Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks
3 januari 2017
Dit protocol beschrijft de implementatie van beeldgestuurde, lasergebaseerde hydrogeldegradatie om vasculair-afgeleide, biomimetische microfluïdische netwerken te fabriceren die zijn ingebed in poly(ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) hydrogels. Deze biomimetische microfluïdische systemen kunnen nuttig zijn voor weefselengineering toepassingen, generatie van in vitro ziektemodellen en fabricage van geavanceerde "on-a-chip" apparaten.
Het algemene doel van dit protocol is om te beschrijven hoe een confocale microscoop uitgerust met een femtoseconde pulslaser te gebruiken om driedimensionale biomimetische microfluïdische netwerken te genereren die zijn ingebed in polyethyleenglycol diacrylaat hydrogels met behulp van beeldgestuurde lasergebaseerde degradatie. Een belangrijk voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om driedimensionale biomimetische microfluïdische netwerken te genereren die nauwkeurig de dichtheid, kronkeling, groottebereik en de algehele architectuur van in vivo vasculair weefsel in synthetische constructies nabootsen. Deze microfluïdische fabricagebenadering zal onze capaciteit verbeteren om meer in vivo-achtige weefsel geconstrueerde structuren, biomimetische ziektemodellen en ultrahoge dichtheidsapparaten op een chip te genereren.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de juiste opstelling en implementatie van de microscoopsoftware niet intuïtief is, maar cruciaal is bij het vormen van de gewenste microfluïdische netwerken. Veel van de voorbereidende stappen worden behandeld in het tekstprotocol, inclusief het genereren van de virtuele maskers, het configureren van de microscoop en het uploaden van de virtuele maskers naar de microscoopsoftware. Om het PEGDA-hydrogel te fotopolymeriseren, bevestigt u eerst een ring van dubbelzijdig plakband aan een 60 millimeter petrischaal met een 20 millimeter gat in de bodem.
Vervolgens, in een afzuigkap, voegt u één milliliter HBS met TEOA toe aan een met folie bedekt twee milliliter amberkleurig centrifugeerbuisje. Voeg dan 10 microliter van één millimolair Eosin Y dinatriumzout toe aan het buisje. Pipetteer nu een klein volume NVP in een glazen beker met een glazen pipet.
Neem uit dit volume 3,5 microliter NVP en breng het over in het mengsel. Voeg vervolgens 10 milligram 3,4 kilodalton PEGDA toe aan een tweede met folie bedekte buis. Voeg dan 0,2 milliliter van het mengsel toe om een 5% gewicht per volume PEGDA-prepolymeeroplossing te maken.
Vorm nu de prepolymeeroplossing door te wervelen totdat het PEGDA volledig is opgelost. Pipetteer vervolgens 60 microliter op een PDMS-mal zonder luchtbellen te introduceren. Plaats nu een geacrylerd 40 millimeter nummer 1,5 glasdeksel gecentreerd boven de oplossing op de PDMS-afstandhouders.
Plaats vervolgens de montage onder een witte lichtbron gekalibreerd om 95 milliwatt te leveren. Laat het polymeer drie minuten uitharden. Stroom vervolgens gedestilleerd water tussen de mal en het deksel om het hydrogel van de PDMS te scheiden en spoel het hydrogel af.
Dek dan voorzichtig de randen van het deksel droog zonder water uit het hydrogel te wikkelen. Bevestig nu het deksel aan de voorbereide petrischaal. Een beetje druk helpt.
Dompel vervolgens het hydrogel in gedestilleerd water. Stel de laserscanningconfocale microscoop in zoals beschreven in het tekstprotocol en start in de hydrogel visualisatie configuratie. Pas vervolgens het hydrogel en de petrischaal aan op de stage insert en plaats het op de stage.
Vul vervolgens de petrischaal met minimaal vijf milliliter gedestilleerd water en laat het wateronderdompeling objectief net boven het hydrogel zakken zonder contact met het hydrogel te maken. Klik nu op live om de argonlaserlijn aan te zetten. Focus vervolgens op het hydrogel totdat het Eosin Y signaal aan de bovenzijde van het hydrogel zichtbaar is.
Om het hydrogel te helpen vinden, probeer tijdelijk het procentvermogen of de pinaalgrootte te verhogen. Markeer de locaties van de boven- en onderkant van het hydrogel en van de onderkant van de put. Gebruik vervolgens de joystick om transversaal te bewegen en de randen van de put te vinden.
In het focusvenster laat u het focusvlak 150 micron naar binnen in het hydrogel zakken met behulp van de neerwaartse pijl naast het Z-positievakje. De volgende stap is cruciaal. Zero de X en Y locatie in het stagevenster, verwijder vervolgens alle andere gemarkeerde locaties en markeer alleen de zeroed locatie.
Nu, om het proces van het vormen van een inlaatkanaal te starten, maakt u eerst een foto en gebruik vervolgens de rechthoekknop in het regioenvenster om het gebied dat de inlaat naar het vasculaire netwerk zal zijn, te omlijnen. Ga vervolgens naar de kanaalvormingsconfiguratie. Details worden gegeven in het tekstprotocol.
Eenmaal daar, klikt u in een Z-stack venster op de middelste knoppen aan de bovenkant en boven offset om de Z-stack op de huidige positie te centreren. Stel vervolgens, afhankelijk van hoe groot de inlaat moet zijn, het aantal plakjes in met een interval van één. Controleer nu of de snelheid op drie staat en dat het procentvermogen op 100 staat.
Ga vervolgens door met het opslaan van de configuratie en klik op de knop experiment starten. Om het hydrogel te visualiseren tijdens de degradatie van het kanaal, verhoogt u het versterkingsmeester in het kanalenvenster als het gebied in het gezichtsveld zwart is, of verlaagt u het versterkingsmeester als het gebied wit is. Zorg er na de degradatie voor dat de inlaat is gevormd door terug te gaan naar de hydrogel visualisatie configuratie en op live te klikken.
Laad eerst onder het regioenvenster een willekeurig ovl-bestand van de Z-stack van virtuele maskers en klik op de pijlknop om de ROI's in het gezichtsveld te zien. Klik vervolgens op live om de hydrogel visualisatie configuratie te scannen en gebruik de joystick of het stagevenster om het hydrogel te positioneren zodat de inlaat verbindt met de juiste locatie binnen het vasculaire netwerk. Laat vervolgens het focusvlak zakken naar de eerste positie in de microscoop macro die 50 micron lager is dan de vorige gecentreerde Z-locatie met behulp van de stapgrootte in het focusvenster en klik op de neerwaartse pijl.
Het is weer cruciaal om nu de X en Y locaties opnieuw te zeroen, alle andere gemarkeerde locaties te verwijderen en alleen deze locatie als het nieuwe nulpunt te markeren. Zorg ervoor dat u deze nieuwe configuratie opslaat. Selecteer nu onder de kanaalvormingsconfiguratie alleen de tijdreeks en verblekingsvensters.
Open vervolgens de macro en selecteer het
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van beeldgestuurde, lasergebaseerde hydrogeldegradatie om biomimetische microfluïdische netwerken van vasculaire oorsprong te creëren in PEGDA-hydrogelen. Deze techniek is erop gericht om weefselengineering, in vitro ziekte-modellering en de ontwikkeling van geavanceerde on-a-chip-apparaten te verbeteren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biomaterialen
- Tissue Engineering
Achtergrond
- Microfluïdische netwerken kunnen de in vivo vasculatuur nabootsen.
- PEGDA-hydrogels worden veelvuldig gebruikt in tissue engineering.
- Beeldgestuurde technieken verbeteren de precisie van microfluïdische fabricage.
- Confocale microscopie is essentieel voor het visualiseren van hydrogelstructuren.
Doel van de studie
- Om biomimetische microfluïdische netwerken te vervaardigen die de vasculaire architectuur nabootsen.
- Om de ontwikkeling van weefselengineered constructen verder te brengen.
- Om in vitro-modellen te creëren voor het bestuderen van ziekten.
Gebruikte methoden
- Confocale microscopie met femtoseconden-puls laser voor hydrogelafbraak.
- Bereiding van PEGDA-hydrogel en fotopolymerisatie.
- Configuratie van microscopesoftware voor nauwkeurige beeldvorming.
- Vorming van vasculaire netwerken door gecontroleerde afbraak.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle creatie van driedimensionale microfluïdische netwerken.
- Nauwkeurige replicatie van vasculaire dichtheid en architectuur.
- Aantoonbaar potentieel voor verbeterde toepassingen in tissue engineering.
- Visuele ondersteuning verbeterde de opzet en uitvoering van het protocol.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het vervaardigen van biomimetische structuren.
- Beeldgestuurde technieken zijn essentieel voor het bereiken van de gewenste resultaten.
- Dit protocol kan bijdragen aan vorderingen in ziekte modellering en on-chip apparaten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dit protocol maakt de fabricage mogelijk van biomimetische microfluïdische netwerken die de in vivo vasculaire architectuur repliceren, wat zorgt voor een nauwkeurigere in vitro modellering van farmacokinetiek van geneesmiddelen en ziektemechanismen. Door vasculaire dichtheid, tortuositeit en architectuur na te bootsen in synthetische constructen, bevordert dit de ontwikkeling van human-on-a-chip-platforms voor preklinisch testen. De beeldgestuurde, lasergebaseerde aanpak verhoogt de voorspellende zekerheid bij target-validatie en lead-identificatie door fysiologisch relevante fluïdische omgevingen te bieden voor compound-screening en mechanistische studies.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken binnen vasculair-mimetische omgevingen die in vivo hemodynamiek en massatransport nabootsen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door de effecten van verbindingen onder fysiologisch relevante stroomcondities waarneembaar te maken.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetengagement en padmodulatie door mechanistische ambiguïteit in statische cultuursystemen te verminderen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare microfluïdische platforms voor kwantitatieve beoordeling van verbindingpermeabiliteit, diffusie en cellulaire respons onder gecontroleerde stroming.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare preparatie van vasculaire netwerken mogelijk voor high-content screening-toepassingen in drug discovery-pipelines.
- Assay-gereedheid: Faciliteert hergebruik van het platform over meerdere campagnes door middel van stabiele, beeldgestuurde fabricage van complexe 3D vasculaire architecturen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische stadia door ziekterelateerde microfluidische systemen te genereren die menselijke vasculaire netwerken nabootsen voor farmacokinetische en farmacodynamische profilering.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de identificatie en validatie van translationele biomarkers via real-time imaging van fluorescerende tracers en bead-transport onder druk- of pompgestuurde stroming.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door mechanistische risicoreductie van vasculair gerichte therapieën mogelijk te maken in mensachtige microweefselconstructen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, en biedt een herbruikbare capaciteit voor het genereren van vasculair-mimetische omgevingen die de fysiologische relevantie in alle stadia verhogen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door real-time observatie van biologische processen binnen 3D vasculaire netwerken onder stroming mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare microfluïdische systemen met gestandaardiseerde geometrie en reproduceerbare degradatiepatronen voor betrouwbare screening van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve read-outs via fluorescent dextraan en bead-tracking om stroomdynamiek, permeabiliteit en cellulair transport onder gecontroleerde condities te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische validatie door de menselijke vasculaire architectuur te repliceren voor een verbeterde voorspelling van het in vivo gedrag van geneesmiddelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een configureerbare, beeldgestuurde fabricageworkflow die aanpasbaar is aan diverse vasculaire modellen en experimentele ontwerpen over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door fysiologisch relevante fluïdische omgevingen die het aantal fout-positieven bij targetvalidatie verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via beeldgestuurde lasercontrole en fabricage op basis van virtuele maskers.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van vasculair gerichte kandidaten mogelijk te maken, waardoor falen in een late fase wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door gegevens te verschaffen over het gedrag van verbindingen in mensachtige microfluïdische systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, lasersafety en hydrogel-fotochemie voor een succesvolle installatie en uitvoering.
- Afhankelijk van een laser-scanning confocale microscoop met femtoseconde-pulsvermogen en compatibele software voor macro-gebaseerde aansturing.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de generatie van virtuele maskers en de microscoopconfiguratie voor een reproduceerbare fabricage van het netwerk.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van het protocol op verschillende hydrogelformuleringen of vasculaire templates.
- Beperkt door de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van laservermogen, golflengte en scansnelheid op basis van de hydrogelsamenstelling en degradatiedrempels.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Preparation and Photopolymerization of a PEGDA Hydrogel
3:23
Preparing a Hydrogel for Microfluidic Network Formation via Laser-based Degradation
6:25
Generating and Visualizing the Microfluidic Network
8:40
Results: Comparing Fabricated Networks with Their In Vivo Counterparts and Initiating Fluid Flow
10:05
Conclusion
