Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

Het algemene doel van dit protocol is om de effecten van supplementaire voedingsstoffen te evalueren in een muismodel van colitis geïnduceerd door dextran sulfaat natrium. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de intestinale immunologie over de ontwikkeling van klinische wetenschap gedurende het verloop van het colitismodel-experiment. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de lage kosten, het feit dat er geen geavanceerde apparatuur vereist is en dat het een duidelijke analyse biedt van de morfologie van het gehele colon.

Deze methode kan worden gebruikt om oxidatieve stress in het colon te evalueren als gevolg van overmatige rekrutering van neutrofielen. Voor het toedienen van voedingssupplementen via sondevoeding wordt de muis eerst handmatig bij de nek vastgehouden, waarbij de staart tussen de derde vinger en de basis van de duim wordt geplaatst. Houd vervolgens de muis in een rechtopstaande positie, voer de sonde-naald in aan de linkerzijde van de bek van het dier en volg voorzichtig het gehemelte om de slokdarm te lokaliseren.

Indien er geen weerstand wordt gevoeld, breng de naald dan verder voort richting de maag. Dien langzaam het volledige volume van het supplement toe, waarna de spuit voorzichtig wordt verwijderd en het lichaamsgewicht van het dier wordt gemeten. Ken een score van nul tot vier toe op basis van het percentage gewichtsverlies, verzamel vervolgens een verse ontlastingstest en gebruik de meegeleverde applicatoren om een dun uitstrijkje van de monster op een objectglas uit een guaiac-testkit voor occult bloed in de ontlasting aan te brengen.

Sluit de klep aan de voorzijde van de kit en open het achtervenster om twee druppels van de ontwikkelaarshoulofening aan de achterzijde van de monsterlocatie aan te brengen. Lees de resultaten na 30 seconden af en ken een score van nul tot vier toe, afhankelijk van de signaalsterkte. Observeer vervolgens een tweede vers fecesmonster om de fecesconsistentie te beoordelen en ken hieraan, indien van toepassing, een score van nul tot vier toe.

Om de intestinale epitheliale permeabiliteit in vivo te bepalen, wordt een geanestheseerd dier in rugligging geplaatst en wordt er een midline incisie gemaakt om de darmen bloot te leggen. Lokaliseer het caecum en maak een kleine incisie in het proximale segment van het colon ascendens. Voer vervolgens een 22 gauge voedingsnaald in en zet de naald vast met een ligatuur van gewone zijden draad.

Spoel voorzichtig een ruim volume PBS door de naald om alle feces uit het colon te verwijderen, gevolgd door het inbrengen van Evans blue-oplossing totdat de kleurstof de anus bereikt. Spoel na 15 minuten de buis met een overmaat aan PBS totdat het perianale uitspoelwater helder is. Exciteer vervolgens het colon en spoel het weefsel met meer PBS, gevolgd door één milliliter zes millimolaire N-acetylcysteïne om eventuele kleurstof te verwijderen die aan het colonslijmvlies kleeft.

Snijd nu de dikke darm in de lengte open en spoel het weefsel nogmaals met PBS en N-acetylcysteïne. Noteer vervolgens het gewicht en de lengte van de dikke darm en plaats het weefsel in twee milliliters N, N-dimethylformamide bij kamertemperatuur met zachte agitatie om de resterende kleurstof te extraheren, waarna de kleurstofconcentraties de volgende ochtend spectrofotometrisch bij 610 nanometers worden gemeten. Na zeven dagen van dextraansulfaatnatrium, of DSS-geïnduceerde colitis, wordt de gehele dikke darm gedisseceerd en wordt de lengte ervan genoteerd. Voor swiss rolls wordt de dikke darm in de lengte geopend, wordt eventuele fecale materie zorgvuldig verwijderd en wordt een dun, rond houten stokje of een fijne pincet gebruikt om het weefsel op te rollen met de mucosa naar binnen gericht.

Plaats het weefsel vervolgens voorzichtig in een inbedcassette, gevolgd door fixatie met vijf milliliter 10% formaldehyde bij kamertemperatuur. Het is essentieel om de dikke darm strak op te rollen zonder vouwen om problemen tijdens het snijden van het weefsel te voorkomen; dit zou kunnen leiden tot klinische weefselschade en een onjuiste interpretatie als colitis-gerelateerde schade. Was het monster na 48 uur gedurende 18 uur met kraanwater, gevolgd door dehydratie via een ethanolserie.

Na de laatste onderdompeling in absolute ethanol wordt het weefsel behandeld met vier incubaties van één uur in xyleen. Na de laatste onderdompeling in xyleen wordt het monster geplaatst in 50 milliliters vloeibare paraffine voor één incubatie van 17 uur en één incubatie van drie uur. Aan het einde van de drieuurige incubatie wordt het monster voor 24 uur ondergedompeld in 8 tot 10 milliliters verse vloeibare paraffine in een plastic vorm van 22 kubieke millimeter vierkant.

Wanneer de paraffine gestold is, gebruik dan een microtoom om weefselcoupes van vijf micron dik te verkrijgen, dompel de dwarsdoorsneden vervolgens kort onder in een waterbad van één liter met 0,3% gelatine en monteer de monsters onmiddellijk op met polylysine behandelde glasplaatjes voor H&E-kleuring. Voor de analyse van oxidatieve stress wordt eerst een barrière rond het weefsel gecreëerd met een hydrofobe pen. Incubeer vervolgens cryo-dwarsdoorsneden van het weefsel van acht micron gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker in vijf micromolaire DHE opgelost in water.

Na de incubatie volgen drie wasbeurten van 15 minuten in PBS met zachte agitatie bij kamertemperatuur. Laat de monsters aan de lucht drogen en voeg een druppel monteermedium toe om de fluorescentie te beschermen. Observeer vervolgens de fluorescentie van het geoxideerde ethidium met een laser scanning confocale microscoop bij een 40x vergroting.

DSS-behandeling leidt tot een continu toenemende ziekteactiviteitsindex, zoals verwacht, waarbij een maximale score wordt bereikt op dag zeven na inductie. Suppletie met een ontstekingsremmend dieet vertraagt het vroege begin van de colitis, terwijl de beschermende effecten op latere tijdstippen slechts marginaal zijn. Dieetinterventie kan mogelijk ook de door DSS geïnduceerde toename van de intestinale epitheliale permeabiliteit, evenals de verkorting van de colonlengte, voorkomen.

Hematoxyline- en eosinekleuring van in paraffine ingebed distaal colonweefsel laat zien dat controlemonsters een normale morfologie vertonen, terwijl dieren die met DSS zijn behandeld de typische tekenen van colitis vertonen. Opmerkelijk is dat een gelijktijdige behandeling met dieetsuppletie de door colitis geïnduceerde morfologische veranderingen duidelijk verlicht, met een algehele morfologie die vergelijkbaar is met die van de controlegroep. Immunofluorescentiekleuring van het distaal colonweefsel wijst er ook op dat de moleculen van de tight junctions worden geïnternaliseerd tijdens DSS-geïnduceerde colitis en dat de co-lokalisatie van deze eiwitten gedeeltelijk verloren gaat bij de contactpunten van de crypt-epitheelcellen.

Belangrijk is dat deze internalisatie wordt verminderd wanneer DSS-behandelde muizen het ontstekingsremmende en antioxidant-rijke dieetsupplement ontvangen. Bovendien wordt de sterke rekrutering van neutrofielen naar het colon als reactie op DSS-geïnduceerde colitis tegengegaan door de dieetsuppletie, wat resulteert in een gelijktijdige verbetering van de door neutrofielen veroorzaakte oxidatieve stress en een lichte vermindering in de productie van inflammatoire cytokinen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals metingen met een oozing chamber, worden uitgevoerd om de elektrische weerstand van de epitheliale barrière in het colon te analyseren.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van colitisonderzoek en het verkennen van het moleculaire mechanisme van de pathogenese van colitis ulcerosa in een reproduceerbaar muismodel. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe de ontwikkeling van colitis en de gunstige effecten van voedingssupplementen op de functies van de intestinale epitheliale barrière kunnen worden geanalyseerd. Vergeet niet dat het werken met levende dieren strikte naleving van hoge ethische normen vereist om onnodig lijden te voorkomen.