële problemen te beperken, biedt het huidige protocol bovendien het voordeel dat het eenvoudig kan worden aangepast voor de analyse van andere eiwitten door middel van korte wijzigingen in de conductiviteit en pH-parameters.

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes an affinity chromatography technique for purifying 2F5 monoclonal antibodies using the DsRed-2F5-Epitope or DFE ligands. The purified 2F5 monoclonal antibodies are essential drugs in immunotherapy.

DFE-Based Affinity Chromatography: A Technique for Purification of 2F5 Monoclonal Antibodies from a Crude Sample Using High Ionic Strength-Based Elution Conditions

This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Een capillair gebaseerde-immunoassay met een commercieel platform om te meten doel eiwitten uit totaal eiwit preparaten wordt aangetoond. Daarnaast zijn assay parameters van blootstellingstijd, eiwitconcentratie en verdunning van de antilichamen geoptimaliseerd voor een model van de celcultuur.

Procedure en belangrijkste optimalisatie strategieën voor een geautomatiseerde capillaire elektroforetische gebaseerde Immunoassay-methode

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Dit protocol beschrijft de productie van een therapeutisch antilichaam in een zoogdier expressiesysteem. De beschreven werkwijzen omvatten bereiding van vector-DNA, transfectie en stabiele serumvrije adaptatie van humane embryonische nier 293 cellijn opgezet van grootschalige kweken en zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie.

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Leer capillaire zone-elektroforese voor analyse van monoclonale antilichamen met een neutrale capillair. Dit protocol verbetert analytische vaardigheden en zorgt voor betrouwbare kwaliteitsbeoordeling in therapeutische toepassingen.

Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Meer video's verkennen