Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden
28 december 2016
Hier presenteren we protocollen voor humane celcultuur om factoren voor translatie-initiatie te analyseren die zich binden aan de 5' dop van mRNA tijdens fysiologische zuurstofcondities. Deze methode maakt gebruik van een agarose-gekoppelde m7GTP dop-analogon en is geschikt om dop-bindende factoren en hun interacterende partners te onderzoeken.
Het algemene doel van dit experiment is om cap-bindende eiwitten te vangen onder omstandigheden van lage zuurstof. Deze methode maakt gebruik van een agarose-gekoppelde zeven methyl-guanosine cap analoog om cap-bindende factoren en hun interacterende partners te onderzoeken. Deze methode zal helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwitsynthese, zoals het identificeren van nieuwe zuurstofgereguleerde factoren die betrokken zijn bij cap-afhankelijke translatie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cellen worden bewaard in een hypoxiewerkstation tot het punt van lysis. De implicaties van deze techniek reiken tot kankertherapie omdat kankercellen binnen een tumor worden blootgesteld aan zeer lage zuurstofniveaus en translationele controle een sleutelrol speelt bij tumorprogressie. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we een recente publicatie van Corona's collega's lazen die meldden dat weefseloxygenatie eigenlijk dichter bij wat we hypoxie noemen, in plaats van de normaxie waarin cellen routinematig worden gekweekt.
Begin deze procedure met celcultuur zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het tellen van de cellen met behulp van een hemocytometer, voed 150 millimeter gekweekte schalen met 15 milliliters compleet medium om een celdichtheid van 2500 tot 5000 cellen per vierkante centimeter te verkrijgen. Gebruik twee 150 millimeter schalen voor elke cap-bindende assay.
Plaats de gezaaide cultuurschalen in de incubator bij 37 graden Celsius en een atmosfeer van vijf procent kooldioxide. Nadat de cellen minimaal 24 uur hebben geïncubeerd, plaats de cellen in een hypoxiewerkstation gedurende de gewenste tijd. Zet vervolgens de werkstation op de juiste physioxia.
Verwarm een X fosfaat gebufferde zoutoplossing, of PBS, en trypsine in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 30 minuten. Doe 980 microliters van lysis buffer in een 1,5 microliter centrifugeerbuisje voor elke cap-bindende assay die wordt uitgevoerd. 10 microliters van 100X protease remmer cocktail en 10 microliters van 4-benzenesulfonyl fluoride hydrochloorhydride naar de 980 microliters van lysis buffer op ijs.
Gooi het medium van elke 150 millimeter schaal in een afvalcontainer binnen de hypoxiewerkstation. Was vervolgens de cellen met drie tot vier milliliters warme een X PBS en gooi de vloeistof weg. Voeg een milliliter warm 0,5 procent trypsine EDTA toe aan elke schaal en laat de schalen staan voor twee minuten of tot de cellen niet meer aan de plaat zijn gehecht.
Gebruik een pipet om de cellen van één plaat over te brengen naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Herhaal indien nodig zodat elke plaat met cellen wordt overgebracht naar een afzonderlijk 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Centrifugeer de microcentrifugebuisjes bij 6000 keer g gedurende 90 seconden om de cellen te pellen.
Na centrifugatie aspireer de trypsine met een pipet zonder het pellet te verstoren. Was de cellen met warme een X PBS door voorzichtig 200 microliters PBS in de buis te pipetten, net boven het pellet. Aspireer vervolgens het PBS zonder het pellet te verstoren.
Pipet vervolgens 500 microliters van de bereide lysis buffer oplossing van één milliliter op het eerste cellulaire pellet. Re-suspendeer het pellet volledig door op en neer te pipetten. Combineer de gesuspendeerde cellen met het tweede celpellet en re-suspendeer het tweede pellet door op en neer te pipetten.
Herhaal dit proces totdat alle pellets zijn gecombineerd en gesuspendeerd voor elk monster. Combineer vervolgens het lysate met de resterende 500 microliters lysis buffer in een 1,5 liter microcentrifugebuisje. Verwijder de monsters uit de hypoxiewerkstation.
Lyse de cellen met zachte agitatie door de monsters te roteren bij vier graden Celsius gedurende 1,5 tot twee uur. Na incubatie centrifugeert u de geliseerde cellen bij 1200 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om cellulaire debris te verwijderen. Breng het lysate over naar een nieuw 1,5 milliliter microcentrifugebuisje en gooi het pellet weg.
Reserveer een deel van het supernatant om te worden gebruikt als whole cell lysate input control voor western blot analyse. Gebruik om voor te bereiden op de cap-bindende assay scharen om het uiteinde van de pipet te verwijderen om het verzamelen van de bead slurry te vergemakkelijken. Voor elk monster breng 50 microliters van de blanke agarose bead control slurry en 50 microliters van de m7GTP agarose C10-gekoppelde beads slurry over naar afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.
Vervolgens pelleer de beads door de slurry bij 500 keer g gedurende 30 seconden te centrifugeren. Verwijder voorzichtig het supernatant en re-suspendeer de beads in 500 microliters TBS. Na het herhalen van deze stappen pelleer de beads bij 500 keer g gedurende 30 seconden en verwijder het supernatant.
Breng vervolgens het supernatant met de lysate over naar het 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met de lege agarose beads. Incubeer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Na 10 minuten pelleer de lege agarose beads door bij 500 keer g gedurende 30 seconden te centrifugeren.
Na centrifugatie brengt u het lysate dat niet aan de beads bindt over naar het 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met de m7GTP agarose C10-gekoppelde beads. Was de lege agarose beads door de beads opnieuw op te schorsen in 500 microliters lysis buffer, de beads te pelleren door bij 500 keer g gedurende 30 seconden te centrifugeren en het supernatant weg te gooien. Herhaal dit vier keer voor een totaal van vijf wasbeurten.
Re-suspendeer de lege agarose beads in een X SDS-PAGE monsterbuffer. En kook de beads gedurende 90 seconden bij 95 graden Celsius. Bewaar het monster bij 20 graden Celsius voor toekomstige western blot analyse om te observeren of het eiwit van belang niet-specifiek aan de bead bindt.
Incubeer het lysate met de m7GTP agarose C10-gekoppelde beads met zachte agitatie gedurende een uur bij vier graden Celsius om cap-bindende eiwitten te vangen. Na agitatie pelleer de m7GTP agarose C10-gekoppelde beads door bij 500 keer g gedurende 30 seconden te centrifugeren. Na het weggegooien van het supernatant, was de m7GTP agarose C10-gekoppelde beads zoals eerder.
Re-suspendeer de beads in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het analyseren van translatie-initiatiefactoren die onder lage zuurstofcondities aan de 5' dop van mRNA binden. Door gebruik te maken van een agarose-gekoppelde m7 GTP dop analoog, beoogt deze techniek het identificeren van nieuwe zuurstof-gereguleerde factoren die betrokken zijn bij dop-afhankelijke translatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Eiwitsynthese
Achtergrond
- Dop-bindende eiwitten spelen een cruciale rol in translatie-initiatie.
- Cellen in tumoren ervaren vaak hypoxische omstandigheden.
- Begrip van translatie onder lage zuurstof kan kankertherapie informeren.
- Recente studies suggereren dat weefseloxygenatie vaak dichter bij hypoxie dan normoxie is.
Doel van studie
- Om dop-bindende eiwitten te vangen onder lage zuurstofcondities.
- Om de interactie van dop-bindende factoren en hun partners te onderzoeken.
- Om nieuwe factoren te identificeren die translatie onder hypoxische condities reguleren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een agarose-gekoppelde m7 GTP dop analoog.
- Celcultuur gehandhaafd in een hypoxie werkstation tot lysis.
- Analyse van eiwitinteracties onder gecontroleerde zuurstofniveaus.
- Toepassing van de methode om translationele controle in kankercellen te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vangst van dop-bindende eiwitten onder hypoxische condities.
- Identificatie van nieuwe zuurstof-gereguleerde factoren betrokken bij translatie.
- Inzichten in de rol van translationele controle in tumorprogressie.
- Validatie van de effectiviteit van de methode in het bestuderen van eiwitsynthese.
Conclusies
- Deze methode biedt een nieuwe aanpak voor het bestuderen van translatie-initiatiefactoren.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrijpen van kankerbiologie.
- Verder onderzoek zou therapeutische strategieën gericht op hypoxische tumoren kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding oxygen-dependent regulation of translation initiation is critical for de-risking oncology targets, as tumor microenvironments exhibit physiological oxygen levels that alter cap-dependent protein synthesis. This method enables identification of oxygen-sensitive cap-binding proteins, supporting mechanistic validation of translation factors in disease-relevant systems. By preserving native oxygen conditions during sample preparation, the approach enhances predictive confidence in target validation and assay development for hypoxic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating cap-binding proteins under physioxia conditions that mimic human tissue oxygenation.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for validating oxygen-regulated translation factors as potential drug targets in cancer biology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative binding data for cap-dependent translation factors across oxygen gradients, enabling assay standardization for target engagement studies.
- Operational Value: Supports development of oxygen-controlled biochemical assays to screen modulators of translation initiation in physiologically relevant conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking oxygen-sensitive cap-binding proteins to translational control in disease-relevant primary human cells.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining hypoxic conditions throughout sample processing, reducing artifactual target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing oxygen-regulated biochemical readouts that inform target selection and lead identification in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-dependent translation initiation by capturing cap-binding proteins under controlled physioxia.
- Screening: Enables assay readiness through standardized capture and elution of m7GTP-binding proteins under low oxygen conditions.
- Analytics: Generates quantitative western blot outputs to compare cap-binding protein abundance across oxygen levels, aiding comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary human renal proximal tubule epithelial cells as a disease-relevant system for oxygen-regulated translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying oxygen-sensitive RNA-binding proteins across multiple target classes beyond translation factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in oxygen-sensitive translation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization by requiring hypoxia workstation use for cell culture, lysis, and biochemical steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets whose activity is confounded by standard normoxic culture conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets in hypoxic disease areas through oxygen-controlled biochemical validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic cell culture and biochemical assay execution within controlled atmosphere workstations.
- Dependent on access to hypoxia workstations for maintaining physioxia during cell handling and sample preparation.
- Necessitates standardization of oxygen levels and equilibration times across laboratories for reproducible cap-binding protein recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-adherent or primary cell types with varying oxygen sensitivity.
- Limited by potential loss of cap interactors that require second-base interactions or m7GTP hydrolysis, as noted in the protocol.
