Name: Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer hoe je met beeldgeleide laserdegradatie biomimetische microfluïdische netwerken fabriceert in PEGDA-hydrogels. Deze techniek bootst vasculaire architectuur nauwkeurig na voor weefselengineering en ziekteonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dr. Jeff Caplan en de heer Michael Moore in het Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center voor hun ondersteuning met confocale microscopie. Toegang tot microscoopapparatuur werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) gedeelde instrumentatie subsidies (S10 RR0272773 en S10 OD016361) en het State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Institutional Development Award (IDeA) van het NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), de American Cancer Society (14-251-07-IRG), de University of Delaware Research Foundation (14A00778), het Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), en de NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).

<ol><li>Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+rules+for+diffusive+drug+delivery+in+tumor+and+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).</li>
<li>Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+tissues+on+a+chip+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Biomimetic tissues on a chip for drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).</li>
<li>Jeon, J. S., Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).</li>
<li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2016).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Self-Assembled+Microvascular+Networks+with+Microfabricated+PEG-Based+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).</li>
<li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Biomimetic+Patterning+in+Hydrogels+to+Guide+Cellular+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization.</a> Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13 (8), 1489(2013).</li>
<li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Hydrogels+with+Immobilized+EphrinA1+for+Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li>
<li>Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-demanded+release+of+VEGF+from+synthetic%2C+biointeractive+cell-ingrowth+matrices+for+vascularized+tissue+growth%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth.</a> FASEB J. , (2003).</li>
<li>He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+assembly+of+3D+perfusable+microfluidic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).</li>
<li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).</li>
<li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omnidirectional+Printing+of+3D+Microvascular+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks.</a> Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).</li>
<li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Bioprinting+of+Vascularized%2C+Heterogeneous+Cell-Laden+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs.</a> Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).</li>
<li>Dawson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+laws+for+capillary+vessels+of+mammals+at+rest+and+in+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Long.+%5BBiol.%5D%22%5BJournal%5D)">Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise.</a> Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).</li>
<li>Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li>
<li>Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Photoablation+of+Guidance+Microchannels+into+Hydrogels+Directs+Cell+Growth+in+Three+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions.</a> Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).</li>
<li>Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).</li>
<li>Applegate, M. B., Coburn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-based+three-dimensional+multiscale+micropatterning+of+biocompatible+hydrogels+for+customized+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).</li>
<li>Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-generated+microtracks+in+3D+collagen+lattices%3A+principles+of+MMP-dependent+and+-independent+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PB%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion.</a> PB. 8 (2), (2011).</li>
<li>Naik, P., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Blood-Brain+Barrier+Models%3A+Current+and+Perspective+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies.</a> J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).</li>
<li>Choe, Y., Mayerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+Preparation%2C+Imaging%2C+and+Analysis+Protocols+for+Knife-edge+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy.</a> JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+transmission+imaging+of+microvascular+networks+using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM.</a> Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).</li>
<li>Chung, J. R., Sung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Exploration+of+Mouse+Brain+Microstructures+Using+the+Knife-Edge+Scanning+Microscope+Brain+Atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas.</a> Front. Neuroinform. 5, (2011).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).</li>
<li>Slater, J. H., Culver, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived%2C+Biomimetic+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li>
<li>Slater, J. H., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Multifaceted%2C+Micropatterned+Surfaces+and+Image-Guided+Patterning+Using+Laser+Scanning+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography.</a> Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).</li>
<li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).</li>
<li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically-tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+Hydrogels+for+Dynamic+Tuning+of+Physical+and+Chemical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+two-photon+photodegradation+of+PEG+hydrogels+to+study+and+manipulate+subcellular+interactions+on+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials.</a> Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cruciaal dwingende standaardfuncties van de microscoop software om het gebruik van virtuele maskers voor beeldgeleide, laser gebaseerde afbraak schakelen, moet de microscoop macro worden ingesteld en zorgvuldig gemanipuleerd. Hoe de microscoop software-interfaces met de microscoop macro kan soms contra-intuïtief, en veel moeite geïnvesteerd in het bepalen van de optimale instellingen in beide programma&#39;s om deze methode te ontwikkelen. Een algemene basiskennis van laser scanning confocale microscoop gebruikt, vooral in verband met de &quot;Fase&quot; en &quot;Focus&quot; vensters voor het vinden en correct positioneren van de hydrogel in de x, y en z dimensies, voordat laser gebaseerde afbraak. Bovendien is de vervaardiging van een inlaatkanaal is van cruciaal belang om het protocol; gesuspendeerd fluorescerende species moet kunnen de microfluïdische systemen invoeren voor succesvolle beeldvorming en karakterisatie netwerk. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol van toepassing is op een bepaalde laser-scanning confocale microscoop geconfigureerd met een specifiek femtoseconde gepulste laser, hardlopen specifieke versies van de microscoop software en de microscoop macro (zie details in de lijst van specifieke materialen / Equipment). We hebben ontdekt dat nieuwere versies van de microscoop macro niet over de nodige controle en de functionaliteit die nodig is voor beeldgeleide laser controle. Terwijl andere platforms microscoop en gepulste laserbronnen worden gebruikt, dit protocol zijn specifiek voor dit systeem en moeten gewijzigd worden afhankelijk van het platform, laserbron en software geïmplementeerd. De uitgangspunten in dit protocol nog steeds van toepassing, echter. Een mogelijke wijziging van dit protocol omvat het veranderen van de hydrogelsamenstelling. Hier, benut we 5 gew%, 3,4 kDa PEGDA hydrogels, maar op laser gebaseerde afbraak (voor doeleinden afgezien van microfluïdische netwerk generatie) is ingevoerd om zowel synthetische en natuurlijke hydrogels, met inbegrip van gePEGyleerd fibrine af te brekenOgen 21,22, zijde eiwit hydrogels 23, en collageen 24. Aanpassing van het laservermogen, scansnelheid, afstand tussen Z-segmenten, en het aantal herhalingen helpt bij het bepalen van de optimale parameters microfluïdische netwerken in andere hydrogelformuleringen fabriceren. Een stroombegrenzing van de techniek is de totale hoeveelheid hydrogel die kan worden afgebroken in een mogelijke tijd. Open holten of microfluïdische functies binnen de hydrogel te creëren, de laser verblijftijd moet op of boven de 8.96 ps / pixel (of een laser scan snelheid van 0,021 micrometer / ps) bij gebruik van een laser Fluence van 37,7 nJ / um 2. Met deze instelling duurt 1,4 h tot schepen binnen 0,014 mm 3 volume degraderen (zoals gezien in figuur 1). Met behulp van een laser verblijftijd van 4,48 ps / pixel of onder het afgegeven energie is niet genoeg voor een volledige afbraak van de hydrogel formulering hier gebruikt. Het implementeren van een ander hydrogelsamenstelling kan deze beperking te overwinnen. Het gebruik van fotolabiele gels die lichtgevoelige componenten 34-36 of hydrogels die grote multiphoton dwarsdoorsneden 21-24 gaat met een goede opties die het gebruik van minder energie mogelijk wordt en resulteren in een snellere afbraak. Wat dimensionele beperkingen zijn functies gefabriceerd tot 1,5 mm diep in de hydrogel 7. De diepte haalbaar is een functie van de werkafstand van het doel en kan worden verhoogd met behulp van ultra-lange werkafstand doelstellingen geoptimaliseerd voor in vivo beeldvorming. De kleinste gemeten kanaal 7 gemaakt met een 20X (NA1.0) doelstelling waterdompel had een breedte van 3,3 urn en de diepte van 8,9 urn, die op een lijn met de grootte van de kleinste kanalen gegenereerd in figuur 1. Terwijl andere labs lagere NA doelstellingen 21,23,24 hebben gebruikt, verwachten we dat microfluïdische netwerken met kleinere functies kunnen worden gegenereerd met behulp van hogedoelstellingen er NA ten koste van een verminderde werkafstand. Uiteindelijk vereist het oplossen van de techniek is een functie van de puntspreidingsfunctie van de gefocusseerde laserbundel, de laser scanning eigenschappen, de hoeveelheid energie die de laser geleverde, en de laser absorptie-eigenschappen van het materiaal dat wordt afgebroken. Voorts laser eigenschappen (snelheid, fluentie, afstand tussen de virtuele maskers en aantal herhalingen) worden geoptimaliseerd op basis van hydrogel eigenschappen (verknopingsdichtheid macromeer / monomeer molecuulgewicht gewichtsprocent en type hydrogel: eiwit gebaseerde synthetische vs. ), omdat deze inherent veranderen interacties met de laser en daarmee de uiteindelijke uitkomst van het proces. De geleverde energie ook beïnvloed door het doel gebruikt, is extra optimalisatie nodig bij het schakelen tussen doelstellingen. Met betrekking tot de kosten, is toegang tot een microscoop met een gepulste laser vereist, en hoewel veel verschillende bezwaarlingen kan worden gebruikt, die met een hoge NA en lange werkafstand (in vivo beeldvorming) kan duur zijn. Boven en buiten het protocol hier beschreven, kan microfluïdische netwerken gegenereerd met behulp van deze techniek ook worden gefunctionaliseerd met cell-lijm peptiden post-channel fabricage om endotheelcellen adhesie en vorming van lumen 7 induceren. Bovendien kan de opname van cel-afbreekbare peptidesequenties in het bulkmateriaal 9 vóór degradatie kanaal kunnen worden bestudeerd van celmigratie in en door de hydrogel. Voor continue fluïdisatie van de microfluïdische netwerk binnen de hydrogel, hydrogels kunnen worden gefotopolymeriseerd in grotere fluïduminrichtingen of huizen, zoals blijkt uit figuren 2 en 3 7. Het genereren van vasculaire netwerken via vasculaire of angiogene zelfassemblage 8-12 biedt een eenvoudige benadering van de va inducerenscularization gedurende een relatief groot volume hydrogel. Deze aanpak resulteert in perfusable vloeibare netten is moeilijk rechtstreeks de grootte, kronkeligheid, dichtheid en algemene netwerkarchitectuur regelen. Door deze beperking kan het stromingsprofiel en afschuifsnelheden in de vasculatuur verschillen experimenten. Als alternatief microfabrication technieken 13-16 zorgen voor directe controle over het netwerk van architectuur, maar zijn vaak beperkt door hun onvermogen om kleine, capillaire-sized kanalen of de fabricage van dichte netwerken die na te bootsen in vivo vasculaire architectuur te genereren. Terwijl de laser-gebaseerde hydrogel degradatie techniek hier beschreven is onlangs hergebruikt voor microfluïdische generatie, daar tegelijkertijd overwint zowel de bouwkundige controle en grootte op basis van beperkingen van de bestaande microfabrication methoden doordat de creatie van 3D biomimetische microfluïdische netwerken die de dichtheid, kronkeligheid recapituleren, grootte, en de algehele architecture in vivo vasculatuur. Bovendien kunnen meerdere fluïde netwerken worden opgewekt in een hydrogel, die de studie van inter-netwerktransport 7. Voor tissue engineering-toepassingen die streven naar nauwer repliceren in vivo transportprocessen in vitro, de hoogst vastbesloten-hydrogel ingesloten microfluïdische netwerken die hier geschetst zijn zeer geschikt. We verwachten dat dit protocol bij de ontwikkeling van weefsel constructies zal zijn dat nauwkeuriger na te bootsen in vivo transport voor gebruik als drug discovery-apparaten en in vitro modellen ziekte.

Het vasculaire systeem, bestaande uit zowel lymfatische en hart en vaten, vormen zeer dichte netwerken die essentieel zijn voor het transport van voedingsstoffen en zuurstof en het verwijderen van metabole afvalstoffen. Dienovereenkomstig, cellen die in gevasculariseerde weefsels zijn nooit meer dan 50-100 urn uit de buurt van een vat 1. Het vermogen om in vivo vasculaire architectuur reproduceren vitro kritisch nauwkeurig modelleren vivo transportprocessen via gemanipuleerde constructen. Met een recente aandrijving van organen-on-a-chip-inrichtingen 2 voor high-throughput drug screening 3,4 en 5,6 ziektemodel ontwikkelen methoden microfluïdische netwerken die in vivo-achtige vervoer in synthetische of natuurlijke hydrogels herhalen tekent creëren significant belang. Om de biomimicry van microweefsels gebruikt in deze apparaten te verbeteren, ontwikkelden we een beeldgeleide, op laser gebaseerde hydrogel degradatie methode die drie-dimensiona gebruikimage l (3D) stapels van inheemse vaatstelsel als templates to-vasculaire afgeleide microfluïdische netwerken ingebed in PEGDA hydrogels 7 genereren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een commercieel verkrijgbare laser-scanning confocale microscoop voorzien van een femtoseconde gepulste laser-vasculaire afgeleide biomimetische microfluïdische netwerken PEGDA hydrogelen fabriceren via beeldgeleide, op laser gebaseerde afbraak. De huidige aanpak van hydrogels fluïdiseren omvatten de inductie van vasculaire of angiogene 8-10 10-12 endotheliale cellen zelf-assemblage en microfabrication technieken om vooraf gedefinieerde kanalen te creëren voor endothelialisatie 13-16. Terwijl zelf-geassembleerde netwerken recapituleren de dichtheid en complexe architectuur van microvasculatuur, ze vaak meer doorlaatbaar dan in vivo netwerken 11,17,18, die problematisch modellering vervoer medicijnscreeningtoepassingen zijn. Zelf-assemblerende netwerken bestaan ​​uit Physiologtisch relevante, capillaire afmetingen schepen, maar moeilijk te integreren in bulk vloeistofstroom als gevolg van beperkingen in het genereren arteriole groter formaat schepen. Aangezien er geen directe controle over het samenstel van deze netwerken, kan de uiteindelijke architectuur van monster tot monster, waardoor het moeilijk herhaaldelijk produceren netwerken met dezelfde fluïdumstroom en transporteigenschappen. 3D, hydrogel geïntegreerde microfluïdische netwerken herhaalbare geometrie en goed gedefinieerde architectuur genereren een aantal microfabricage technieken ontwikkeld, zoals modulaire opbouw 13, 3D-printen opofferingskolommen materialen 16, direct-write assemblage 14 en omnidirectionele printen 15. Het toepassen van deze methoden, microfluïdische architectuur, en dus stroming en transport eigenschappen, kan herhaaldelijk worden vervaardigd in vele constructies. Een belangrijke beperking van deze benadering is echter het onvermogen om microf creërenluidic netwerken met capillaire afmetingen functies, 4-10 urn 19. Meest microproductietechnieken vaak beperkt tot functies variërend 150-650 urn diameter 13,16. Sommige bestaande technieken kunnen genereren hiërarchische netwerken kanalen in uiteenlopende diameter, 10 tot 300 urn voor direct-write samenstel 14, en 18 tot 600 pm voor omnidirectionele afdrukken 15, maar ze zijn beperkt in hun vermogen om dichte netwerken of genereren meerdere microfluïdische netwerk dicht produceren in een enkel construct 7. Sommige van deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een beeldgeleide, lasergebaseerde hydrogeldegradatie techniek die reproduceerbare vervaardiging van biomimetische, hiërarchische microfluïdische netwerk dat de architectuur van in vivo microvasculatuur recapituleren toelaat. Om dit te doen, een 790 nm, 140 femtoseconde (fs) gepulste laser die werkt bij 80 MHz-raster gescand in 3D gewenste locaties binnen een hydrogel zoals gedefinieerd beeldvorming in vivo vasculatuur. We speculeren dat het afbraakproces werkt door de laser geïnduceerde optische verdeling van water, het verkregen plasma formatie, de daaropvolgende snelle thermo-elastische uitzetting van water en de plaatselijke afbraak van de hydrogel zoals water uitzet 20. Dit mechanisme verschilt enigszins van laser gebaseerde afbraak van eiwit gebaseerde hydrogels 21-24. Unlike PEGDA, die een lage multifoton dwarsdoorsnede, eiwitten vaak een grote multifoton dwarsdoorsnede en daarom afgebroken via een multifoton absorptie geïnduceerde chemische breuk 23. Om beeldgeleide microfluïdische netwerken te genereren, wordt de laser sluiter gecontroleerd door-afbeelding op basis virtuele maskers, die bestaan uit een mozaïek van regio&#39;s van belang 9 dat de microfluïdische architectuur te definiëren. Met deze aanpak, hebben we de mogelijkheid om 3D-afgeleide vasculaire biomimetische Microfluïdieksysteem fabriceren aangetoondic netwerken, die de dichte kronkelige architectuur van in vivo vasculatuur recapituleren, om lokaal te bedienen de porositeit van hydrogelen door het veranderen van de hoeveelheid energie geleverd tijdens afbraak. We zijn ook in staat om twee onafhankelijke microfluïdische netwerken die met elkaar vervlochten in de nabijheid (15 pm), maar nooit rechtstreeks aansluiten 7 genereren geweest. We hebben ook aangetoond dat het vermogen om laser-aangetaste microkanalen endothelialize door post afbraak functionalisering met integrine ligatie peptidesequentie, Arginine-Glycine-Asparaginezuur-Serine (RGDS), endotheliale cel adhesie en vorming van lumen 7 bevorderen. Met dit protocol, is het genereren van complexe microfluïdische netwerken in PEGDA hydrogels mogelijk gemaakt via beeldgeleide, op laser gebaseerde degradatie met behulp van een commercieel verkrijgbare microscoop toegankelijk op veel universiteitscampussen. Als de afbraak wordt gestuurd door digitale, virtuele maskers, dit fabricatietechniek is vatbaar voor de creatieve vormgeving van microfluïdische netwerk, waardoor het gebruik ervan in diverse toepassingen. We verwachten dat de hier beschreven werkwijze voordeligst ontwerpen biomimetische lijke en menselijke-on-a-chip apparaten kan repliceren biologische transportprocessen belang modelleren geneesmiddeltransport 2 is. Deze fabricagetechniek kan ook van belang voor het genereren van in vitro ziektemodellen, zoals kanker metastase 5,6 en bloed-hersenbarrière modellen 25 zijn. As-laser gebaseerde hydrogel degradatie is eerder gebruikt om tracks voor de begeleiding van neuronale uitgroei 21-23 te creëren, kan de beeldgeleide uitbreiding van deze techniek nuttig blijken in geavanceerde tissue engineering strategieën aan cellen in door de gebruiker gedefinieerde 3D ruimtelijke regelingen te positioneren.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>genoemd "programmeersoftware" in het protocol; raadpleeg bron 9 voor details over het algoritme</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td><td>NIH</td><td>versie 1.51a</td><td>genoemd "beeldverwerkingssoftware" in het protocol</td></tr><tr><td>LSM 780 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>genoemd "laser-scanning confocal microscope" in het protocol; voor laser-gebaseerde hydrogeldegradatie</td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>release versie 6.0</td><td>genoemd "microscoopsoftware" in het protocol; voor gebruik op Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>genoemd "microscoop macro" in het protocol; voor gebruik op Zeiss LSM-780 (in combinatie met Zen)</td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>voor gebruik op Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>genoemd "krachtige gepulseerde laser" in het protocol</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>ontbrandbaar; irriterend voor huid en ogen; werken met in een afzuigpunkt</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 &micro;m PES Membrane</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>gesynthetiseerd in huis</td><td></td><td>raadpleeg bron 33 voor synthesemethoden; bewaar onder argon</td></tr><tr><td>Eosin Y disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>bewaar onder argon; kankerverwekkend; werken met in een afzuigpunkt</td></tr><tr><td>3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>ondersteuning voor het hanteren van dubbel gecoate tape</td></tr><tr><td>Model SC Plotter (adhesive cutter)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>gebruikt om lijm in ringvormige vormen te snijden om deksels te verbinden met petrischalen</td></tr><tr><td>60 mm Petri Dish with 20 mm Hole</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>High Intensity Illuminator (white light source)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>Power Meter</td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>detecteer vermogen bij 524 nm bij gebruik van witte lichtbron</td></tr><tr><td>Slim Profile Wand Detector</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>voor gebruik met vermogensmeter</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>gebruikt om PDMS mallen te maken; raadpleeg bron 7 voor methoden</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionele #1.5 Coverslips, 40 mm Rond</td><td>gesynthetiseerd in huis</td><td></td><td>raadpleeg bron 7 voor methoden</td></tr><tr><td>Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>kan alternatieve getaggede dextrans gebruiken; 2,000 kDa diffundeert niet gemakkelijk in een 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel</td></tr><tr><td>1 mL Syringe, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &micro;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI0.4&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>microfluïdische apparaten die kunnen worden gebruikt om hydrogels te huisvesten</td></tr></tbody></table>

beeldgeleide, laser-gebaseerde fabrication of vascular-afgeleide microfluïdische networks

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Deze gedetailleerde protocol beschrijft de uitvoering van beeldgeleide, laser gebaseerde hydrogeldegradatie voor de vervaardiging van vasculaire afgeleide microfluïdische netwerk ingebed in PEGDA hydrogels. Hier beschrijven we de creatie van virtuele maskers die het mogelijk maken voor beeldgeleide laser controle; de fotopolymerisatie van een micromolded PEGDA hydrogel, geschikt voor microfluïdische netwerk fabricage en druk-head gedreven stroom; de installatie en het gebruik van een commercieel beschikbare laser scanning confocale microscoop gekoppeld aan een femtoseconde gepulste Ti: S laser om hydrogel degradatie te induceren; en de beeldvorming van gefabriceerde microfluïdische netwerken met fluorescerende soorten en confocale microscopie. Een groot deel van het protocol is gericht op de juiste instelling en uitvoering van de microscoop software en microscoop macro, omdat deze zijn cruciale stappen in het gebruik van een commercieel microscoop voor microfluïdische fabricage doeleinden die een aantal fijne kneepjes bevatten. De beeldgeleide onderdeel van deze technique voor de implementatie van 3D afbeeldingsstapels of door de gebruiker gegenereerde 3D-modellen, waardoor creatieve microfluidic ontwerp en de fabricage van complexe microfluïdische systemen vrijwel elke configuratie. Met een verwachte impact in tissue engineering, kunnen de in dit protocol methoden helpen bij de fabricage van geavanceerde biomimetische microtissue constructies voor organisaties en human-on-a-chip apparaten. Door het nabootsen van de complexe architectuur, kronkeligheid, grootte en dichtheid van bloedvaten in vivo, kunnen essentiële biologische transportprocessen worden gerepliceerd in deze constructen, waardoor nauwkeuriger vitro modelleren van farmacokinetiek en drug.

Om de uitvoering van beeldgeleide, op laser gebaseerde hydrogel degradatie te tonen om een 3D, vasculaire-afgeleide microfluïdische netwerk te genereren, benut we een 3D-beeld stapel muizenhersenen vasculatuur die via messcherpe scanning microscopie (KESM) 26, 27 werd overgenomen . Een geselecteerde 3D gebied van de grotere dataset microvasculaire omgezet in een reeks virtuele maskers voor beeldgeleide vorming microfluïdische netwerk, zoals hierboven beschreven. Na vervaardiging werd de resulterende microfluïdische netwerk geperfuseerd met een oplossing van FITC-gelabeld, 2000 kDa dextran en afgebeeld via confocale microscopie. De afbeeldingsstapel van de in vivo vaatstelsel dat de netwerkarchitectuur (Figuur 1 A en C) en de gefabriceerde microfluïdische netwerk (Figuur 1B en D) gedefinieerd werden gebruikt om Z-uitsteeksels (Figuur 1 A en B) en 3D renderings (figuur 1C genereren en D </strong&gt;). De vergelijking van de beelden blijkt dat beeldgeleide, lasergebaseerde hydrogeldegradatie maakt de fabricage van 3D biomimetische microfluïdische netwerk dat de grootte, kronkelige en complexe architectuur in vivo vasculatuur recapituleren. De techniek is ontvankelijk voor de fabricage van netwerken met uiteenlopende diameters; in Figuur 1, werden kanalen variërend 3,3-28,8 pm in diameter gegenereerd. Merk op dat de grote rechthoekige structuur in de linkerbovenhoek van figuur 1B en in de linker hoek van figuur 1D is het inlaatkanaal om stroming te introduceren in het netwerk. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> Figuur 1: Vasculaire-Afgeleide microfluïdische Network. Een reeks virtuele maskers, afgeleid van een beeld stapel muizenhersenen vasculatuur (A en C), werden gebruikt om fabricate 3D biomimetische microfluïdische netwerk ingebed in een PEGDA hydrogel (B en D) via beeldgeleide, op laser gebaseerde afbraak. De microfluïdische netwerk werd geperfuseerd met 2000 kDa FITC-gemerkt dextran en afgebeeld via confocale microscopie. Z-uitsteeksels (A en B) en 3D renderings (C en D) van de twee netwerken demonstreren de mogelijkheid om microfluïdische netwerk dat de dichtheid, organisatie en algemene structuur van in vivo vasculatuur recapituleren genereren. De pijl (D) markeert de rechthoekige inlaat leven geroepen om de dextran te introduceren. De schaal balk geeft 50 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> We hebben twee methoden, druk koppen en spuitpompen, om de vloeistof f initiëren geïmplementeerdlaag in deze ingesloten microfluïdische netwerken. Zo werd een 30 30 urn rechthoekig kanaal vervaardigd twee putten in een micromolded PEGDA hydrogel (figuur 2A) verbinden, met vloeistofstroom aangedreven via een drukkop 7. Gegenereerd in zowel de linker, de druk hoofd geïnduceerde stroom door de microkanaal en in de put aan de rechterkant. In figuur 2A, een eerste voor tetramethylrhodamine (TRITC) gemerkt, werd 70 kDa dextran waargenomen bewegen door het kanaal met behulp van time-lapse microscopie. Later, in Figuur 2B, een 10-um diameter fluorescerende polystyreen bol stroomde uit de put links, door het kanaal, naar de put aan de rechterkant. De duur van de volumestroom van het vloeistofvolume in de micromolded goed bij de inlaat en de stroomsnelheid geregeld door de hydrostatische gradiënt gegenereerd tussen de inlaat en uitlaat goed, druk-head aangedreven stroming in micromolded hydrogelen is een eenvoudige werkwijze voor stroming inproductie, zonder dat een externe behuizing of injectiepomp. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> Figuur 2: Pressure-Head Gedreven Flow in een Micromolded PEGDA Hydrogel. PEGDA werd micromolded een hydrogel die twee putjes verbonden door een ingebedde microkanaal vormen. Een druk hoofd werd gegenereerd in de put links naar stroom van initiëren TRITC-label, 70 kDa dextran (A1-A3) en een 10-um polystyreen bol (B1-B3) door middel van een 30 bij 30 micrometer rechthoekig kanaal van de ene goed aan de andere. De schaal balk geeft 50 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Als alternatief, om een ​​constante vloeistofstroom binnen microfluïdische netwerken genereren, spuit-pomp aangedreven flaag kan worden geïnitieerd door het fotopolymeriseren hydrogel binnenkant van een secundaire microfluïdische apparaat met inlaat- en uitlaatpoorten voor spuitpomp interfacing. In figuur 3A, wordt een commercieel verkrijgbare, geprefabriceerde microfluïdische apparaat getoond met een 1-mm band hydrogel gefotopolymeriseerd over de breedte van de inrichting 7. Laser gebaseerde degradatie werd uitgevoerd om microfluïdische kanalen en netwerken in gehuisvest hydrogels met hetzelfde protocol hier beschreven voor vrijstaande hydrogels te fabriceren. Injectiespuit-pomp opgewekte stroom kan worden gezien in figuur 3B, waarbij een 20-um diameter cilindrisch kanaal werd vervaardigd in een hydrogel zich in een microfluïdische apparaat. In deze 20-um diameter kanaal worden afzonderlijke 2-micrometer fluorescerende polystyreen bolletjes eenvoudig opgelost zonder fluïdumstroom (Figuur 3B1), terwijl als een 5 ul / s debiet wordt toegepast, de gebieden bewegen door het gezichtsveld, zoals blijkt uit strepen (Figuur 3B2 &lt;/ Strong&gt;). Dezelfde benadering werd gebruikt om stroming door een 2D-afgeleide vasculaire netwerk te induceren tot stroming van TRITC-gelabelde monitoren 65 kDa dextran via het netwerk en diffusie in het omgevende hydrogel (figuur 3C). <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> Figuur 3: Spuit Pump-Driven Flow in PEGDA Hydrogels gepolymeriseerd in microfluïdische behuizingen. Een in de handel verkrijgbaar, geprefabriceerde microfluïdische inrichting (A) met een 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) microkanaal herbergt een gefotopolymeriseerd 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hydrogel aangeduid met de zwarte Pijl. Een 20-um diameter cilindrisch kanaal werd afgebroken door de hydrogel en 2 urn polystyreen bolletjes werden door de inrichting (B) gepompt. De bollen zijn duidelijk opgelost zonder vloeistofstroom (B1), maar ze als stroken bij een debiet van 5 pl / s(B2). In andere ondergebracht hydrogel werd een 2D-afgeleide vasculaire netwerk vervaardigd en TRITC-gelabeld, werd 65 kDa dextran gepompt via het netwerk (C). Time-lapse microscopie werd gebruikt om de fluorescerende dextran toezicht te vulde de kanalen en gediffundeerd in de omringende hydrogel. Witte pijlen in (B) en (C) geven de richting van fluïdumstroming. De kalibratiebalk in (C) geeft de intensiteit van het fluorescerende dextran. De schaalbalken vertegenwoordigen 20 urn (B1) en (B2) en 50 um (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft de implementatie van beeldgestuurde, lasergebaseerde hydrogeldegradatie om vasculair-afgeleide, biomimetische microfluïdische netwerken te fabriceren die zijn ingebed in poly(ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) hydrogels. Deze biomimetische microfluïdische systemen kunnen nuttig zijn voor weefselengineering toepassingen, generatie van in vitro ziektemodellen en fabricage van geavanceerde "on-a-chip" apparaten.

Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Het algemene doel van dit protocol is om te beschrijven hoe een confocale microscoop, uitgerust met een femtoseconde-pulslaser, kan worden gebruikt om driedimensionale, op vaten gebaseerde biomimetische microfluïdische netwerken in polyethyleenglycoldiacrylaat-hydrogels te genereren middels beeldgestuurde lasergebaseerde degradatie. Een significant voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om driedimensionale biomimetische microfluïdische netwerken te creëren die de dichtheid, tortuositeit, groottebereik en algemene architectuur van in vivo vasculatuur in synthetische constructen nauwkeurig nabootsen. Deze microfluïdische fabricagebenadering zal ons vermogen verbeteren om weefselengineered constructen die meer op in vivo lijken, biomimetische ziektegemodellen en ultra-hoge-dichtheid on-a-chip-apparaten te genereren.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de juiste configuratie en implementatie van de microscoopsoftware niet intuïtief is, maar wel cruciaal is voor het vormen van de gewenste microfluïdische netwerken. Veel van de voorbereidende stappen worden in het tekstprotocol behandeld, waaronder het genereren van de virtuele maskers, het configureren van de microscoop en het uploaden van de virtuele maskers naar de microscoopsoftware. Om de PEGDA-hydrogel te fotopolymeriseren, brengt u eerst een ring dubbelzijdige kleefband aan op een petrischaal van 60 millimeter waarin een gat van 20 millimeter uit de bodem is gesneden.Voeg vervolgens, in een zuurkast, één milliliter HBS met TEOA toe aan een met folie afgedekte amberkleurige centrifugebuis van twee milliliter. Voeg daarna 10 microliters van één millimolaire Eosin Y dinatriumzout toe aan de buis. Pipetteer nu met een glazen pipetteerbuis een klein volume NVP in een glazen bekerglas.Neem uit dit volume 3,5 µL NVP en voeg dit toe aan het mengsel. Voeg vervolgens 10 mg PEGDA van 3,4 kDa toe aan een tweede met folie afgedekte buis. Voeg daarna 0,2 mL van het mengsel toe om een 5% gewicht/volume PEGDA-prepolymeeroplossing te maken.Vortex nu de prepolymeeroplossing totdat het PEGDA volledig is opgelost. Pipetteer vervolgens 60 µL op een PDMS-mal zonder bellen te introduceren. Plaats nu een geacryleerd glazen dekglas van 40 mm (nummer 1,5) gecentreerd over de oplossing op de PDMS-afstandhouders.Plaats de assemblage vervolgens onder een witte lichtbron die is gekalibreerd om 95 milliwatt te leveren. Hard het polymeer drie minuten uit. Laat daarna gedestilleerd water tussen de mal en het dekglas stromen om de hydrogel van de PDMS te scheiden en spoel de hydrogel weg.Dep vervolgens voorzichtig de randen vanHet dekglas droog, zonder water uit de hydrogel te trekken. Plak het dekglas nu vast op de voorbereide petrischaal. Een beetje druk helpt hierbij.Dompel de hydrogel vervolgens onder in gedestilleerd water. Stel de laser scanning confocale microscoop in zoals beschreven in het tekstprotocol en start in de configuratie voor hydrogelvisualisatie. Bevestig vervolgens de hydrogel en de petrischaal in de objecttaalhouder en plaats deze op de objecttafel.Vul vervolgens de petrischaal met ten minste vijf milliliters gedestilleerd water en laat het water-immersieobjectief zakken tot net boven de hydrogel, zonder deze te raken. Klik nu op 'live' om de argonlaserlijn aan te zetten. Stel vervolgens scherp op de hydrogel totdat het Eosin Y-signaal aan de bovenzijde van de hydrogel zichtbaar is.Om de hydrogel gemakkelijker te vinden, kan men proberen het wattage of de pinhole-grootte tijdelijk te verhogen. Markeer de posities van de boven- en onderkant van de hydrogel, en de bodem van de well. Gebruik vervolgens de joystick om transversaal te bewegen en de randen van de well te lokaliseren.Verlaag in het focusvenster het focusvlak met 150 microns binnen de hydrogel met behulp van de pijl naar beneden naast het vak voor de Z-positie. De volgende stap is cruciaal. Stel de X- en Y-locatie in het stagevenster in op nul, verwijder vervolgens alle andere gemarkeerde locaties en markeer alleen de locatie die op nul is ingesteld.Om nu het proces voor het vormen van een inlaatkanaal te starten, maakt u eerst een afbeelding en omlijnt u vervolgens met de rechthoekknop in het regiovenster het gebied dat de inlaat van het vasculaire netwerk zal worden. Ga daarna naar de configuratie voor kanaalvorming. Details hiervan worden in het tekstprotocol beschreven.Zodra u daar bent, klikt u in een Z-stackvenster op de centrale knoppen bovenaan en boven 'offset' om de Z-stack op de huidige positie te centreren. Stel vervolgens, afhankelijk van de gewenste grootte van de opening, het aantal doorsneden in met een interval van één. Controleer nu of de snelheid op drie staat en of het vermogenspercentage op 100% is ingesteld.Sla vervolgens de configuratie op en klik op de knop om het experiment te starten. Om de hydrogel tijdens de degradatie van het kanaal te visualiseren, verhoogt u de gain master in het kanalenvenster als het gebied in het gezichtsveld zwart is, of verlaagt u de gain master als het gebied wit is. Controleer na de degradatie of de inlaat is gevormd door terug te gaan naar de configuratie voor hydrogelvisualisatie en op live te klikken.Laad eerst, onder het venster 'regio's', een willekeurig ovl-bestand uit de Z-stack van virtuele maskers en klik op de pijlknop om de ROI's in het gezichtsveld te bekijken. Klik vervolgens op 'live' om de configuratie van de hydrogelvisualisatie te scannen en gebruik de joystick of het venster 'tafel' om de hydrogel zo te positioneren dat de inlaat verbonden is met de juiste locatie binnen het vasculaire netwerk. Verlaag daarna het brandvlak naar de eerste positie in de microscoopmacro, die 50 microns lager ligt dan de vorige gecentreerde Z-locatie, door gebruik te maken van de stapgrootte in het venster 'focus' en op de pijl naar beneden te klikken.Het is nu opnieuw cruciaal om de X- en Y-locaties te nulstellen, alle andere gemarkeerde locaties te verwijderen en alleen deze locatie als het nieuwe nulpunt te markeren. Zorg ervoor dat u deze nieuwe configuratie opslaat. Selecteer nu, onder de configuratie voor kanaalvorming, alleen de tijdserie- en bleachingvensters.Open vervolgens de macro en selecteer het tabblad voor opslaan. Selecteer het eerder gemaakte recept en klik op toepassen. Zorg ervoor dat u niet op opslaan klikt, anders wordt het recept overschreven.Sla na het controleren van de instellingen de configuratie voor de kanaalvorming opnieuw op en klik vervolgens op update in de microscoopmacro. Klik op nee om de huidige locatielijst te overschrijven en klik daarna op start in de microscoopmacro om het protocol te beginnen. Gebruik na voltooiing van het degradatieproces de configuratie voor hydrogelvisualisatie bij een lager laservermogen om het FITC-gelabelde dextraan zichtbaar te maken, dat een sterker signaal geeft dan het natuurlijke Eosin Y-signaal van de hydrogel.Voordat de fluorescentielabel dextran wordt toegevoegd, moet er wat water uit de put in de hydrogel worden geabsorbeerd. Pipetteer vervolgens 10 µL gefilterde FITC-gelabelde dextran in. De beschreven procedure werd gebruikt om een groot volume microvasculaire beelden om te zetten in een reeks virtuele maskers voor de beeldgestuurde vorming van een microfluïdisch netwerk.Het resulterende microfluïdische netwerk werd vergeleken met de in vivo vasculatuur waarvan het was afgeleid. De beeldgestuurde lasergebaseerde hydrogeldegradatie maakte de fabricage mogelijk van 3D biomimetische microfluïdische netwerken die de grootte, tortuositeit en complexe architectuur van in vivo vasculatuur nabootsen. Zowel drukkoppen als spuitpompen werden gebruikt om de vloeistofstroom in deze ingebedde microfluïdische netwerken te initiëren.Fluorescerend gelabelde 70 kilodalton dextraan en 10 micron polystyreenkraaltjes werden geobserveerd terwijl ze door een door drukverschil geïnduceerde stroom van links naar rechts bewogen. Alternatief werd een door een spuitpomp aangedreven stroom geïnitieerd door een hydrogel te fotopolymeriseren in een secundair microfluïdisch device. Met gebruik van hetzelfde hier beschreven protocol werd vervolgens lasergebaseerde degradatie toegepast om een 2D vasculair afgeleid netwerk te fabriceren in een ingesloten hydrogel voor een door spuitpomp aangedreven stroom en perfusie van 65 kilodalton dextraan.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een laser-scanning confocale microscoop, uitgerust met een femtoseconde-pulslaser, kunt gebruiken om biomimetische microfluïdische netwerken te genereren via beeldgestuurde lasergebaseerde hydrogeldegradatie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee tot drie uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de laserparameters, waaronder het vermogen, de golflengte en de scansnelheid, moeten worden aangepast en geoptimaliseerd op basis van de hydrogelformulering die wordt gedegradeerd.Bedankt en veel succes met uw experimenten.

image-guided-laser-based-fabrication-vascular-derived-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

We presenteren een methode voor microfluïdische depositie van genipine en fibronectine met een patroon op PDMS-substraten, waardoor een langere levensvatbaarheid van weefsels met een hoge dichtheid aan vasculaire gladde spiercellen mogelijk wordt. Deze weefselfabricagemethode wordt gecombineerd met eerdere technologie voor dunne vaatwandfilms om de vasculaire contractiliteit te meten gedurende tijdsverlopen die relevant zijn voor ziekten.

Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.

Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat

Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Ontworpen flappen vereisen een geïntegreerd functioneel vasculair netwerk. In dit protocol presenteren we een methode voor het fabriceren van een 3D-geprinte weefselflap met een hiërarchisch vasculair netwerk en de directe microchirurgische anastomosen naar de dijbeenslagader van ratten.

Fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3D-printtechnologieën

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

Hier presenteren we een protocol voor het bouwen van een organ-on-chip (OOC) -systeem dat is ontworpen om pneumonectomie na te bootsen. Dit systeem onderzoekt de mogelijke correlatie tussen glycocalyxstoornissen en complicaties na pneumonectomie.

Modellering van de endotheliale glycocalyx na pneumonectomie in een 3D-fluïdische chip - een benadering voor het fabriceren van een vasculair orgaan-op-chip-systeem

Leer hoe je met beeldgeleide laserdegradatie biomimetische microfluïdische netwerken fabriceert in PEGDA-hydrogels. Deze techniek bootst vasculaire architectuur nauwkeurig na voor weefselengineering en ziekteonderzoek.

Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks

Meer video's verkennen