Name: Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Leer hoe je aanpasbare hydrogels maakt van long-extracellulaire matrix voor 3D-celkweek. Deze methode gebruikt decellularisatie van varkenslongweefsel om celgedrag in gezonde en pathologische omstandigheden te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Smithfield boerderijen bedanken voor het doneren van het intacte varkens longweefsel. We willen ook graag bedanken Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang en de afdeling Heelkunde VCU Plastic voor het mogelijk maken om hun apparatuur te gebruiken. Hydrogel en weefselmonsters werden voorbereid voor SEM bij de VCU Afdeling Anatomie en Neurobiologie Microscopy Facility ondersteund, voor een deel, door de financiering van NIH-NINDS Center Core Grant 5 P30 NS047463 en, gedeeltelijk, door de financiering vorm NIH-NCI Cancer Center Ondersteuning Grant P30 CA016059. SEM beeldvorming van monsters bij de VCU Nanotechnologie Core karakterisering Facility (NCC). Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation, CMMI 1.351.162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Oplossing </td><td> steriele Filter </td><td> Routebeschrijving </td></tr><tr><td> DIH 2 O </td><td> Ja </td><td> DIH 2 O; steriel gefiltreerd </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100 oplossing </td><td> Ja </td><td> Onder zuurkast voeg 100 ul Triton-X 100 Oplossing voor 100 ml Dih 2 O en schud totdat het is opgelost; steriel filter. </td></tr><tr><td> 2% deoxycholaat oplossing </td><td> Ja </td><td> Onder zuurkast voeg 2 g natriumdeoxycholaat oplossing per 100 ml Dih 2 O en schud totdat het is opgelost; steriel filter </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Ja </td><td> Voeg 58,44 g NaCl tot 1 L van Dih 2 O; schud totdat het is opgelost; steriel filter </td></tr><tr><td> DNase oplossing </td><td> Ja </td><td> Voeg 12.000eenheden DNase 1 L Dih 2 O; Voeg 0,156 g MgSO4 (Watervrij), en 0,222 g CaCl2; schud totdat het is opgelost; steriel filter </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ja </td><td> Combineer 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (heptahydraat), 80 g NaCl en 2 g KCl met 10 L Dih 2 O; schud totdat het is opgelost; pH instellen op 7,4; steriel filter </td></tr></tbody></table> Tabel 1: oplossingen die nodig zijn voor Tissue Decellularisatie. Maak de bovenstaande oplossingen voor de cellen ontdoen proces. Bewaren bij 4 ° C. Ongeveer 2,5 L is nodig voor een varken long. 1. Hydrogel Formation <ol><li> Porcine Lung Decellularisatie (overgenomen van referenties 9,10) <ol><li> Te verkrijgen, een en bloc normale varkens long, uit een slachthuis, met hart en Vasculature intact. </li><li> Tissue schaar of scalpel weg ontleden het hart, bloedvaten snijden zo dicht mogelijk bij het hart, zal nog vaatstelsel worden gebruikt in latere stappen voor perfusie. </li><li> ontleden zorgvuldig weg het bindweefsel rond de luchtpijp, bronchiën en vaatstelsel met behulp van een scalpel of schaar. OPMERKING: Bepaal de beste long gebruiken voor de rest van de procedure uitgesproken door een long zonder grote sneden of gaten door de pleura en grote hoeveelheden atelectase of vasculaire occlusie dat de effectiviteit van de decellularisatie proces kan belemmeren. </li><li> Knip de suboptimale long verlaten zoveel bronchus gehecht aan de luchtpijp mogelijk (hart, bindweefsel en de lobben van de verwijderde longen kunnen worden afgestoten). Er moet één long bevestigd blijft aan de luchtpijp en vaatstelsel. NB: Behoud secties voor histologie indien gewenst. 9 </li><li> Sluit verbroken bronchiën met klemmen of hechting aan pRevent overtollige terugstroom. </li></ol><ol start="6"><li> Bereid de cellen ontdoen oplossingen de koelkast bij 4 ° C totdat het nodig is (Tabel 1). </li><li> Met behulp van een handpomp canule aan de longslagader passen, perfuseren het longweefsel 3 maal met DI water door middel van zowel de longslagader en de luchtpijp. Perfuseren het vaatstelsel eerst elke keer. Begin met ongeveer 1 L in het vaatstelsel en 1,5 L in trachea per perfusie, maar celresten verwijderd vloeibaarder kan worden geperfuseerd via het systeem. </li><li> Perfuseren zowel vasculatuur en de luchtpijp met Triton X-100 oplossing. </li><li> Onderdompelen longweefsel in Triton X-100 oplossing 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen. </li><li> Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met deoxycholaat oplossing. </li><li> Dompel de weefselcoupes in deoxycholaat gedurende 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen. </li><li>Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met NaCl-oplossing. </li><li> Onderdompelen weefsel in gefilterd NaCl oplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen. </li><li> Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met DNase oplossing. </li><li> Onderdompelen weefsel in gefilterd DNase oplossing 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Perfuseren zowel vasculatuur en trachea 5 maal met PBS. </li><li> Ontleden weg merkbare kraakbeenweefsel, trachea en alle buisjes 2 mm of groter in diameter (vooral in de omgeving van de hilus en mediale gedeelten van de longen) vanaf geleidende luchtwegen, waardoor alleen respiratoire zones (voornamelijk randgebieden). </li><li> Ontleden weefsel in 1 inch secties of kleiner. Oriëntatie van het weefsel niet van belang voor deze stap. </li><li> Giet overtollige vloeistof af en plaats weefsel in 50 ml conische buizen. Bevries het weefsel bij -80 ° C. LET OP: Behoud secties voor histologie om de verwijdering van cellen en cellulaire debri verzekerens, indien gewenst. We gebruiken H &amp; E, α-galactosidase, picogreen, hydroxyproline, ninhydrine, alcian blauw, SDS-PAGE en massaspectrometrie te karakteriseren. 9 </li></ol></li><li> Lung Processing <ol><li> Verwijder deksels uit ingevroren buisjes die cellen ontdane longweefsel. </li><li> Plaats de papieren filter over de buis opening en veilig met rubber band. OPMERKING: Buis en de inhoud moet nog steeds worden bevroren op enigerlei andere wijze in -80 ° C tot bevroren. </li><li> Lyofiliseren het weefsel totdat alle overtollige vloeistof is verdwenen, met behulp van een vriesdroger volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bewaar bij -80 ° C tot klaar te frezen. </li><li> Voordat u begint toe te voegen vloeibare stikstof vriezer molen isolatie en interne onderdelen tot de arbeidsomstandigheden. </li><li> Verwijder magnetische molen bar van molen buis en voeg weefsel naar beneden te dekken. </li><li> Vervang de molen bar en voeg los verpakt weefsel. De molen bar moet nog steeds vrij te bewegen. </li><li> Sluit de molen buis en place in de vriezer molen. </li><li> Vul vloeibare stikstof tot max vullijn. </li><li> Vriezer molen alle weefsels tot fijn poeder (ongeveer 5 min, impactie snelheid van ~ 600 min -1), in een polycarbonaat cilinder met een roestvrij stalen impactor evenals roestvrij staal einde stekkers met behulp van de vriezer molen volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bewaren bij -80 ° C tot aan gebruik. </li></ol></li><li> Microporeuze gelvorming (8 mg / ml) (naar referenties 9,11) <ol><li> Voeg 1% (w / v) van het gedecellulariseerde poeder en 0,1% (w / v) pepsine tot 0,01 M HCl, onder constant roeren (moet kunnen stromen weergegeven boven vloeistofniveau), bij kamertemperatuur, 48 uur. Opmerking: Het poeder wordt statisch geladen, zodat het toevoegen van de HCl nadat het poeder in de gelegenheid om de overtollige wassen de buiswanden verschaft. </li><li> Na digereren gedurende 48 uur, plaats de oplossing en reagentia op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Middels gekoelde 10% (v / v) 0,1 M NaOH, eend 11,11% (v / v) 10x PBS (op de gehele oplossing brengen concentratie 1x), brengen de verteerde eiwitoplossing tot fysiologische pH van 7,4. NB: De oplossing kan nu maximaal een week bewaard bij 4 ° C. Voer geleren kinetiek met behulp van reometrie 9 indien gewenst. </li></ol></li></ol> 2. Cross-linking Hydrogels om mechanische sterkte te verbeteren <ol><li> Oplossingen van 1%, 0,1% en 0,01% w / v genipin verknopingsoplossing werden bereid door oplossen van de noodzakelijke hoeveelheid genipin poeder in 10% DMSO. </li><li> Vortex de oplossing elke 15 min gedurende 1 uur. </li><li> Voeg genipin oplossing ECM hydrogels (100 ul per putje van een 96-well plaat) die eerder zijn geassembleerd gedeeltelijk 1.3.4 dekken. </li><li> Leg elke ECM hydrogel verknopen gedurende 24 uur bij 37 ° C. </li><li> Spoel de ECM hydrogel 3 maal met PBS totdat de wasvloeistof niet langer blauw. De verknoopte hydrogels zal dan klaar voor verdere karakterisering en cell cultuur studies. </li></ol> 3. Cultuur van de Cel met Microporeuze Gel <ol><li> Tweedimensionale coating <ol><li> Met oplossing van 1.3.3, voeg 20 ul van pre-gel oplossing in elk putje van een 96-well niet-behandelde weefselkweekplaat. </li><li> Nacht in de koelkast bij 4 ° C te laten eiwit adsorptie tot op het bord. </li><li> Zuig Pregel oplossing en spoel af met PBS. </li><li> 9 passage cellen. </li><li> Voeg 10.000 cellen / cm2 putjes. </li><li> Verhoging media 100 pl per putje en incubeer bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Driedimensionale celcultuur 9 <ol><li> Gebruikt oplossing van 1.3.3, resuspendeer pellet celconcentratie van 1.000.000 cellen / ml Pregel oplossing. </li><li> Snel afzien 16 pi pre-gel-celsuspensie in elk putje van een 96-wells plaat, een ~ 500 um dikke hydrogel 3D celkweek vormen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 30min voor gel te vormen. </li><li> Voeg 100 ul van medium naar de top van hydrogelen en incubeer bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Driedimensionale celcultuur op variabele stijfheid gels <ol><li> Gebruik van oplossing 1.3.3 Pipetteer 100 ul van pre-gel oplossing in elk putje van een 96-wells plaat. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten gel te vormen. Opmerking: Cross-linking stappen van deel 2 kan hier worden gebruikt. </li><li> 9 passage cellen. </li><li> Voeg 10.000 cellen / cm2 putjes. </li><li> Verhoging media 100 pl per putje en incubeer bij 37 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Three-Dimensional+Cell+Culture+Matrices%3A+State+of+the+Art%22">Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art</a>. 14, (2008).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaycock%2C+JW+%223D+Cell+Culture%22">3D Cell Culture</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Epithelial+cell+culture+protocols%22">Epithelial cell culture protocols</a>. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract%2C+geniposide+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li>
<li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li>
<li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li>
<li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res.+J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+RA+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22">J.Biomed.Mater.Res.A</a>. , (2016).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%3A+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li>
<li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines%2C+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+%28Cultrex+or+Matrigel%29+co-injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li>
<li>Zhang, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel%2Fmicrocapsules+scaffolds+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li>
<li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+human+lung+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li>
<li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63%2BKrt5%2B+distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li>
<li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een van de integrale aspecten van de biologie is de zelforganisatie van moleculen in hiërarchische structuren die een specifieke taak uit te voeren. 13 In het laboratorium zelfassemblage afhankelijk van talrijke factoren zoals zoutconcentratie, pH en duur spijsvertering. Zoals getoond zelforganiserend hydrogel vormen wanneer opgeloste eiwitten weer een fysiologische temperatuur. De gevormde hydrogel kan bevorderen cellulaire hechting en proliferatie in vitro. Cellulaire r...

Het vertalen van in vitro resultaten naar de klinische praktijk is een van de meest uitdagende problemen waarmee biomedische onderzoekers worden geconfronteerd. In vitro onderzoek op weefselkweekplastic is eenvoudiger, handiger en behoudt een hoge cellevensvatbaarheid.1 Deze aanpak is een redelijke start, maar de resultaten hebben een beperkte klinische toepasbaarheid. Steeds vaker gebruiken laboratoria driedimensionale constructies om de traditionele tweedimensionale methoden te vervangen. Er zijn reviews beschikbaar voor vele driedimensionale omgevingen, van biologische skeletten tot polymeerskeletten.2,3
Biologische structuren kunnen kenmerken van in vivo omgevingen nabootsen omdat ze veel van de eiwit- en glycosaminoglycaancomponenten van de natuurlijke matrix bevatten en bekende bindingsplaatsen bieden waaraan cellen zich kunnen hechten en herkennen. Het is aangetoond dat materialen afgeleid van de extracellulaire matrix (ECM) in staat zijn om skeletten te vormen voor celhechting en -proliferatie.4 Een uitdaging die de toepassing van ECM-hydrogelplatforms beperkt, komt voort uit hun inherent zwakke mechanische eigenschappen na gelering. Natuurlijk weefsel heeft vaak mechanische eigenschappen die veel hoger zijn dan die van hydrogels. Niet-toxische verknopingsmiddelen kunnen de mechanische eigenschappen van hydrogels verhogen om de natuurlijke weefselomgeving beter te nabootsen. Genipine is een niet-toxisch, natuurlijk verknopingsmiddel afgeleid van Gardenia-planten met de mogelijkheid om de mechanische eigenschappen van ECM nauwgezet aan te passen door veranderingen in de genipineconcentratie5,6. 
Bijna alle cellen in het lichaam bestaan in en organiseren zich op ECM dat ze zelf produceren of onderhouden. Nieuwe aandacht voor de universele betekenis van ECM in de organisatie, toestand en functie in elk orgaan of systeem heeft geleid tot de productie van matrixgebaseerde platformen voor in vitro onderzoek. Varkenssubmucosa van de dunne darm is het meest uitgebreid bestudeerde natuurlijk afgeleide skelet en het is gebruikt om pezen, ligamenten, skeletspieren4 en zelfs bot7 te regenereren. Matrices uit andere organen en donordiersoorten hebben ook goed weefselregeneratiepotentieel aangetoond. Het gebruik van vreemde ECM-componenten veroorzaakt minimale problemen met immunomodulatie. Na eliminatie van hostcellulaire materie zal het resterende ECM qua aminozuurgehalte en organisatie vergelijkbaar zijn met die van alle andere zoogdiersoorten8. Er is een groeiende denkwijze dat de beste manier om cel-ECM-interacties in vitro te onderzoeken, is door orgaanspecifieke ECM-skeletten te gebruiken. Elk orgaan biedt een unieke samenstelling van eiwitten en proteoglycanen om cellulaire niches te creëren. Niches zorgen voor structurele, functionele en zelfs enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix die bijdraagt aan biofysische signalering. Om een in vitro micro-omgeving te verkrijgen die het meest lijkt op de in vivo micro-omgeving, zou het gebruik van weefselspecifiek ECM de cellulaire niches voor onderzoek optimaliseren. 
Het doel van dit protocol is om een methode te bieden voor het opzetten van een hydrogelskelet uniek voor de long-ECM. Deze methode biedt een platform voor in vitro onderzoek naar longcel-ECM-interacties.

<table><tbody><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Gebruik in afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100g</td><td>Gebruik in kap met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>Geen</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>Geen</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Gebruik in afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>Gebruik in afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-151</td><td>Geen</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Hand pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Graduate Beaker</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>Gebruik cryohandschoenen en oogbescherming.</td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>Gebruik handschoenen.</td></tr><tr><td>Rheometer</td><td>Discovery</td><td>HR-2</td><td>Gebruik handschoenen en oogbescherming.</td></tr></tbody></table>

tunable hydrogels van pulmonary extracellulaire matrix voor 3d-cell culture

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Hier presenteren we een methode voor het vaststellen van meervoudige component celkweek hydrogels voor in vitro long celkweek. Beginnend met gezonde en bloc longweefsel van varkens, rat of muis, wordt het weefsel perfusie en ondergedompeld in daaropvolgende chemische reinigingsmiddelen om de celresten te verwijderen. Histologische vergelijking van het weefsel voor en na verwerking bevestigt verwijdering van meer dan 95% van dubbelstrengs DNA en alfa- galactosidase kleuring zien dat de meerderheid van cellulaire afval wordt verwijderd. Na decellularisatie, het weefsel gevriesdroogde en vervolgens cryomilled tot een poeder. De matrix poeder wordt gedigereerd gedurende 48 uur in een zure pepsine oplossing en daarna geneutraliseerd tot de pre-gel te vormen. Gelering van het pre-gel oplossing kan worden geïnduceerd door incubatie bij 37 ° C en kan worden gebruikt direct na neutralisatie of maximaal twee weken opgeslagen bij 4 ° C. Coatings kunnen worden gevormd met de pre-gel oplossing op niet-behandelde dienblad cell attachment. Cellen kunnen worden gesuspendeerd in de pre-gel voorafgaand aan zelfassemblage een 3D cultuur bereiken, uitgeplaat op het oppervlak van een gel gevormd waarvan de cellen kunnen migreren door het schavot, of bedekt op de bekledingen. Wijzigingen in de strategie gepresenteerd van invloed kan zijn geleringstemperatuur, kracht, of eiwit fragment maten. Beyond hydrogel formatie, kan de hydrogel stijfheid verhoogd door toepassing genipin.

Met deze methode, hebben we hydrogelen van normaal varken, rat, en muis longen (figuur 1) verkregen. Verwerkte longen geven respectievelijk een geschatte 5 mg, 40 mg en 10 g ECM poeder. Een overzicht van de werkwijze is weergegeven in figuur 2. Key visualisaties tijdens het proces zijn onder meer: ​​wit uiterlijk van de longen na het spoelen deoxycholaat; na de vorming Pregel dient de oplossing ondoorzichtig en de oplossing moet homogeen weergegeven voor...

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Het algemene doel van deze methode om aangepaste hydrogels te maken, is het bestuderen van cellen en kweekcondities die de complexiteit van de extracellulaire matrix van de long nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het pulmonaire veld, zoals de wijze waarop longcellen interageren met de ECM onder gezonde en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de long-ECM-hydrogels aanpasbaar zijn aan uw toepassing in 2D- of 3D-kweek.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de complexiteit van de decellularisatietechnieken, waarbij soms meerdere mensen en aandacht voor detail nodig zijn om de hoeveelheid levensvatbaar weefsel te optimaliseren. Zorg voor dit protocol dat een varkenslong gereed is voor decellularisatie. Details over de preparatie hiervan kunnen worden gevonden in het tekstprotocol.Zodra de long is geprepareerd, gebruikt u een handpomp die is gecannuleerd om op de longslagader te passen. Perfundeer eerst ongeveer één liter water in de vasculatuur en vervolgens 1,5 liter in de trachea. Herhaal dit drie keer, waarbij u het volume van het geperfundeerde water verhoogt naarmate cellulair debris wordt verwijderd.Perfuse vervolgens het weefsel met Triton X-100, eveneens met gebruik van de handpomp. Dompel het weefsel daarna gedurende 24 uur onder in een bad met Triton X-100-oplossing bij vier °C. Spoel na 24 uur de vaten en de trachea drie keer af met gedestilleerd water.Na het spoelen wordt de handpomp gebruikt om het weefsel te perfunderen met deoxycholaat. Dompel het weefsel vervolgens 24 uur lang in deoxycholaat bij vier graden Celsius. Spoel het weefsel de volgende dag drie keer met gedestilleerd water, zoals eerder beschreven.Gebruik na het spoelen de handpomp om het weefsel te perfunderen met gefilterd natriumchloride. Dompel het weefsel vervolgens gedurende een uur in gefilterd natriumchloride bij vier graden Celsius. Perfundeer na het bad de vasculatuur en de trachea drie keer met gedestilleerd water om te spoelen.Perfuse na het spoelen het weefsel met DNase-oplossing en onderdompel het vervolgens gedurende één uur in DNase-oplossing bij vier graden Celsius. Perfuse na een uur de vasculatuur en de trachea vijf keer met PBS, niet met water. Dissecteer nu, gebruikmakend van enkel ondoorzichtig wit weefsel, alle tubuli weg die een diameter van twee millimeter of groter hebben.Ze bevinden zich voornamelijk rond de hilus en de mediale delen van de longen. Laat de respiratoire zones, die zich grotendeels in de periferie bevinden, intact. Ontleed het weefsel, nadat de tubuli zijn verwijderd, in secties van één inch of kleiner.De oriëntatie van deze blokken is niet belangrijk. Nadat de weefselblokken zijn uitgelekt, kunnen ze worden overgebracht naar een conische buis van 50 milliliter en worden ingevroren bij -80 °C. Enkele blokken kunnen worden apartgezet voor histologie om de verwijdering van cellen en debris te bevestigen.Om het longweefsel te verwerken tot gedecellulariseerd poeder, vervangt u de dop van de buis met bevroren weefsel door een filterpapier en zet u dit vast met een elastiekje. Lyofiliseer vervolgens het weefsel met een vriesdroger volgens de aanwijzingen van de fabrikant, totdat alle overtollige vloeistof is verdwenen. Bewaar het weefsel daarna bij 80 °C tot het kan worden gemalen.Om de molen klaar te maken, vult u deze eerst met vloeibare stikstof, waarbij ruimte wordt gelaten voor de maalbuis. Verwijder vervolgens de magnetische maalstaaf uit de maalbuis en bedek de bodem van de buis met weefsel. Plaats daarna de maalstaaf terug en vul de buis verder op door er voorzichtig meer weefsel in te stoppen.Sluit daarna de maalbuis, plaats deze in de vriezer/molen en vul de molen tot de maximale capaciteit met vloeibare stikstof. Laat de molen nu ongeveer vijf minuten draaien met een impactsnelheid van ongeveer 600 per minuut. Bewaar het gedecellulariseerde poeder vervolgens bij -80 °C tot het nodig is.Om het pre-gelmateriaal te maken, voegt u gedecellulariseerd weefselpoeder en pepsine toe aan een conische buis. Voeg vervolgens 0,01 molair zoutzuur toe aan de buis, voor een uiteindelijke concentratie van 1% gedecellulariseerd weefselpoeder en 0,01% pepsine. Houd deze oplossing 48 uur lang onder constante agitatie bij kamertemperatuur om de weefsels te verteren.Zet de oplossing na 48 uur vijf minuten op ijs. Pas vervolgens de pH van de oplossing aan naar 7,4 met behulp van koude 0,1 molar natriumhydroxide en breng daarna de PBS-concentratie van de oplossing naar 1X door 10X PBS toe te voegen. Wij hebben ervaring met het aanpassen van de tijden en de pH van de pre-gel.Er is enige flexibiliteit in het bereik dat gebruikt kan worden, maar de eigenschappen kunnen drastisch veranderen als de procedure op kleine schaal wordt gewijzigd. De oplossing wordt niet beschouwd als pre-gel en kan worden gebruikt om onbehandelde platen te coaten voor het vormen van hydrogels waarop cellen kunnen groeien, voor het vormen van hydrogels waarin cellen kunnen groeien, of het kan verder worden gemodificeerd vóór de vorming van hydrogels om de stijfheid van de hydrogels te verhogen. Om cellen te kweken op een tweedimensionale microporeuze gelcoating, voeg dan 20 µL pre-geloplossing toe aan de putjes van een onbehandelde 96-well tissue culture plaat.Zet de plaat vervolgens een nacht in de koelkast bij 4 °C, zodat de eiwitten in de plaat worden geabsorbeerd. Aspireer de volgende dag de pre-gel oplossing en spoel de wells met PBS. Voeg daarna 3.200 cellen toe aan elke well en vul het mediumvolume in elke well aan tot 100 µL.De plaatjes kunnen vervolgens worden geïncubeerd. Voor een driedimensionale celkweek met cellen in de microporeuze gel worden de betreffende cellen resuspenderd op één miljoen per milliliter in de pre-geloplossing. Verdeel vervolgens snel 16 µL van de celsuspensie over elke put van een 96-wellplaat om een 3D-celkweek te vormen met een dikte van ongeveer 500 micron.De gel zal na 30 minuten vormen zodra deze is geïncubeerd bij 37 °C. Nadat de gels zijn gevormd, voegt u medium toe aan de putjes tot aan de 100 µL markeringen. Voor een driedimensionale celkweek met cellen bovenop de microporeuze gel, voegt u de 100 µL van de pre-geloplossing toe aan de putjes van een onbehandelde 96-well plaat.Incubeer de plaat vervolgens 30 minuten bij 37 °C voor gelering. Zodra de gels zijn gevormd, voegt u 3.200 cellen in 100 µL medium toe op de hydrogels en gaat u over tot het incuberen van de plaat. Hydrogels werden geproduceerd uit normale longen van varkens, ratten en muizen met behulp van de beschreven methode.Reologische tests bevestigden dat meer dan 90% van de gelling plaatsvindt in de eerste minuten nadat 37 °C is bereikt. De gevormde hydrogels waren gedurende lange perioden stabiel in PBS, maar celadhesie en proliferatie kunnen in de loop van de tijd veranderen. De pre-gel oplossing werd getest als coating om de celadhesie te verbeteren.De hechting en proliferatie van endotheliale cellen uit de menselijke navelstrengader werden gemeten met behulp van een MTTSA. Verbeteringen werden waargenomen door de wells te coaten met ECM. Bij het maken van 3D-gels zorgde de toevoeging van Genipine voor een toename van de crosslinking van de hydrogel.Met behulp van frequentiesweeps op een rheometer werd de stijfheid van de hydrogel direct gecorreleerd aan de Genipin-concentratie, waarbij de mediaan en meest relevante concentratie 0,01% was. Bij het testen van de stijvere gels bleek uit een MTTSA dat de celproliferatie hoger was op de gels met een verhoogde crosslinking. Zodra de methode onder de knie is, kan de decellularisatie in acht uur over vier dagen worden uitgevoerd. De pre-geloplossing kan in één uur over twee dagen worden bereid, en de gelvorming kan in twee uur over twee dagen worden voltooid.Na deze procedure kunnen andere methoden zoals AFM, western blots, kleuring en immunohistochemie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de elastische modulus, de eiwitsamenstelling en de cellulaire respons op het materiaal.

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time celbiologie studies. Hier een werkwijze voor FRET beeldvorming cellen in fysiologische driedimensionale (3D) hydrogel microenvironments middels conventionele epifluorescentie microscopie wordt gepresenteerd. Een analyse voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering bereik oplevert wordt beschreven.

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Actuele modellen van de cultuur van de dubbelgelaagde toegestaan niet voor functionele in vitro studies die in vivo microenvironments na te bootsen. Met behulp van polyethyleenglycol en een methode van zinkoxide templating, beschrijft dit protocol de ontwikkeling van een uiterst dunne biomimetische kelder membraan met afstembare stijfheid, porositeit en biochemische samenstelling die nauw samen van de Nabootsers van in vivo extracellulaire matrices.

Uiterst dunne Porated elastisch Hydrogels als biomimetische kelder membraan voor Dual cel cultuur

Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.

Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.

3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen

Leer hoe je aanpasbare hydrogels maakt van long-extracellulaire matrix voor 3D-celkweek. Deze methode gebruikt decellularisatie van varkenslongweefsel om celgedrag in gezonde en pathologische omstandigheden te bestuderen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Meer video's verkennen