Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture
17 januari 2017
Dit is een methode om een 3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.
Het algemene doel van deze methode om aangepaste hydrogels te maken, is om cellen en kweekcondities te bestuderen die de complexiteit van de extracellulaire matrix van de long nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het longveld, zoals hoe longcellen onder gezonde en pathologische omstandigheden met ECM interageren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de long ECM-hydrogels aanpasbaar zijn aan uw toepassing in 2D of 3D kweek.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de complexiteit van de decellularisatietechnieken, die soms meerdere mensen en aandacht voor detail vereisen om de hoeveelheid levensvatbaar weefsel te optimaliseren. Voor dit protocol, heb een varkenslong klaar voor decellularisatie. Details over de voorbereiding ervan zijn te vinden in het tekstprotocol.
Zodra de long is voorbereid, gebruik een handpomp die is gecannuleerd om in de longslagader te passen. Perfundeer eerst ongeveer een liter water in de bloedvaten en vervolgens 1,5 liter in de luchtpijp. Doe dit drie keer, waarbij het volume van het geperfundeerde water toeneemt naarmate cellulair afval wordt verwijderd.
Perfundeer vervolgens het weefsel met Triton X-100, eveneens met behulp van de handpomp. Dompel het weefsel vervolgens gedurende 24 uur onder in een bad met Triton X-100-oplossing bij vier graden Celsius. Na 24 uur spoelt u de bloedvaten en luchtpijp drie keer met gedestilleerd water.
Na de spoelingen gebruikt u de handpomp om het weefsel met deoxycholaat te perfunderen. Dompel vervolgens het weefsel gedurende 24 uur onder in deoxycholaat bij vier graden Celsius. De volgende dag spoelt u het weefsel drie keer met gedestilleerd water, zoals eerder.
Na de spoelingen gebruikt u de handpomp om het weefsel met gefilterd natriumchloride te perfunderen. Dompel het weefsel vervolgens een uur lang in gefilterd natriumchloride bij vier graden Celsius. Na de bad spoelt u de bloedvaten en luchtpijp drie keer met gedestilleerd water om te spoelen.
Na de spoelingen perfundeert u het weefsel met DNase-oplossing en dompelt u het vervolgens een uur lang in DNase-oplossing bij vier graden Celsius. Na een uur perfundeert u de bloedvaten en luchtpijp vijf keer met PBS, niet met water. Gebruik nu alleen ondoorzichtig wit weefsel en verwijder alle buisjes met een diameter van twee millimeter of groter.
Ze zijn voornamelijk te vinden rond het hilum en de mediale delen van de longen. Laat de ademhalingszones intact, die zich meestal in de periferie bevinden. Na het verwijderen van de buisjes, snijdt u het weefsel in secties van een inch of kleiner.
De oriëntatie van deze blokken is niet belangrijk. Nadat u de weefselblokken hebt uitgelaten, brengt u ze over naar een 50 milliliter conische buis en bevriest u ze op 80 graden Celsius. Een paar blokken kunnen worden achtergelaten voor histologie om de verwijdering van cellen en afvalstoffen te bevestigen.
Om het longweefsel te verwerken tot gedecellulariseerd poeder, vervangt u het deksel op de bevroren weefselbuis met een filterpapier en bevestigt dit met een elastiek. Lyofilisa vervolgens het weefsel totdat al het overtollige vocht verdwenen is met behulp van een vriesdroger volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bewaar vervolgens het weefsel op 80 graden Celsius totdat het kan worden gemalen.
Om de molen klaar te maken, laadt u deze eerst met vloeibare stikstof, waarbij u ruimte laat voor de molenbuis. Vervolgens verwijdert u vanuit de molenbuis de magnetische molenstang en bedekt u de bodem van de buis met weefsel. Vervolgens vervangt u de molenstang en verpakt u losser meer weefsel om de buis te vullen.
Sluit vervolgens de molenbuis, plaats deze in de vriezer/molen en vul de molen tot aan de maximale capaciteit met vloeibare stikstof. Laat nu de molen ongeveer vijf minuten draaien met een impactiefrequentie van ongeveer 600 per minuut. Bewaar vervolgens het gedecellulariseerde poeder op 80 graden Celsius, totdat het nodig is.
Om het voor-gelmateriaal te maken, voegt u gedecellulariseerd weefselpoeder en pepsine toe aan een conische buis. Voeg vervolgens 0,01 molair zoutzuur toe aan de buis, voor een eindconcentratie van 1% gedecellulariseerd weefselpoeder en 0,01% pepsine. Houd deze oplossing onder constante beweging bij kamertemperatuur gedurende 48 uur om de weefsels te verteren.
Na 48 uur zet u de oplossing vijf minuten op ijs. Pas nu de pH van de oplossing aan op 7,4 met behulp van koude 0,1 molair natriumhydroxide en breng vervolgens de PBS-concentratie van de oplossing op 1X door 10X PBS toe te voegen. We hebben enige ervaring met het wijzigen van tijden en de pH van het voor-gel.
Er is enige flexibiliteit in het bereik dat kan worden gebruikt, maar de eigenschappen kunnen dramatisch veranderen als de procedure op kleine wijze wordt gewijzigd. De oplossing wordt niet als voor-gel beschouwd en kan worden gebruikt om niet-behandelde platen te coaten om hydrogels te vormen om cellen op te vormen, om hydrogels te vormen om cellen in te vormen, of het kan verder worden gemodificeerd voordat hydrogels worden gevormd om de stijfheid van de hydrogels te verhogen. Om cellen op een tweedimensionaal microporiën gelcoating te kweken, voegt u 20 microliter voor-geloplossing toe aan putjes van een 96-well niet-behandelde weefselkweekplaat.
Koel vervolgens de plaat een nacht op vier graden Celsius zodat eiwitten op de plaat worden geabsorbeerd. De volgende dag zuigt u de voor-geloplossing af en spoelt u de putjes met PBS. Voeg vervolgens 3.200 cellen toe aan elke put en breng het mediavolume in elke put naar 100 microliters.
De platen kunnen vervolgens worden geïncubeerd. Voor een driedimensionale celkweek met cellen in het microporiën gel, resuspendeer de cellen van belang op één miljoen per milliliter in voor-geloplossing. Spuit vervolgens s
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methode beschrijft de creatie van een driedimensionaal celkweeksteunstructuur met gebruik van pulmonale extracellulaire matrix. Het proces omvat het decellulariseren van intact longweefsel om hydrogels te produceren die celgroei in drie dimensies faciliteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celkweek
- Onderzoek naar de extracellulaire matrix
- Pulmonale biologie
Achtergrond
- Deze methode is erop gericht de complexiteit van de extracellulaire matrix van de long na te bootsen.
- Het behandelt hoe longcellen in verschillende condities interageren met de ECM.
- De techniek maakt het mogelijk om hydrogels aan te passen voor specifieke toepassingen.
- Decellularisatie vereist nauwgezette aandacht voor detail en kan meerdere personen vereisen.
Doel van de studie
- Om hydrogels te ontwikkelen die de long-ECM nabootsen voor onderzoeksdoeleinden.
- Om het celgedrag in gezonde en pathologische longcondities te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van interacties tussen longcellen.
Gebruikte methoden
- Decellularisatie van longweefsel van varkens.
- Bereiding van hydrogels uit de extracellulaire matrix.
- Celkweek in 2D- en 3D-omgevingen.
- Optimalisatie van de weefsellevensvatbaarheid tijdens het proces.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van aanpasbare hydrogels van long-ECM.
- Verbeterd begrip van de interacties tussen longcellen en de ECM.
- Aangetoond potentieel voor toepassing in diverse onderzoekcontexten.
- Geïdentificeerde uitdagingen in het decellularisatieproces.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor pulmonaal onderzoek.
- Hydrogels kunnen worden aangepast aan specifieke experimentele behoeften.
- Verdere studies kunnen de implicaties van de ECM voor de longgezondheid onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Deze methode maakt de creatie mogelijk van instelbare hydrogelen van de pulmonale extracellulaire matrix die de complexiteit van longweefsel nabootsen voor in vitro studies. Het ondersteunt mechanistische risicoreductie bij targetvalidatie door een ziekterevant systeem te bieden om cel-ECM-interacties te bestuderen onder gezonde en pathologische omstandigheden. De instelbare stijfheid en het aanpasbare formaat vergroten het voorspellende vertrouwen bij de selectie van preklinische modellen en workflows voor assayontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door interacties van longcellen met native ECM te modelleren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar biologisch systeem voor de verduidelijking van signaalpaden en functionele targetvalidatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage via ziekterelateerde 3D-culturen die de translationele biomarker-afstemming verbeteren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde hydrogels met kwantificeerbare resultaten voor betrouwbare screening van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie en schaalbaarheid van assays mogelijk via instelbare gelatietemperatuur en stijfheid.
- Potentieel voor hergebruik: Vormt coatings of 3D-steigers die compatibel zijn met high-throughput plating en downstream analytics.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met behulp van fysiologisch relevante long-ECM.
- Risicobeperking: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door hydrogelstijfheid (via genipine-crosslinking) te correleren met resultaten van cellulaire proliferatie.
- Beslissingsondersteuning: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via meetbare veranderingen in celhechting en migratie.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege biologie tot leadidentificatie, door een instelbaar 3D-kweekplatform te bieden dat de longspecifieke micro-omgeving modelleert.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door celkweek in long-afgeleide ECM onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare hydrogels met reproduceerbare gelering en kwantificeerbare dikte voor consistente evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert meetbare output zoals gelvormingskinetiek, stijfheid en celproliferatie voor vergelijkende conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinisch werk via ziekterelevante systeemmodellering en biomarker-compatibele read-outs.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar hydrogelplatform dat aanpasbaar is voor knaagdier- en varkensmodellen voor standaardisatie over projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in studies naar longcellen en ECM te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde stappen voor decellularisatie, digestie en gelering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege beoordeling van compound-effecten in een fysiologisch relevante matrix mogelijk te maken.
- Portfolio-impact: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering via instelbare hydrogels die door ziekte gewijzigde ECM-stijfheid modelleren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in weefseldecellularisatie en hydrogelbereiding om levensvatbaarheid en consistentie te waarborgen.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een vriesdroger, cryomolen en rheometer voor procescontrole en karakterisering.
- Vereist standaardisatie van de hydrogelformulering en opslagprotocollen tussen teams voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de methode op verschillende soorten of longen uit ziekte-modellen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals een verwerkingstijd van meerdere dagen en gevoeligheid voor procedurele wijzigingen die de gelsterkte beïnvloeden.
