Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Tegenwoordig is de techniek van capillaire cel-elektroforese een van de meest resolutieve en gevoelige methoden voor de analyse van biomoleculen zoals monoklonale antilichamen. De succesvolle implementatie van deze techniek hangt echter af van de kennis en vaardigheden van de analist bij de kritieke stappen tijdens de monster- en systeemvoorbereiding. Deze handleiding is gericht op het uitvoeren van een succesvolle analyse, met een gedetailleerde uitleg over de bereiding van oplossingen en monsters, de voorbereiding van het capillaire elektroforese-systeem, de instelling van de instrumentmethode en de besluitvorming en verwerking van gegevens.

Over het algemeen kan dit protocol worden gebruikt voor de ontwikkeling en verbetering van de vaardigheden van het personeel dat betrokken is bij het inrichten van analytische scheikundige laboratoria. Weeg de hoeveelheid HPMC af om een uiteindelijke concentratie van 0,05 procent in 100 milliliter te verkrijgen. Aangezien HPMC een basisch elastisch polymeer is, schenkt u als eerste stap het bindmiddel in een glazen bekerglas en voegt u langzaam 80 milliliter water toe om het poeder te ontmengen.

Spoel vervolgens de bevochtigingsbak uit met water om poederresten te verwijderen. Voeg de resterende reagentia zoals gebruikelijk toe en roer de oplossing. Stel de pH-waarde in op 4,8 met 50 procent azijnzuur.

Laat de oplossing vijf minuten stabiliseren. Pas daarna de pH aan indien nodig. Voeg water toe tot een eindvolume van 100 milliliters.

Filter de bereide BG-oplossing door een neutrofilisch membraan en giet deze in een glazen fles. Label de glazen fles vervolgens op de juiste wijze en bewaar deze onder koeling. Voeg als eerste stap bij de voorbereiding van het monster 162 µL sporenelementenbufferoplossing toe aan een buisje van 1,5 mL.

Voeg vervolgens 18 µL toe van een eerder bereid MAP-monster met een concentratie van 10 mg/mL. Voeg als derde stap 20 µL toe van een eerder bereide histamine-oplossing van 1% om een eindvolume van het monster van 200 µL te verkrijgen. Bereid in de volgende stap het monster gedurende vijf seconden voor.

Centrifuge vervolgens vijf seconden. Aspireer het totale volume van het monster. Doseer dit naar boven in een micro-vial om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.

Sluit tot slot het vial af met de dop en bewaar dit in de koelkast. Zet het CE-instrument uit door op de aan/uit-schakelaar te drukken. Open vervolgens de voorklep.

Plaats een nieuw absorberend doekje onder het interfaceblok. Spoel de elektroden door het interfaceblok met water met behulp van een spoelfles. Laat het water door de gaten druppelen en droog het interfaceblok grondig af.

Verwijder voorzichtig het overtollige water van de elektroden met het pluisje. Zorg ervoor dat u tijdens deze procedure de elektroden niet aanraakt. Verwijder het pluisje uit het monsterhoudersysteem.

Reinig het oppervlak van de monsterbakken met een nieuw, met water bevochtigd pluisvrij doekje. Reinig ook het oppervlak van de bufferbakken. Schuif de bufferbakken omhoog, til het monsterhoudingsysteem op en reinig het oppervlak hiervan met het doekje.

Plaats de bufferbakken terug in hun positie. Maak daarna het interfaceblok grondig schoon. Reinig de klembalk en de behuizing van de UV-lamp.

Controleer tot slot het systeem voor gebruik. Spoel de openingshendels af met water met behulp van een spoelfles. Reinig het oppervlak grondig met een nieuwe, pluisvrije doek om stof en opgehoopte zouten te verwijderen.

Zorg er ten slotte voor dat u ze test voordat u ze installeert. Reinig de twee uiteinden van de glasvezelkabel met een met water bevochtigde microvezeldoek en bevestig de lichtpod tussen de uiteinden. Haal een nieuwe neutrale capillaire uit de verpakking.

Breng nu één uiteinde van de beschermbuis van de capillair naar de werkbank. Rol de plastic buis uit en maak deze recht, en trek de capillair voorzichtig uit de buis. Bevestig een stuk papier aan de werkbank met de volgende meetmarkeringen.

Lijn het capillaire venster als volgt uit met het nulpunt van de centimetermaataanduidingen: Fixeer daarna de uiteinden van de capillair met tape aan de werkbank. Markeer de uiteinden van de capillair twee millimeter buiten de maataanduidingen. Snijd de beschermkap af aan het uiteinde van de capillair dat het verst van het venster verwijderd is.

Dompel het capillaire uiteinde onder in een CE-vial gevuld met water om permanente beschadiging van de innerlijke coating van het capillair te voorkomen. Haal het capillair uit de vial en voer dit uiteinde voorzichtig in de uitgangszijde van de cartridge. Zodra het capillair aan de andere zijde verschijnt, trekt u hoeveelheden naar buiten tot het capillaire venster als volgt gecentreerd is ten opzichte van het venster van de cartridge.

Draai daarna de cartridge om en plaats de apertuurplug in het venster van de cartridge door deze vast te drukken tot hij in positie klikt. Wees voorzichtig om het capillaire venster tijdens deze procedure niet te breken. Bevestig dat er licht door het venster gaat wanneer het wordt blootgesteld aan de brede lichtbron.

Voer de capillair in de vooraf gevormde koelmiddelleiding met de vooraf geïnstalleerde leidingmoeren en o-ring. Duw de capillair door de leiding totdat deze aan de andere zijde verschijnt. Steek vervolgens het uiteinde van de leiding in de uitlaatzijde van de cartridge en draai de leidingmoeren vast.

Steek het capillaire inlaatuiteinde in de inlaatzijde van de cartridge. Zodra het capillair aan de andere zijde zichtbaar is, trek deze indien nodig verder door. Plaats vervolgens het uiteinde van de slang aan de inlaatzijde van de cartridge en draai de slangmoeren vast.

Snijd de beschermkap bij het capillaire uiteinde dat het dichtst bij het venster ligt af. Plaats vervolgens de klemmen voor de celhouder over de capillaire uiteinden door ze aan te drukken tot ze in positie klikken, als volgt. Snijd de capillaire uiteinden af onder de referentielijnen op de verlengingsplaten van de capillairen.

Controleer de uiteinden van de capillair zorgvuldig met een vergrootglas. Als de uiteinden van de capillair niet glad zijn, polijst deze dan met de Cleven-steen. Plaats de O-ring van de opening in het blauwe gat van de opening.

En plaats deze zorgvuldig met behulp van het o-ring invoeginstrument. Installeer vervolgens CE-vials gevuld met water in de cassettehouder, plaats de cassette onmiddellijk in de houder met de capillaire uiteinden in de vials en bewaar deze onder koeling. Stel het pipetvolume in.

Voeg het juiste volume water toe aan de bufferinlaat op traycoördinaten A1, B1 en F6, en aan de bufferuitlaat op traycoördinaten A1, B1, C1, E6 en F6. Voeg 0,1 normaal HCl toe aan de bufferinlaat op traycoördinaten C1 en E6. Voeg BGE toe aan de bufferinlaat op traycoördinaten D1 en E6, en aan de bufferuitlaat op traycoördinaat D1. Sluit ten slotte alle CE-vials in de bufferinlaat- en uitlaattrays af met dopjes. Vermijd tijdens de procedure dat de dopjes van de vials nat worden om koolstoflekkage te voorkomen. Open de frontdeur van het CE-instrument.

Installeer eerst de UV-detector en zet deze vast door de schroef met de klok mee te draaien. Til de binnendeur op en installeer de openingshendels door deze omhoog in het interfaceblok te drukken. Steek de glasvezelkabel in de klem en draai deze met de klok mee.

Verbind het andere uiteinde met de detector. Ga zorgvuldig om met de glasvezelkabel, aangezien buigen kan leiden tot breuk. Plaats de monsterlade in het monsterhoudersysteem en klik deze op zijn plaats.

Volg dezelfde procedure en plaats de bufferbakken in het monsterhoudersysteem. Til de klemstang op en plaats de capillaire cartridge in het interfaceblok. Druk de klemstang aan beide uiteinden naar beneden en draai de knoppen met de klok mee vast.

Sluit de binnendeur en sluit de voordeur. Zet vervolgens het CE-instrument aan door op de aan/uit-schakelaar te drukken. Maak de methode voor het conditioneren van het instrument aan.

Configureer de parameters in de sectie voor initiële condities, inclusief de spanning, de cartridge, de bewaartemperatuur van de monsters en de triggerinstellingen. Selecteer 2014 als de acquisitiegolflengte. Definieer de acties die door het instrument moeten worden uitgevoerd door de parameters in de tijdgeprogrammeerde cellen te configureren.

Inclusief de specifieke instellingen voor elke spoel-, injectie- en scheidingsstap. Voer deze procedure uit om de methoden voor conditionering, analyse en het uitschakelen van het instrument te maken. De volgende stap is het aanmaken van een nieuwe sequentie.

Programmeer de capillaire voor conditionering met behulp van de conditioneringsmethode. Indien de capillaire voor het eerst wordt gebruikt, programmeer dan vier herhalingen. Programmeer anders twee herhalingen.

Programmeer vervolgens de te analyseren monsters met de analysemethode. Programmeer tot slot de capillair voor opslag met de shut-down methode. De analyse via capillaire cel-elektroforese is binnen 30 minuten voltooid.

Het eerste resultaat komt overeen met de histamine interne standaard als maat voor de adequate systeemprestatie. Dit wordt gevolgd door kenmerkende basische, hoofd- en zure piekvormen van het geëvalueerde monoklonale antilichaam. De volledige scheiding verloopt onder een constante stroom van rond de 30 microampères.

Exporteer na het uitvoeren van het experiment de ruwe gegevens uit de grab-software en importeer deze via de empower-software voor verwerking. Het percentage van elke ijsvorm wordt verkregen na verticale dropline-integratie van het elektrofereogramprofiel. Hier hebben we een gedetailleerde stapsgewijze handleiding weergegeven voor het uitvoeren van de analyse van monoklonale activiteiten die zijn gegenereerd door capillaire cel-elektroforese.

Naast verschillende aanbevelingen om potentiële problemen te beperken, biedt het huidige protocol bovendien het voordeel dat het eenvoudig kan worden aangepast voor de analyse van andere eiwitten door middel van korte wijzigingen in de conductiviteit en pH-parameters.