Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

Het algemene doel van dit protocol is om de effecten van supplementaire voedingsstoffen te evalueren in een muismodel van colitis geïnduceerd door dextransulfaatnatrium. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van intestinale immunologie over de ontwikkeling van klinische wetenschap tijdens het verloop van het colitismodelexperiment. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het goedkoop is, geen geavanceerd apparatuur vereist en een duidelijke analyse van de morfologie van de gehele colon biedt.

Deze methode kan worden gebruikt om oxidatieve stress in de colon te evalueren als gevolg van overmatige neutrofielenrecrutering. Voor toediening van voedingssupplementen door sondevoeding, houdt de muis eerst handmatig vast bij de scruff, waarbij de staart tussen de derde vinger en de basis van de duim wordt geplaatst. Houd vervolgens de muis in een rechtopstaande positie en steek de sondevoedingsnaald in de linkerkant van de mond van het dier en volg voorzichtig het dak van de mond om de slokdarm te lokaliseren.

Als er geen weerstand wordt ondervonden, breng de naald langzaam naar de maag. Lever langzaam het gehele volume van het supplement af en verwijder voorzichtig de spuit en meet het lichaamsgewicht van het dier. Wijs een score van nul tot vier toe op basis van het percentage gewichtsverlies, verzamel vervolgens een verse ontlastingsmonster en gebruik de meegeleverde applicators om een dunne uitstrijk van het monster op een dia te maken van een guaiac fecale occulte bloedtestkit.

Sluit het deksel op de voorkant van de kit en open het achtervenster om twee druppels van de ontwikkelaarsoplossing op de achterkant van de monsterlocatie aan te brengen. Lees de resultaten na 30 seconden af, waarbij een score van nul tot vier wordt toegekend op basis van de signaalsterkte. Observeer vervolgens een tweede vers ontlastingsmonster om de consistentie van de ontlasting te beoordelen, waarbij een score van nul tot vier wordt toegekend zoals passend.

Om de intestinale epitheliale permeabiliteit in vivo te bepalen, plaats een verdovingsdier in de rugligging en maak een midline-incisie om de darmen bloot te leggen. Lokaliseer het cecum en maak een kleine incisie in het proximale segment van de oplopende colon. Breng vervolgens een 22 gauge voedingsnaald in en zet de naald vast met een gewone zijden draadligatuur.

Spoel voorzichtig een overvloedig volume PBS door de naald om alle feces uit de colon te spoelen, gevolgd door de installatie van Evans blauw oplossing totdat de kleurstof de anus bereikt. Na 15 minuten spoelt u de buis met een overmaat aan PBS totdat de wassing rond de anus helder is. Vervolgens verwijdert u de colon en spoelt u het weefsel met meer PBS, gevolgd door één milliliter van zes millimolair N-acetylcysteïne om eventueel aan het colonslijm blijvend klevend kleurstof te elimineren.

Snijd nu de colon longitudinaal en spoel het weefsel nog een keer met PBS en N-acetylcysteïne, noteer vervolgens het gewicht en de lengte van de colon en plaats het weefsel in twee milliliter N, N-dimethylformamide bij kamertemperatuur met zachte agitatie om de resterende kleurstof te extraheren, en meet de kleurstofconcentraties spectrofotometrisch bij 610 nanometer de volgende ochtend. Na zeven dagen dextransulfaatnatrium, of DSS-geïnduceerde colitis, dissecteert u de gehele colon en noteert u de lengte. Voor Zwitserse rollen opent u de colon longitudinaal, verwijdert u voorzichtig eventueel feces en rolt u het weefsel met behulp van een dunne, ronde, houten stok of fijnpuntige pincetten met de mucosa naar binnen gericht.

Plaats vervolgens het weefsel voorzichtig in een inbeddingscassette, gevolgd door fixatie met vijf milliliter 10% formaldehyde bij kamertemperatuur. Het is van cruciaal belang om de colon strak op te rollen zonder te vouwen om problemen tijdens het weefseldoorsneden te voorkomen, wat kan resulteren in klinische weefselbeschadiging en een verkeerde interpretatie als colitis-geassocieerde schade. Na 48 uur wast u het monster 18 uur met kraanwater, gevolgd door dehydratie door een ethanolreeks.

Na de laatste absolute ethanol-immergeer behandel het weefsel met vier één uur incubaties in xyleen. Na de laatste xyleen-immergeer plaatst u het monster in 50 milliliter vloeibaar paraffine voor één 17-uur en één drie-uur incubatie. Aan het einde van de drie uur incubatie, dompelt u het monster in een 22 kubieke millimeter vierkante plastic mal in acht tot tien milliliter verse vloeibare paraffine gedurende 24 uur.

Wanneer de paraffine is gestold, gebruikt u een microtoom om vijf micrometer dikke weefselsneden te verkrijgen, dompelt u de dwarssneden vervolgens kort in een waterbad van één liter met 0,3% gelatine en monteert u de monsters onmiddellijk op met polylysine behandelde glasplaten voor H&E-kleuring. Voor oxidatieve stressanalyse, creëert u eerst een barrière rond het weefsel met een hydrofobe pen. Vervolgens incubeert u acht micrometer weefsel cryo dwarssneden in vijf micromolar DHE opgelost in water gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in het donker.

Incubatie wordt gevolgd door drie 15-minuten wasbeurten in PBS met zachte agitatie bij kamertemperatuur. Droog de monsters in de lucht en voeg een druppel montagemedium toe om de fluorescentie te beschermen. Observeer vervolgens de geoxideerde ethidiumfluorescentie op een laserscanning confocale microscoop bij een 40x vergroting.

DSS-behandeling leidt tot een continu stijgende ziekteactiviteitsindex zoals verwacht, met een maximumscore op dag zeven na inductie. Anti-inflammatoire dieetsuppletie vertraagt het vroege begin van colitis, terwijl de beschermende effecten op latere tijdstippen slechts marginaal zijn. Dieetinterventie kan ook door DSS geïnduceerde toename van de intestinale epitheliale permeabiliteit voorkomen, evenals verkorting van de lengte van de colon.

Hematoxyline en eosine kleuring van in paraffine ingebedde distale colon weefsels onthult dat controle monsters een normale morfologie vertonen, terwijl dieren behandeld met DSS de typische tekenen van colitis vertonen. Opmerkelijk is dat parallelle behandeling met dieetsuppletie duidelijk colitis-geïnduceerde morfologische veranderingen verlicht met een al