Toezicht Astrocyt reactiviteit en proliferatie in Vitro ischemische-achtige omstandigheden
21 oktober 2017
Ischemische beroerte is een complexe gebeurtenis waarin de specifieke bijdrage van astrocyten naar de hersenen van de getroffen regio blootgesteld aan zuurstof glucose ontbering (OGD) moeilijk te bestuderen. Dit artikel introduceert een methodologie voor het verkrijgen van geïsoleerde astrocyten en studeren hun reactiviteit en de proliferatie onder voorwaarden van OGD.
Het volgende protocol is bedoeld om de isolatie van primaire astrocyten uit hersenen van pup ratten te tonen om zuurstofglucosedeprivatie of OGD uit te voeren. Blootstelling van gezuiverde astrocyten aan een zuurstofglucose-ontdane omgeving is een module die ons in staat stelt om de reactie te testen op enkele van de omstandigheden die worden aangetroffen bij ischemische beroertes. Methodische veranderingen, na blootstelling aan zuurstofglucosedeprivatie, kunnen worden waargenomen en gemeten met behulp van selectieve astrocytenmarkers zoals GFAP.
Kortom, deze geïsoleerde cellen die worden blootgesteld aan ischemische-achtige omstandigheden kunnen worden gebruikt om nieuwe manieren te testen die worden geactiveerd in hypoxische omstandigheden en andere geneesmiddelen die beschermen tegen ischemische beroerte. In dit deel van het protocol zullen astrocyten worden geïsoleerd uit de cortex van pup ratten. Het doel van deze procedure is om een primaire astrocytische celcultuur te verkrijgen om zuurstofglucosedeprivatie-experimenten uit te voeren.
De materialen voor deze procedure zijn de volgende, Steriliseer alle materialen voor gebruik in deze procedure. En stel de kap bloot aan minimaal 20 minuten UV-licht voordat u met het protocol begint. Om deze procedure te beginnen, pipet drie tot vijf milliliters compleet DME-medium in elke plaat.
Het zal worden verdeeld als volgt, een voor elke muizenhersenen, twee voor alle cortexsen en drie zullen voor alle cortexsen zijn zonder de meninges. Onthoofd een pup na desinfectie met 70% ethanol. Maak een insnijding vanaf de achterkant van het hoofd naar de neus.
Verwijder de schedel met een gebogen pincet en schraap voorzichtig het cerebellum weg om de cortexsen bloot te leggen. Verwijder de blootgestelde hersenen met een tang en plaats de hersenen in de eerste petrischaal met medium. Herhaal deze stappen voor alle andere pups.
Scheed de hersenhelften door voorzichtig langs de middenlijnsspleet te verdelen met het scherpe uiteinde van de microdissectiepincet. Schil de cortexsen door de witte stof en hippocampus te verwijderen met behulp van de tang met een knijpbeweging, en laat ze achter. Breng de gepelde cortexsen over naar de petrischaal met het label nummer twee.
Herhaal de procedure voor alle hersenen door alle gedissecteerde cortexsen in de petrischaal te combineren. Schud de schaal voorzichtig om het medium gelijkmatig te verdelen tussen alle cortexsen. Gebruik de dissectiemicroscoop om de meninges te identificeren die de gepelde cortexsen bekleden.
Meninges zijn een zeer dunne transparante laag die kan worden geïdentificeerd door te zoeken naar de kleine rode haarvaten rond het weefsel. Inspecteer en verwijder voorzichtig de meninges die de cortexsen bekleden en pel ze voorzichtig los van de individuele corticale lobben met behulp van fijne pincetten aan beide kanten van elke cortex. Plaats de schone cortexsen in een nieuwe petrischaal met het label nummer drie.
Voor weefseldissociatie met behulp van de maag of blender-methode, giet de schone, gepelde cortexsen en het medium uit de petrischaal in een steriele blenderzak. En voeg voldoende medium toe om het totale volume van de zak op vijf milliliter te brengen. Plaats de zak in de stomacher 80 waarbij ongeveer twee centimeter van de zak zichtbaar blijft boven de gesloten deur.
De celdissociatie in dit instrument wordt na 2,5 minuten op hoge snelheid uitgevoerd. Alternatief kan weefseldissociatie worden gemaakt door de steriele zak te sluiten en het weefsel voorzichtig te bonzen met een kolf in de kap totdat weefseldeeltjes een fijne suspensie zijn geworden. Zorg ervoor dat u een doek tussen zak en kolf gebruikt om wrijving en breken van de zak te voorkomen.
Giet de celsuspensie in het midden van de hoes met een maasnummer 60. Giet de gefilterde cellen in het midden van een maasnummer 100 en laat het door zwaartekracht filteren. Giet de gefilterde celsuspensie in een conische 15 milliliter buis.
Centrum fuge de celsuspensie bij 200 keer G in een centrum fuge, bij voorkeur met een draaiende emmer router gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en gooi het weg in een beker. Voeg compleet vers medium toe aan het celpalette.
Gebruik een serologisch pipet om het palette van cellen te resuspenderen en te dissociëren in maximaal vijf milliliter medium. Voeg de gewenste hoeveelheid celsuspensie toe aan een flacon en vul aan met medium. Voeg het gesuspendeerde palette toe aan de flacon met medium.
Verdeel de cellen gelijkmatig door de flacon en plaats ze in een incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Vergeet niet om het medium om de drie dagen te verversen. De volgende methodologie is bedoeld om cellen van zuurstof en glucose te beroven in een gecontroleerde omgeving.
Het doel van dit model is om de reactie van astrocyten in een ischemische-achtige beroerteconditie te bestuderen. De materialen die voor deze procedure worden gebruikt, zijn: Zuiver het glucosevrije medium door een serologisch pipet in te brengen dat is verbonden met het gassysteem. Belucht de oplossing met het gasmengsel gedurende 10 minuten met een stroomsnelheid van 10 tot 15 liters per minuut.
Na de 10 minuten, pas de pH van het OGD-medium aan tot 7,4. Filter het gezuiverde glucosevrije medium met behulp van het 50 milliliter buisfiltersysteem. Het is belangrijk om voor elke experiment altijd vers OGD-medium te maken.
Dit zorgt ervoor dat het medium van zuurstof wordt bevrijd. Verwijder astrocytenmedium en was twee keer met cellulair PBS om glucose uit de cellen te verwijderen. Voeg het OGD-medium toe aan de putjes.
Plaats de multiputtenbak met de deksel open binnen in de hypoxiekamer. Verbind het gasmengsel met de entreeklep en laat de uitlaatklep open. Spoel de kamer gedurende vijf tot zeven minuten met het gasmengsel met een stroomsnelheid van 10 tot 15 liter per minuut.
Stop de gasstroom en sluit eerst de klem op de uitlaatklep. Sluit vervolgens de klem op de gasinlaatklepslang. Plaats de hypoxische kamer in de celkweekincubator bij 37 graden Celsius gedurende de gewenste tijd in OGD.
Nadat de incubatietijd voorbij is, aspireer het OGD-medium en voeg voorzichtig compleet DMEM
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het isoleren van primaire astrocyten uit de hersenen van rattenpups om hun reactie op zuurstof-glucose-deprivatie (OGD) te bestuderen, een conditie die een ischemisch infarct nabootst. De methodologie stelt onderzoekers in staat om veranderingen in de astrocytenreactiviteit en proliferatie onder OGD-condities waar te nemen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beroertenonderzoek
Achtergrond
- Ischemische beroertes gaan gepaard met complexe cellulaire reacties.
- Astrocyten spelen een cruciale rol bij hersenletsel en herstel.
- Het bestuderen van astrocyten onder OGD-condities kan belangrijke inzichten opleveren.
- Selectieve markers zoals GFAP worden gebruikt om veranderingen in astrocyten te beoordelen.
Doel van de studie
- Het isoleren van primaire astrocyten voor experimentele analyse.
- Het onderzoeken van het gedrag van astrocyten onder ischemie-achtige omstandigheden.
- Het testen van potentiële beschermende geneesmiddelen tegen ischemische beroertes.
Gebruikte methoden
- Isolatie van primaire astrocyten uit de cortices van rattenpups.
- Blootstelling van astrocyten aan zuurstof- en glucosegebrek.
- Meting van de astrocytenreactiviteit met behulp van GFAP-markers.
- Evaluatie van cellulaire responsen op hypoxische condities.
Belangrijkste resultaten
- Geïsoleerde astrocyten vertonen meetbare veranderingen onder OGD.
- GFAP-markers duiden op astrocyte-activatie.
- Potentiële pathways die worden geactiveerd als reactie op hypoxie kunnen worden geïdentificeerd.
- De resultaten kunnen bijdragen aan therapeutische strategieën voor ischemische beroertes.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de isolatie van astrocyten.
- Inzicht in de reacties van astrocyten kan bijdragen aan onderzoek naar beroertes.
- Toekomstige studies kunnen de werkzaamheid van geneesmiddelen bij het beschermen van astrocyten onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Astrocytenreactiviteit en proliferatie onder ischemie-achtige omstandigheden zijn cruciaal voor het begrijpen van de cellulaire mechanismen die hersenletsel en herstel na een beroerte aansturen. Dit in vitro OGD-model maakt een nauwkeurige analyse van astrocyten-specifieke responsen mogelijk, wat bijdraagt aan het voorspellende vertrouwen bij de vroege validatie van neuroprotectieve targets. De aanpak ondersteunt de risicogestuurde verdere ontwikkeling van neurotherapeutische kandidaten door het isoleren van astrocyten-gestuurde pathways en de effecten van oplosbare factoren.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door astrocytenresponsen op ischemische stress te isoleren.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie via kwantificeerbare analyse van GFAP- en PCNA-markers.
- Faciliteert de onderzoeksfase van signaalpaden voor het screenen van neuroprotectieve of neurotoxische verbindingen.
- Biedt een gecontroleerd systeem voor hypothesegestuurde evaluatie van de biologie van astrocyten.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gevalideerde, reproduceerbare in vitro-modellen voor compound-screening onder OGD-condities.
- Standaardiseert kwantitatieve read-outs van astrocytenreactiviteit en -proliferatie voor assay-ontwikkeling.
- Maakt het verzamelen van astrocyten-geconditioneerde media mogelijk voor downstream neuronale assays.
- Ondersteunt schaalbaarheid en platformhergebruik binnen programma's voor neuroinflammatie en neuroprotectie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in vitro bevindingen met ziekterelevante ischemische mechanismen die in vivo zijn waargenomen.
- Maakt translationele biomarkeronderzoek mogelijk via analyse van oplosbare factoren uit astrocytculturen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van neuroprotectieve strategieën.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor de selectie van kandidaten voorafgaand aan dierstudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit op OGD gebaseerde astrocytenmodel is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot prekliniek en slaat een brug tussen vroege mechanistische studies en translationeel onderzoek naar beroerte en neuroprotectie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothese-testen en pathway-verduidelijking in geïsoleerde astrocytensystemen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van verbindingen onder ischemie-achtige stress.
- Analytiek: Maakt meting van GFAP, PCNA en oplosbare factoren mogelijk voor vergelijkende analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro astrocytenresponsen met in vivo biomarkers en functionele uitkomsten.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor R&D-pipelines op het gebied van neuro-inflammatie en neuroprotectie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de ontdekking van neurotherapeutica.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van ischemie-relevante assays.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door vroege biologische risicoreductie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van neuroprotectieve kandidaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de isolatie van primaire cellen en in vitro hypoxiemodellering.
- Vereist toegang tot hypoxiekamers, gascontrolesystemen en immunofluorescentie-analyses.
- Maakt cross-team standaardisatie van OGD-blootstellingsparameters en markerkwantificatie noodzakelijk.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende soorten of hersenregio's, afhankelijk van de behoeften van de portfolio.
- Beperkt door de afwezigheid van cel-celinteracties; co-cultuur of benaderingen met geconditioneerd medium kunnen vereist zijn voor een bredere translationele relevantie.
