Het activeren van Autofagie door Aerobic Oefening in Muizen

Het algemene doel van dit experiment is om autofagie bij muizen fysiologisch te activeren door middel van geforceerd of vrijwillig hardlopen, om vervolgens de autofagieniveaus in specifieke weefsels te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over autofagie, in het bijzonder hoe autofagie en fysieke activiteit bijdragen aan de gunstige effecten die door aerobe inspanning worden bewerkstelligd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat fysieke inspanning een snelle aerobe manier is om autofagie in vivo bij muizen te stimuleren.

Begin dit experiment met C57 black six muizen van acht tot twaalf weken oud, die een transgen bezitten om exercise-geïnduceerde autofagie in vivo te detecteren, bekend als GFP-LC3. Raadpleeg de volgende JoVE-publicatie voor details over het gebruik van loopbanden voor muizen. Stel de elektrische stimulatie van de loopband in op een lage intensiteit.

Acclimatiseer de muizen tijdens hun eerste twee sessies aan een open loopband met een helling van tien graden. Laat de muizen op de eerste dag vijf minuten oefenen terwijl de loopband op een snelheid van acht meter per minuut draait. Laat de muizen op de tweede dag tien minuten lopen, aanvankelijk op acht meter per minuut, en verhoog na vijf minuten de snelheid naar tien meter per minuut.

Laat de muizen op de derde dag een volledige 90 minuten lopen. Start de loopband op tien meter per minuut en moedig de muizen aan om te lopen door middel van zachte duwtjes om herhaaldelijke voetshocks te vermijden. Het is essentieel om de muizen nauwlettend te observeren en te sturen, zodat ze tijdens de run van 90 minuten niet te veel elektrische schokken ontvangen.

Gebruik tijdens de run uw vingers om de muizen aan te moedigen op de loopband te blijven. Verhoog na 40 minuten de snelheid met één meter per minuut. Verhoog na 50 minuten de snelheid opnieuw met één meter per minuut.

Verhoog na 60 minuten de snelheid met nogmaals één meter per minuut. Begin na 70 minuten de snelheid elke vijf minuten te verhogen, zodat de laatste vijf minuten van de run van 90 minuten 17 meter per minuut bedragen. Euthanaseer de muizen onmiddellijk na afloop van de proef indien weefselverzameling gewenst is.

Huisvest de muizen voor deze test individueel. Gebruik hetzelfde ras als eerder beschreven. Bereid een looprad voor muizen met een diameter van 11,4 centimeter en een aangekoppelde fietsodometer voor.

Elke omwenteling moet een afstand van 358 millimeter bedragen. Plaats de muis in de kooi met het loopwiel en laat de muis dit gedurende twee weken vrij gebruiken. Registreer elke 24 uur de door de muis afgelegde afstand aan de hand van de kilometerteller.

Oogst na twee weken de weefsels voor analyse indien nodig. Behandel de muizen gedurende drie dagen met de autofagieremmer chloroquine om de autofagische flux te meten. Los de chloroquine op in PBS in een concentratie van 5 mg/mL en injecteer dit intraperitoneaal bij de muizen in een dosis van 50 µg/g.

Geef de muizen gedurende drie opeenvolgende dagen dagelijks één injectie en oogst de weefsels drie uur na de laatste injectie. Laat de muizen die op de loopband trainen 90 minuten na de injectie op de derde dag beginnen met het rennen van 90 minuten, zodat de loopbeurt drie uur na de injectie eindigt. Euthanaseer vervolgens de muizen en oogst onmiddellijk hun weefsels.

Bereid de fixatievloeistof voor om een dier binnen 90 minuten na de inspanning te perfunderen. Vul een spuit van 30 milliliter met 15 tot 20 milliliter vers bereid vier procent paraformaldehyde en verbind de spuit met een 20 gauge katheternaald. Bevestig de gevulde spuit aan de spuitpomp en stel deze in op een continue stroom van 90 milliliter per uur.

Leg het dier in rugligging op een schoon werkvlak en snijd de borstholte open door het diafragma om het hart bloot te leggen. Plaats nu de katheternaald in de rechterventrikel. Maak vervolgens een kleine incisie in de lever om het bloed af te voeren en start de pomp.

Injecteer het fixeer middel totdat de long en lever volledig bleek worden. Meestal zijn 15 milliliters fixeer middel voldoende. Verwijder na de perfusie de naald en verzamel de gewenste weefsels.

Om skeletspierweefsel te verzamelen, wordt de musculus vastus lateralis gedissecteerd. Trek de huid van het been kortstondig naar achteren om de spieren bloot te leggen en lokaliseer de musculus quadriceps femoris. Dissecteer vervolgens de musculus vastus lateralis vrij, dit is de buitenste spier die is vastgehecht aan het bovenste gedeelte van het dijbeen.

Voor verdere fixatie en dehydratie worden de geoogste weefsels 24 uur lang in 4% paraformaldehyde geplaatst bij 4 °C. Verplaats de weefsels de volgende dag naar 15% sucrose PBS en laat ze overnight weken bij 4 °C of totdat ze in de oplossing zijn gezakt. Verplaats de weefsels vervolgens naar 30% sucrose PBS bij 4 °C voor overnight of langer.

Houd de weefsels tijdens deze baden zoveel mogelijk in het donker. Plaats de weefsels vervolgens in een insluitmedium zoals OCT en snijd ze indien nodig in kleinere stukjes. Laat ze daarna enkele minuten acclimatiseren in een kleine petrischaal.

Breng ze vervolgens over naar cryomallen met voldoende OCT om ze te bedekken. Richt in de mallen de te snijden oppervlakken naar de bodem en voorkom dat er luchtbellen ontstaan. Bevries de monsters daarna in een afgedekte schuimkoeler gevuld met droogijs totdat het OCT wit wordt.

Wikkel nu individuele monsters in gelabelde folies, verzegel deze in een plastic zak en bewaar ze bij -80 °C tot ze verwerkt kunnen worden. Met GFP-getagd LC3 als reportersysteem werd de inductie van autofagie waargenomen in muizen die werden uitgeoefend zoals beschreven. Na stimulatie van de autofagie transloceerde LC3 van het cytosol naar het autofagosoom in punctate structuren.

Bij de getrainde muizen waren er aanzienlijk meer GFP-LC3 puncta aanwezig in zowel de skeletspieren als de cerebrale cortex in vergelijking met de rustende muizen. Western blot-analyse met een LC3-antilichaam toonde aan dat training de generatie van lipid-geconjugeerd LC3-II significant induceerde, wat suggereert dat er een verhoogde conversie van cytosolisch LC3-I naar LC3-II plaatsvond. Vervolgens werd de degradatie van de autofagische cargo-receptor, p62, gemeten.

90 minuten loopbandactiviteit veroorzaakte een hogere degradatie van p62 in skeletspieren dan in de rustconditie. Dit effect werd opgeheven door een injectie met chloroquine voorafgaand aan de inspanning. Aangezien chloroquine een remmer is van lysosomale degradatie, wijzen deze gegevens erop dat het waargenomen fenomeen te wijten is aan een verhoogde autofagische flux in plaats van een blokkade in de degradatie van autofagosomen.

Na de ontwikkeling hiervan waren er voorlopers van deze techniek op het gebied van autofagie om de effecten van het mechanisme van lichaamsbeweging op de afbraak van het metabolisme en diergedragingen te onderzoeken. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de muizen te monitoren terwijl ze rennen. Na deze procedure volgen methoden zoals elektronenmicroscopie.

Diermicroscopie kan worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de invloed van lichaamsbeweging op specifieke autofagiepaden, waaronder mitofagie en lipofagie.