Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Het algemene doel van dit protocol is om gebruik te maken van een geavanceerde dorsale huidplooikamer om de ontwikkeling van tumorgeassocieerde vaten in detail te bestuderen in een muismodel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van kanker, zoals de verbetering van therapieën en het begrijpen van tumorprogressie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat processen in de juiste context, in vivo, worden bestudeerd en dat deze processen over een langere periode gevolgd kunnen worden.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Doctor Ann Seynhaeve, senior onderzoeker in mijn laboratorium. Oogst uit een niet-transgene donormuis een niet-necrotisch tumorfragment met een diameter van 10 mm voor implantatie in de dorsale window chamber van de ontvangende muis. Gebruik een normale donormuis voor een syngene tumor of een immuundeficiënte donormuis voor een xenograft.

De ontvangende muis moet ten minste 12 weken oud zijn en twintig gram of meer wegen. Voer alle chirurgische procedures uit onder aseptische omstandigheden. Autoclaveer bijvoorbeeld de chirurgische instrumenten en de materialen van de kamer.

Nadat de ontvangende muis is gesedeerd, verwijdert u de haren van de gehele rugzijde met een elektrische trimmer en gebruikt u vervolgens ontharingsgel. Spoel de huid schoon en droog deze af. Scrub tot slot de ontharde huid schoon met ethanol.

Markeer nu een horizontale middellijn langs de wervelkolom. Positioneer vervolgens het kijkvenster ten minste 2 mm onder de lijn en markeer de omtrek van het venster op de huid. Verwijder daarna met een scalpel en een schaar voorzichtig de huid binnen de omtreklijn, zonder de onderliggende fascia te beschadigen.

Trek vervolgens de huidplooi op en gebruik een oorpons om gaten van 1 mm te maken aan weerszijden van het window-gebied voor de bouten die het window op zijn plaats houden. Positioneer het achterframe op de muis en zet het frame vast door de moeren op de bouten te plaatsen. Trek daarna de huid twee tot drie millimeter over het frame om er zeker van te zijn dat het goed past.

Indien dit het geval is, steek dan naalden van 23 gauge door de twee hechtingsgaten aan de bovenzijde van het frame. Zet het frame vast door de moeren aan te draaien en houd deze vast met klemnaaldhouders; draai de moeren niet te strak aan om te voorkomen dat de huid om de bouten draait. Vervang vervolgens de naalden door hechtingen om het frame aan de huid te bevestigen.

Draai de muis nu op zijn zij. Plaats vanuit deze hoek een dik stuk vulglas en een standaard dekglas van 12 millimeter. Zet beide vast met een klemring, zodat de fascia strak tegen het glas aan komt te zitten.

De volgende stap is om het venster te hydrateren met 0,9% natriumchloride. Laat een paar druppels op het zichtveld vallen en neem het overschot op. Maak vervolgens, net onder het venster, met een naald van 25 gauge met een knik van 90 graden een diepe pocket in de fascia die een kubieke millimeter tumorweefsel kan bevatten.

Plaats vervolgens het tumorweefsel in de pocket. Sluit tot slot het venstergebied af met een standaard dekglas van 12 millimeter en een klemring. Eventuele luchtbellen zullen binnen een uur verdwijnen.

Warm voor het sederen van de muis een op maat gemaakt, temperatuurgecontroleerd platform op tot 37 °C. Plaats de muis na sedatie op het voorverwarmde platform. Bevestig een neusmasker voor de toediening van isofluraan en breng, indien de evaluatie langer dan vijf minuten duurt, een oogsalf aan.

Schroef nu de kamer met de bouten van het venster aan de op maat gemaakte houder en bevestig de houder aan het platform. Reinig vervolgens het glazen venster met water en watten. Controleer nu onder de microscoop, met behulp van het 10x objectief en onder helderveld- en fluorescentielicht, op de ontwikkeling van vaten in de tumor.

Schakel na het macroscopisch onderzoek de confocale lasers in. Stel het bedieningspaneel van de microscoop in op een smart gain van 100 volt per slag, een smart offset van 10% per slag, een medium zoom, medium X- en Y-positionering en 100 microns Z-positie per slag.

Stel de acquisitiemodus in op XYZ of XYZT. Selecteer een resolutie. Kies een acquisitiesnelheid van 2 of 400 Hertz.

Stel het pinhole in op één airy unit. Selecteer de bidirectionale X-optie. Bij het evalueren van meerdere fluoroforen met een mogelijk overlappend spectraal bereik, selecteert u 'sequential scan' tussen frames om bleed-through te voorkomen en stelt u de juiste straalpaden in.

Stel het lijnsgemiddelde in op vier en selecteer tot slot een nieuwe dataset voor het experiment. Focus nu op het weefsel van belang; hiervoor is het aanbevolen om droge objectieven met een hogere numerieke apertuur te gebruiken. Gebruik vervolgens de fast live scan om de best mogelijke signaal-ruisverhouding te verkrijgen door de gain en offset zo aan te passen dat er geen overbelichting optreedt.

Select nu de Z-stapel in het tabblad 'acquire'. Voer een snelle Z-scan uit. Bepaal op basis van de snelle scan de begin- en eindposities voor de volledige scan.

Stel vervolgens de Z-stapgrootte in op basis van de pinhole-grootte en voer de volledige scan uit. Gastmuizen die fluorescerende labels tot expressie brachten, werden na tumorimplantatie afgebeeld met behulp van het beschreven protocol. Het eNOStag-GFP label komt tot expressie in het Golgi-apparaat en het celmembraan van endotheelcellen.

Het ROSAmT/mG-label vertoont overal rode fluorescentie en groene fluorescentie in cellen die Cre-recombinase tot expressie brengen. Een toepassing van deze technologie is de bestudering van vaatontwikkeling, aangezien alle stadia in tumoren zichtbaar zijn. Zo kunnen endotheliale fronten worden waargenomen die uitspruiten in niet-gevasculariseerde gebieden.

Tumoren hebben daarnaast beschadigde vaten en gevestigde vasculaire bedden met rijpe vertakte vaten. Een andere toepassing is het bestuderen van lumenvorming, bloedstroom en extravasatie door labels aan het bloed toe te voegen, zoals fluorescerende nanodeeltjes. Zo kan de bloedstroom worden waargenomen in het lumen van vasculaire buizen en nabij endotheliale tipcellen.

In de tipcellen is de vorming van een lumen waarneembaar. Intravitale microscopie kan ook worden gebruikt om het effect van chemotherapeutische middelen te onderzoeken. Bijvoorbeeld, 24 uur na injectie van nanodeeltjes in een eNOStag-GFP dier, bleven de nanodeeltjes in de vasculatuur met minimale extravasatie in het tumorinterstitium.

Wanneer nanodeeltjes echter in combinatie met TNF werden toegediend, werd extravasatie in het tumorinterstitium waargenomen. Dit is een bewijs voor een toename van de intratumorale genelevering. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het installeren van een dorsale huidplooi-windowkamer en het bestuderen van tumorgerelateerde processen met behulp van confocale microscopie.