Beeldvorming van de neutrofielen phagosome en cytoplasma Met behulp van een Ratiometrische pH Indicator

Het algemene doel van deze confocale microscopietechniek is het in beeld brengen van de pH en het oppervlak van de fagocytische vacuole en het cytoplasma van neutrofielen. Deze methode maakt het mogelijk om dynamische veranderingen in de pH in de fagocytische vacuole en in het cytoplasma te monitoren en te kwantificeren, alsook het volume van de fagocytische vacuole. Deze metingen veranderen naargelang de activiteit van het NADPH-oxidase en kunnen worden gebruikt als surrogaatmarkers voor de functie hiervan en voor ionenstromen over het membraan van de fagocytische vacuole.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel het fagosoom als het cytoplasma gelijktijdig kunnen worden afgebeeld met een kleurstof die een breed pH-bereik heeft. Bereid voor deze procedure een aliquot van carboxy-S-1 succinimidylester door 50 µg ervan te verdunnen in 100 µL hoogwaardige DMSO. Vortex het geheel goed om te mengen.

Bereid vervolgens één milliliter van 10⁸ hitte-geïnactiveerde of HK Candida voor in 0,1 M natriumbicarbonaat in een buis van 15 milliliter. Voeg 100 µL carboxy-S-1 druppelsgewijs toe aan de HK Candida terwijl u mengt op een vortexmixer bij 2.000 RPM. Wikkel daarna de buis in aluminiumfolie en plaats deze gedurende één uur op een roller bij kamertemperatuur.

Was na een uur de HKC-S-1 drie keer door centrifugatie bij 2.250 ×g gedurende telkens 10 minuten. Resuspendeer de pellet bij de eerste twee wasbeurten in 15 milliliter 0,1 molar natriumbicarbonaat. Resuspendeer de pellet na de derde wasbeurt in één milliliter BSS-buffer.

Overbreng de HKC-S-1 suspensie naar buisjes in aliquots van 100 µL en bewaar deze bij -20 °C. Om HKC-S-1 te opsoniseren voor menselijke neutrofielen, voeg 100 µL menselijk IgG-serum toe aan 100 µL ontdooide HKC-S-1. Meng dit op een warmeshaker bij 37 °C en 1.000 RPM gedurende 60 tot 90 minuten, en vervolgens op een roller bij 4 °C gedurende twee uur.

Was daarna het monster drie keer in BSS-buffer door centrifugatie bij 17.000 ×g gedurende telkens één minuut. Resuspendeer het monster vervolgens in 100 µL BSS-buffer. Neem voor neutrofielen uit menselijk perifeer bloed 15 mL bloed via venapunctie van een gezonde donor en breng dit over in een spuit van 20 mL die 90 µL natriumheparine-oplossing bevat met een concentratie van 1.000 IU per mL.

Injecteer met een pipetpunt 1,5 milliliters van een 10% dextran-oplossing in de spuit. Keer deze voorzichtig drie keer om en laat de spuit vervolgens 30 tot 60 minuten rechtopstaand op de bench staan. Na 30 tot 60 minuten moet het bloed ongeveer in tweeën splitsen, met een strogele buffycoat-laag aan de bovenkant en een onderste laag die erytrocyten bevat.

Duw de bovenste laag voorzichtig uit via een naald of verwijder deze met een pipetpunt, en breng deze vervolgens over naar een buis van 15 milliliter, waarbij u voorkomt dat de rode laag wordt meegenomen. Voeg met een vijf milliliter pipet drie tot vier milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan de bodem van de buis, onder de buffy coat-laag, om twee duidelijk gescheiden lagen te verkrijgen. Centrifugeer de sample vervolgens 10 minuten lang bij 900 ×g.

Giet het supernatant af en laat de rode pellet achter. Vortex vervolgens voorzichtig om de pellet te verbreken. Voeg daarna zeven milliliters gedestilleerd geautoclaveerd water toe aan de pellet en keer de buis gedurende 20 seconden om om de pellet te resuspenderen.

Voeg daarna zeven milliliters 2x saline toe en keer de buis een paar keer om om te mengen, waardoor de resterende rode bloedcellen lyseren, en centrifugeer het monster vervolgens op 300 ×g gedurende vijf minuten. Giet het supernatant af en resuspendeer het pellet in BSS-buffer tot ongeveer 4 × 10⁶ per milliliter. Voorbehandel bij deze procedure een microscopieplaat met acht putjes door in elk putje 200 µL poly-L-lysine aan te brengen gedurende 40 tot 60 minuten bij kamertemperatuur, verwijder daarna de poly-L-lysine en was de putjes twee keer met 200 µL gedestilleerd water.

Voeg vervolgens 200 µL van de bereide celsuspensie toe aan elke put en incubeer deze gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Bereid daarna een aliquot S-1-AM ester voor door 100 µL hoogwaardige DMSO aan een buisje toe te voegen en te vortexen om te mengen. Voeg in een klein buisje 1,7 mL BSS-buffer en 20 µL S-1-AM toe en vortex het mengsel.

Was daarna de wells twee keer met 200 µL BSS-buffer en vervang de buffer door de S-1-AM-oplossing. Let erop dat de celmonolaag die aan de bodem van de well is gehecht niet wordt verstoord door de vloeistof voorzichtig langs de wand van de wells te pipetteren. Incubeer het monster vervolgens gedurende ten minste 25 minuten bij kamertemperatuur.

Was daarna de putjes twee keer met 200 µL BSS-buffer. Om een inhibitor te testen, maak dan een mastermix van het betreffende geneesmiddel in BSS-buffer en was de putjes hier twee keer mee. Sonicate vervolgens de geopsoniseerde HKC-S-1 gedurende ongeveer drie seconden bij vijf micron en voeg 10 µL hiervan toe aan elk putje. Incubeer de plaat vervolgens bij 37 °C gedurende 15 tot 20 minuten, zodat de cellen gereed zijn om te worden gefotografeerd voor snapshots van fagocytose.

Stel met een confocale microscoop de golflengte van de laser zo in dat de cellen worden geëxciteerd bij 555 nanometer en de emissie wordt gedetecteerd door twee detectoren bij 560 tot 600 nanometer en boven 610 nanometer. Bekijk vervolgens de cellen met een 63X olie-immersie-objectief. Gebruik een tile scan-afbeelding op de continue instelling om de centrale tegel te bekijken.

Stel de focus en intensiteit van de laser en de gain van de twee kanalen bij op basis van de fluorescentie-intensiteit en de gain van de detectorkanalen om het beeld te optimaliseren. Splits daarna het beeld met behulp van de instellingen om beide kanalen te bekijken. Controleer vóór de start van het experiment of er geen verzadiging van de fluorescentie-intensiteit is in het cytoplasma of de vacuolen, wat zichtbaar zou zijn als rode stippen.

Indien dit het geval is, verlaag dan de laserintensiteit zodat er een minimaal aantal rode stippen aanwezig is, maar de cellen en fagosomen nog steeds helder en duidelijk zichtbaar zijn. Open bij deze procedure ImageJ en laad het voor analyse gekozen afbeeldingsbestand in de werkbalk. Om de twee kanalen te combineren, gaat u naar Image, Color en selecteert u vervolgens Make Composite.

Klik met de rechtermuisknop om een bestand te kiezen waarin de resultaten worden opgeslagen. Klik vervolgens op de Lijntool in de werkbalk en dubbelklik om de breedte te verhogen naar twee. Trek een lijn over de breedte van een fagosoom en klik vervolgens met de rechtermuisknop om de pH te meten.

De cytoplasmatische pH kan op dezelfde manier worden gemeten door een lijn over het cytoplasma te trekken. Klik na het voltooien van de metingen met de rechtermuisknop om Bestand opslaan te kiezen. Gebruik om het oppervlak van het fagosoom te meten het vierde icoon in de werkbalk om vrijhandig rond het gebied te tekenen.

Klik vervolgens met de rechtermuisknop om Meet Oppervlakte te selecteren. Hier is een kwalitatieve visuele legenda van de geschatte kleur van de met S-1 gekleurde fagosomen in overeenstemming met de pH. De gele kleur duidt op een hogere zuurgraad, terwijl rood duidt op een hogere alkaliniteit.

Deze afbeelding toont beenmergnutrofielen van muizen waarin het Hvcn1-kanaal ontbreekt, 20 minuten na fagocytose. De fagosomen zien er zeer rood, alkalisch en gezwollen uit. De rode pijl hier wijst naar een intracellulaire Candida, terwijl deze pijl naar een extracellulaire Candida wijst.

Deze afbeelding toont neutrofielen uit het beenmerg van wild-type muizen die Candida hebben opgenomen. Deze zijn veel minder alkalisch dan Hvcn1-knock-out neutrofielen. Deze afbeelding toont neutrofielen uit menselijk perifeer bloed op hetzelfde tijdstip na fagocytose.

Ze lijken iets alkalischer dan de wilde-type cellen van de muis, maar de fagosomen zijn nog steeds niet zo groot en rood als die van de Hvcn1-knockoutcellen, en deze afbeelding toont menselijke neutrofielen die Candida hebben gefagocyteerd in aanwezigheid van vijf micromolaire diphenyleenjodium. Eenmaal beheerst kan deze techniek in ongeveer vier tot vijf uur worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het isoleren van de neutrofielen, zodat deze niet worden geactiveerd.

Om vast te stellen of de waargenomen effecten op veranderingen in de vacuolaire of cytosolische pH of het vacuolaire volume te wijten zijn aan veranderingen in de respiratoire burst, kan deze respiratoire burst op andere manieren worden gemeten die direct de productie van vrije radicalen of het zuurstofverbruik bepalen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u menselijke neutrofielen isoleert en vervolgens het fagosoom en het cytoplasma kleurt en afbeeldt. Vergeet niet dat werken met menselijke bloedmonsters uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en beschermende kleding.