Name: Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: Leer een methode om calciumgevoelige kleurstoffen via een zenuwstomp in kikkerzenuwuiteinden te laden. Dit protocol maakt optische registratie van snelle calciumtransiënten mogelijk voor onderzoek naar synaptische signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek is uitgevoerd onder het Russische Stichting Program voor Concurrerende Groei van de Kazan Federale Universiteit en een subsidie ​​van de Russische Stichting voor Basisonderzoek (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). We bedanken vier anonieme recensenten voor het geven van nuttige opmerkingen over eerdere ontwerpen van het manuscript. Wij danken Yuliya Aratskaya voor de stemopname. Wij zijn dankbaar voor Dr. Victor Ilyin voor de vele nuttige opmerkingen en de hulp bij de finale bewerking van het manuscript.

Experimenten werden uitgevoerd op geïsoleerde zenuwspierpreparaten van de musculus cutane pectoris van de Rana ridibunda kikker. De grootte van de dieren van beide geslachten was ongeveer 5-9 cm. De experimentele procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtlijnen voor het gebruik van laboratoriumdieren van de Kazan Federal University en de Kazan Medical University, in overeenstemming met de NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Het experimentele protocol voldoet aan de eisen van Richtlijn 86/609 / EEG van de Europese Gemeenschappen en is goedgekeurd door het Ethisch Comité van de Kazan Medical University. 1. Voorbereiding van de oplossingen <ol><li> Bereiding van de oplossing van Ringer. <ol><li> Bereid de oplossing van Ringer: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHC03 en 1,8 mM CaCl2. Stel de pH op op 7.2-7.4. </li><li> Bereid de oplossing van Ringer met een lage Ca 2+ </Sup&gt; en een hoge Mg 2+ inhoud: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHC03, 6,0 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2. Stel de pH op op 7.2-7.4. </li></ol></li><li> Bereiding van de kleurstofoplossingsoplossing. <ol><li> Bereid de op water gebaseerde oplossing die HEPES-Na bevat bij 10 mM (pH 7,2-7,4). </li><li> Voeg 14 μl van de HEPES-oplossing toe aan een injectieflacon met de kleurstof 30 . OPMERKING: de Ca 2+ indicator kleurstof komt in een 500 ml injectieflacon met 500 μg poeder. </li><li> Vortex en draai omlaag om grondig te mengen. </li><li> Verdun de oplossing om de uiteindelijke concentratie van de Ca 2+ indicator tot 30 mM te brengen. Vermijd blootstelling aan licht en opslaan bij -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Dye-loading Procedure <ol><li> Dissect de spierpectorisspier met een pectoralis proprius zenuw. OPMERKING: De dissectie procedure is beschikbaarIn een gratis download van het papier door Blioch et al. , 1968 31 . <ol><li> Voor de dissectie procedure, gebruik twee fijne tang en hoornvliesschaar (zie de tabel van materialen ). Breng het gezaagde weefsel over in een silicium-elastomeer-gecoate Petri-schaal, die gevuld is met Ringer&#39;s oplossing en maak het weefsel vast met fijne roestvrijstalen pennen, zodat het licht in het gerecht is gestrekt. </li><li> Vul de Petri-schotel opnieuw op met een frisse aliquot van de oplossing van de Ringer. Verwijder de bindweefsels. Beschadig de zenuw niet. </li></ol></li><li> Bereid de vulpijp voor: gebruik een scheermesje, snijd een 2 mm lang stuk van het conische gedeelte van een standaard plastic 10 μL pipetpunt uit. </li><li> Bereid een stuk modelleer om de vulpijp op de Petri-schotel te monteren. </li><li> Sluit de achterkant van de vulpijp aan op een plastic spuit via siliconenpijp en plastic verbindingsadapters gemaakt van pipettespen. </li><li> Voor de dLaadprocedure, verwijder de oplossing van de Ringer uit de petrischaal met behulp van een plastic pipet. Droog de spier-zenuwpreparatie met een fijne spuit; Dit voorkomt de verdunning van de Ca 2+ kleurstof bij de daaropvolgende laad van de vulpijp. </li><li> Verwijder de Ca 2+ indicator flesje uit de vriezer en laat het op kamertemperatuur op een donkere plaats ontdooien. </li><li> Onder stereomicroscoopcontrole met lage vergroting (10 ×), detecteer de verbinding tussen de spier en de zenuw. Met fijne pincetjes en scharen, snij de pectoralis proprius zenuw dicht bij het spieroppervlak (zie stap 2.1). Laat een zenuwstomp ongeveer 2 mm lang. </li><li> Bevestig de vulpijp aan de buizen en de spuit op de petrischaal met behulp van modelleerklep. </li><li> Verplaats de tip van de pipet dicht bij de zenuwstomp. </li><li> Zuig het zenuwstomp zachtjes in de punt van de vulpijp voorzichtig. </li><li> Verwijder de zuigleiding van de blunT einde van de vulpijp. </li><li> Verwijder de overtollige oplossing voorzichtig uit de vulpijp met behulp van een spuit met een lange naald (zie de tabel ). Knip de zenuwstomp niet vast. </li><li> Verhoog de punt van de vulpijp lichtjes verticaal en houd de zenuwstomp in de punt geaspireerd. </li><li> Isolatie van het aspiratiegedeelte van de zenuwstomp van de buitenkant van de vulpipettaart met behulp van petroleumjelly. </li><li> Zet de zenuwstomp die in de vulpijp is geïsoleerde, indien nodig op: Smeer de overtollige oplossing van de vulpijp voorzichtig met een spuit met een lange naald. </li><li> Teken 0,5 μL van de kleurstofoplossingsoplossing (zie stap 1) met een pipet met een lange pipettaart. </li><li> Steek de pipetpunt voorzichtig in met de laadoplossing in de vulpijp. Verwijder het mengsel direct op de zenuwstomp. </li><li> Verzegel het open einde van de vulpijp met petroleumjelie. </li><li> Voeg een kleine aliquot van Ringer&#39;s toeOlivering aan de Petri-schotel om het preparaat nat te houden. </li><li> Incubeer het preparaat bij kamertemperatuur onder donkere en natte omstandigheden gedurende 5 uur. </li><li> Verwijder het vulpijpje met de oplaadoplossing, spoel het preparaat met de oplossing van de Ringer en houd het overnacht in de koelkast bij 8 ° C. </li></ol> 3. Het voorbereiden van de weefsel voor microscopie <ol><li> Monteer het preparaat in de silicium elastomeer gecoate kamer en fixeer het met stalen micro-naalden, zodat het licht uitgestrekt is. </li><li> Spoel het weefsel af met een aliquot van verse Ringer&#39;s oplossing. </li><li> Gebruik een zuigelektrode om de zenuw te stimuleren; Constructie van de elektrode is verkrijgbaar bij de gratis download van het papier door Kazakov et al. , 2015 32 . Plaats de elektrodepunt dicht bij het gesneden einde van de zenuw en zet de zenuwstomp in de elektrodeopening. </li><li> Monteer de voorbereidingskamer op de microscoopfase. PlacE de temperatuursensor en de inlaat- en uitlaatontstekingen in de kamer. </li><li> Sluit het netsnoer aan op het Peltier-element. </li><li> Om het preparaat te overbruggen, gebruik een eenvoudig zwaartekrachtgedreven systeem. Om de overtollige oplossing te verwijderen, zet de perfusie zuigpomp aan. </li><li> Schakel de thermostuureenheid in. </li><li> Stel de temperatuurregelaar in op 20 ° C. </li><li> Monteer het ultraviolette beschermingsschild. </li><li> Sluit de stimulerende draadelektrode aan op de elektrische stimulator en let op de spiercontracties onder de microscoop met een 4x objectieflens. </li><li> Vul het perfusiesysteem in met de oplossing van de Ringer met een laaggehalte van Ca 2+ en een hoge Mg 2+ -inhoud. OPMERKING: Deze oplossing wordt gebruikt om spiercontracties te voorkomen. Een afname in de concentratie van extern calcium en een verhoging van extern magnesium resulteert in de reductie van de amplitude van Ca 2+ transiënten. Echter, op basis van eerdere ervaring, 0,9 mM CaCl <sub&gt; 2 en 6 mM MgCl2 zijn nog steeds voldoende om de amplitude van Ca2 + transiënten op betrouwbare wijze op te lossen. Het is vermeldenswaard dat er nog andere manieren zijn om spiercontracties te verminderen zonder de Ca 2+ concentratie te verminderen. Bijvoorbeeld, het gebruik van d-tubocurarine of alfa-bungarotoxine, specifieke blokkers van nicotine acetylcholine receptoren, zou de spiertrekken volledig of gedeeltelijk blokkeren 17 , 27 , 28 , 30. Maar de toevoeging van deze toxinen kan ook de preynaptische calciuminvoer 33 beïnvloeden. Om dit te vermijden, kan μ-conotoxine GIIIA 27 gebruikt worden. </li><li> Schakel de pomp in en start de superfusie van het preparaat met de oplossing van de Ringer met een lage Ca 2+ en hoge Mg 2+ . </li><li> Overschakelen naar de 40 × objectieve lens op de microscoop. </li><li> Schakel t in<html> Hij monochromator (zie de Tabel van Materialen ). </li><li> Selecteer een emissiegolflengte van 488 nm en een continue verlichtingswijze in de monochromator besturingssoftware. </li><li> Bij hoge vergroting in de fluorescentiemodus moet u ervoor zorgen dat de zenuwterminals met de kleurstof geladen zijn. </li></ol><img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig1.jpg" /> Figuur 1 : Zenuw en terminals met geladen Ca 2+ indicator. ( A ) Zenuw gevuld met Ca 2+ indicator na de laadprocedure. Schaalbalk = 200 μm. ( B ) Zenuwuitgangen gevuld met Ca 2+ indicator. Schaalbalk = 20 μm. ( C ) Ca 2+ -indicator fluorescentie is duidelijk zichtbaar in de zenuwafsluiting. Schaalbalk = 20 μm._blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <ol start="17"><li> Laat het preparaat tenminste 30 minuten in evenwicht brengen in de lage Ca 2+ en hoge Mg 2+ oplossing. </li></ol> 4. Video-opname met de digitale CCD-camera Opmerking: De details van het vastleggen van fluorescentiesignalen zijn specifiek voor elk microscoop- en cameratype, maar de belangrijkste overweging is de opname snelheid. <ol><li> Gebruik 1 kHz als de minimale opnamefrequentie voor opnames van enkele Ca 2+ transiënten in de NMJ. OPMERKING: Snelle digitale CCD-camera&#39;s zijn nodig voor het imago van fluorescentie (zie de tabel van materialen ). Het gegevensverzamelingssysteem en de software (zie de tabel van materialen ) werden hier gebruikt voor de synchronisatie van de camera, monochromator en stimulator. Kortom, dit protocol maakt het mogelijk de synchronisatiepulsen te genereren op digitale uitgangen van de dataAcquisitie systeem om de sluiter te openen, het videosignaal op te nemen en stimulatie te starten. Alle temporale parameters kunnen in de protocollen en / of op de apparaten worden ingesteld. Een typisch protocol is een serie van 500 frames die zijn verkregen bij 1 kHz (80 x 80 pixels). Verlichting met excitatie licht kan de Ca2 + indicator bleken en fotodamage het celweefsel. Zo vermijd lange blootstellingen aan excitatie licht. In dit protocol is de sluiter alleen geopend voor de benodigde tijd om de video vast te leggen. Verkrijg twintig series per specifieke zenuw terminal. Het doel hiervan is om dezelfde locaties in de controlegroep en na de levering van geneesmiddelen te controleren. </li><li> Onder de 4X objectieflens van een microscoop, gebruik de helderveldregime om de spier- en zenuwtakken te visualiseren. </li><li> Schakel over naar de 40X objectieflens en zoek met behulp van het epifluorescentie regime en een excitatie golflengte van 488 nm naar kleurstofbelaste zenuwuitgangen. Identificeer een zenuw eindigend gebied van belang. </li><li> Op de trinoculaire buis oVoor de microscoop, selecteer de lichtweguitwisselingsniveaus: 100% licht naar de camera. </li><li> Start de acquisitie software voor de CCD camera. </li><li> Zoek in de modus &quot;Live&quot; de ROI en pas de focus aan. </li><li> Selecteer het menu &quot;Wijzigen&quot; instellingen. </li><li> Gebruik de &#39;Basic Configuration&#39; op 1000 frames per seconde (fps), met een resolutie van 80 x 80. </li><li> Stel het aantal invoerframes in op 500. </li><li> Voer de naam van het experiment in. </li><li> Kies &#39;Externe trigger&#39;. </li><li> Stel de pre-trigger-tijd in op 10 ms. </li><li> Stel het aantal herhalingen in op 20. </li><li> Selecteer in de monochromator besturingssoftware een emissiegolflengte van 488 nm en de &#39;externe triggerverlichting&#39; modus. </li><li> Run de data-acquisitie software. </li><li> Laad het stimulatieprotocol. </li><li> Voordat u de video opneemt, moet u het donkere frame vastleggen met behulp van de video-acquisitie software. </li><li> Voer het stimulatieprotocol uit. </li><li> Selecteer de ROI en checK het opgenomen signaal. </li></ol> 5. Data-analyse NoOTE: Voor data analyse gebruik de CCD camera software en ImageJ; De gegevens worden weergegeven als een curve in een spreadsheet programma. In de CCD-camerasoftware herhaalt en verwerkt gemiddeld 20 de resultaten naar een ImageJ-ondersteuningsbestand. Selecteer in ImageJ de ROI en de achtergrond. Trek de achtergrond van de ROI af. Vertel de gegevens als een verhouding: (ΔF / F 0-1 ) x 100%, waar is ΔF de intensiteit van fluorescentie tijdens stimulatie en F 0 de intensiteit van fluorescentie in rust is. <ol><li> Klik in de acquisitie software voor de CCD camera op Bestand&gt; Gemiddelde bestanden. Selecteer de bestanden en gemiddelde ze. </li><li> Sla het gemiddelde bestand op als een .fit bestand door op &quot;Save as Fit file&quot; te klikken. </li><li> Voer de ImageJ-software uit. Voer de volgende stappen uit: </li><li> Klik op Afbeelding&gt; aanpassen&gt; helderheid / contrast. </li><li> Klik op Afbeelding&gt; stapels&gt; tools&gt;; Stapel sorteren. </li><li> Klik op Analyse&gt; tools&gt; ROI manager. </li><li> Sleep het gemiddelde .fit-bestand naar het ImageJ-venster. </li><li> Zoom in op het raam voor een betere weergave. </li><li> Door de cursor te verplaatsen selecteert u het laatste frame en verwijdert u het (dit is het donkere frame) </li><li> Selecteer een rechthoekige ROI over het gebied dat wordt beschouwd als de achtergrond. Voeg het toe aan de ROI manager </li><li> Meet de achtergrond door op Meer&gt; Multi Measurement te klikken. Let op de MEAN. Kopieer de data, exporteer het naar een spreadsheet programma en berekén de gemiddelde waarde van de drempel voor een ratio. </li><li> Trek de drempel van de stapels af door op Process&gt; Main&gt; Subtract te klikken. Voer de gemiddelde waarde van de drempel in. </li><li> Selecteer een rechthoekige ROI rond een zenuwaansluiting. Voeg het toe aan de ROI manager. </li><li> Meet door te klikken op Meer&gt; Multi Measure. Let op de MEAN. Kopieer en exporteer het naar een spreadsheet programma. </li><li> Gemiddeld de compensatie van de signalen. OPMERKING: gebruik deEerst een paar dozen punten die basisfluorescentie tonen zonder stimulatie; Dit is de fluorescentie in rust. </li><li> Verdeel de signalen door de fluorescentie in rust. </li><li> Trek &quot;1&quot; af en vermenigvuldigd met 100%. </li><li> Plot het signaal en bereken de amplitude van de Ca 2+ transient. </li></ol>

<ol><li>Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+of+high+calcium+concentration+in+a+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal.</a> Science. 256, 677-679 (1992).</li>
<li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+calcium+trigger+neurotransmitter+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">How does calcium trigger neurotransmitter release?</a> Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).</li>
<li>Burnashev, N., Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+dynamics%2C+Ca2%2B+buffers+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy.</a> Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).</li>
<li>Schneggenburger, R., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium+and+control+of+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium and control of vesicle fusion.</a> Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).</li>
<li>Pang, Z. P., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Ca2%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+influx+and+transmitter+release+in+a+fast+CNS+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse.</a> Nature. 383, 431-434 (1996).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+during+a+single+action+potential+in+a+large+presynaptic+terminal+of+the+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem.</a> J Physiol. 506, 143-157 (1998).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).</li>
<li>Molgó, J., Mallart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Anemonia+sulcatatoxin+II+on+presynaptic+currents+and+evoked+transmitter+release+at+neuromuscular+junctions+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse.</a> Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).</li>
<li>Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+feedback+inhibition+of+acetylcholine+release+in+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).</li>
<li>Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2538708">Fluorescent indicators of ion concentrations.</a> Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20194474">How calcium indicators work.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+detection+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+transients+at+a+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction.</a> J Physiol. 505, 585-592 (1997).</li>
<li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+presynaptic+calcium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of presynaptic calcium currents.</a> Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).</li>
<li>Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dynamics+at+the+frog+motor+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Pflug+Arch+Eur+J+Phisiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal.</a> Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627302005731">The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pixel+optical+fluctuation+analysis+of+calcium+channel+function+in+active+zones+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).</li>
<li>Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRegehr%2C+WG+%22Imaging+in+neuroscience+and+development%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual</a>. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+Application+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).</li>
<li>Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+loading+with+Patch+Pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dye loading with Patch Pipettes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).</li>
<li>Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+II+and+calcium+regulate+vesicle+docking+and+the+cross-talk+between+vesicle+pools+at+the+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals.</a> J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Injection+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).</li>
<li>Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+damage+to+mouse+motor+nerve+terminals+following+oxygen%2Fglucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation.</a> Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).</li>
<li>Peng, Y. Y., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+LHRH+is+linearly+related+to+the+time+integral+of+presynaptic+Ca2%2B+elevation+above+a+threshold+level+in+bullfrog+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia.</a> Neuron. 10, 465-473 (1993).</li>
<li>Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Latrotoxin+releases+calcium+in+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).</li>
<li>Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+muscarine-induced+synaptic+depression+at+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction.</a> Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li>
<li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8893033">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li>
<li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li>
<li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://research-journal.org/en/biology-en/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).</li>
<li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li>
<li>Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li>
<li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li>
<li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11152728">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li>
<li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17182774">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li>
<li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li>
<li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12668-016-0318-6">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit document hebben we de methode voor het uitvoeren van Ca 2+ -gevoelige kleurstoflading in de zenuwuitgangen van kikker door de zenuwstomp gepresenteerd. Aan het eind van de laadprocedure hebben alle terminals in het proximale gedeelte van de zenuw significante niveaus van fluorescentie. Er is geschat dat de intra-terminale concentratie van de sonde tussen 40 en 150 μM 17 varieert. De incubatieprocedure wordt uitgevoerd in twee stappen: bij kamertemperatuur en dan bij een lagere temperatuur in de koelkast. Het is belangrijk om de tijd van weefsel incubatie met de kleurstof bij kamertemperatuur te controleren. Afhankelijk van de werkelijke lengte van de zenuwstomp, de specifieke kleurstof en de temperatuur kan de incubatietijd variëren. Als u overbelicht bent, kunnen terminals in de proximale delen dicht bij de zenuwstomp overbelast worden. In het midden van de zenuw is het echter nog steeds mogelijk om terminals te vinden die bevredigend geladen zijn. Tijdens de thEen lange incubatie in de koelkast, de kleurstof is gelijkmatig verdeeld over de zenuwuitgangen. Onze eigen waarnemingen 33 , 35 , evenals de gegevens van andere onderzoekers 30 , bewijzen dat er geen significante invloed is op de laadprocedure op de amplitude van de postsynaptische respons of op de frequentie van miniatuur eindplaatpotenties. Goede levensduur werd gedocumenteerd in de geladen voorbereidingen. Er zijn enkele belangrijke punten waaraan we aandacht willen vestigen. Het is essentieel om de zenuwstomp in de kleurstofoplossingsoplossing binnen een paar minuten na de excisie te plaatsen om de kleurstof in de axonen van de gesneden zenuw in te gaan. Vertragingen kunnen ondoeltreffend laden veroorzaken, vermoedelijk door de wederopening van zenuwassons 27 , 36 . Sommige onderzoekers dompelen de zenuwstomp in 100 mM EDTA (een Ca 2+ - en Mg 2+ -chelator) Onmiddellijk na het uitsnijden van de zenuw om te voorkomen dat de gesneden axonen opnieuw worden afgesloten. De buffer wordt na 1-2 minuten verwijderd en vervangen door een kleurstofoplossingsoplossing 37 . Het gebruik van een petroleumgelputje in plaats van plastic buizen voor de laadprocedure maakt het gebruik van een kortere zenuwstomp mogelijk. Tijdens het gebruik van deze aanpak wordt de zenuw gesneden nadat het in de HEPES-oplossing met kleurstof is gedompeld, en de axonen worden niet teruggeteld door het gebrek aan tweewaardige ionen in de kleurstofoplossing 27 , 28 . In onze studie gebruikte we de in water oplosbare zoutvorm van de Ca 2+ indicator in plaats van dextran. De dextranconjugaten diffunderen langzamer in de axon dan de zoutvormen. Echter, het gebruik van het dextranconjugaat vermindert kleurstofcompartmentalisatie en behandeling door de zenuw en NMJ&#39;s. Calcium Groen 1-3000 MW dextran conjugaat heeft een goede diffusie snelheid en demonstreert verminderde compartimentalisatie <s<html> Up class = &quot;xref&quot;&gt; 38. Het is erg belangrijk om een ​​lang periode van fluorescerende verlichting van het weefsel te vermijden, omdat dit de gezondheid en het overleven beïnvloedt. We gebruiken Nomarski-optica in het zichtbare lichtkanaal om te zoeken naar zenuwterminals. Tijdens de opname beperken we het verlichte veld met behulp van een diafragma. Het is opmerkelijk dat deze laadmethode alleen geschikt is voor preparaten die lange incubaties kunnen weerstaan. Om de kleurstof te beperken wanneer studies worden uitgevoerd op meer kwetsbare weefsels ( bijv. Synaptes van warmbloedige dieren), is het nodig om de zenuwstomplengte te verkleinen en micropipetten te gebruiken voor het laden van 29 , 39 . Deze laadtechniek is goed geschikt voor beeldvormende veranderingen in cytosolische Ca 2+ , met fluorescentie-indicatoren onder zowel enkel-zenuwstimulatie als ritmische synaptische activiteitEf &quot;&gt; 17 , 27 , 35. De analyse van de Ca 2+ transient amplitude kan gebruikt worden om de invloed van verschillende stoffen op de calciuminvoer te onderzoeken die deelneemt aan neurotransmitter vrijgave 33 .

Calciumionen (Ca 2+ ) nemen deel aan veel neuronale signaleringsprocessen, inclusief de initiëring, onderhoud en plasticiteit van mediator release 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Bij de komst van het actiepotentiaal komt extracellulaire Ca 2+ in de zenuwterminal en begint de vrijgave van neurotransmitter. In sommige synapses kan de calciumstroom direct met behulp van elektrofysiologische methoden 6 , 7 , 8 worden gemeten. In het geval van de neuromusculaire verbinding (NMJ) kan men geen directe patch klemmen en twee-elektrode spanningsklemtechnieken gebruiken door de minutengrootte van de zenuwuitgangen. Opnamen van inwendige Ca 2+ stromen van de zenuwuitgangen in de NMJ kunnen worden gedaan door indirecte elektrofielenIologische methoden 9 , 10 . Deze methoden vereisen echter de voorbehandeling van de synaps door natrium- en kaliumionkanaalblokkers. Optische methoden vereisen geen farmacologische scheiding van ionische stromingen in de zenuwterminal en laten opnamen van Ca 2+ -toevoer toe, veroorzaakt door actiepotenties en de daaropvolgende verhoging van Ca 2+ ionen in de axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Deze methoden zijn gebaseerd op opnames van veranderingen in de fluorescentie van specifieke Ca 2+ -gevoelige kleurstoffen bij de binding van vrije Ca 2 + ionen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Ca 2+ indicatoren kunnen in de c worden geladenElls door een verscheidenheid aan methoden, afhankelijk van het doel van het experiment. Onderzoekers gebruiken de badtoepassing van membraandoorlaatbare kleurstofvormen 20 , 21 , laden via patchpipette 22 of microinjectie 23 , 24 , 25 . Echter, al deze methoden hebben enkele beperkingen in het geval van de NMJ vanwege zijn eigenaardigheden in synaptische architectonica. Voor de NMJ is de meest geschikte en succesvolle methode de kleurstof door de zenuwstomp, een voorvulmethode 26 , 27 , 28 , 29 te laden . Deze techniek kan gebruikt worden voor het laden van verschillende fluorescentie-kleurstoffen in de perifere zenuwuitgangen. Deze methode is succesvol gebruikt voor Drosophila zenuwterminals 28 , de hagedis motorische zenuw28 en kikkermotor zenuwterminals 17 , 26 , 27 , 30 . Afhankelijk van het onderzochte object kunnen methodische details variëren. Een glazen micropipet kan worden gebruikt voor kleine zenuwen van larven 28 . Verscheidene onderzoekers hebben een methode beschreven 27 , 28 waarin een vers gesneden einde van de zenuw die een spier binnentreedt, wordt gedompeld in een put die vooraf met een kleurstof wordt gevuld. De voorbereiding wordt vervolgens enkele uren gelaten om de kleurstof te laten ontdoen. De kleurstof wordt door de axonen doordrenkt en naar de zenuwterminals vervoerd. In dit artikel beschrijven we een methode om een ​​fluorescentie-indicator in te laden in kikkermotor zenuwterminals via de zenuwstomp. Ons protocol maakt gebruik van een plastic pipet tip voor de incubatie van het weefsel met een kleurstof. We beschrijven ook hoe Ca 2+ fluorescentie tra te verwerven en analyserennsients.

<table><tbody><tr><td>Ca2+ indicator</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806</td><td>500 &mu;g</td></tr><tr><td>Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning, USA</td><td>Sylgard 184 elastomer</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Biohit, Russia</td><td>720210</td><td>0.5-10&micro;L</td></tr><tr><td>Pipette tip</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>02-707-175</td><td>10&micro;L</td></tr><tr><td>Pipette tip</td><td>Biohit, Russia</td><td>781349</td><td>10&micro;L</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine scince tools, Canada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Corneal Mini-Scissors</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>S-1111</td><td></td></tr><tr><td>Jeweler Forceps</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>F-9610</td><td></td></tr><tr><td>Jeweler Forceps</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>F-9611</td><td></td></tr><tr><td>Modelling clay</td><td>local producer</td><td></td><td>kan worden vervangen door elke lokale producent</td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>local producer</td><td></td><td>kan worden vervangen door elke lokale producent</td></tr><tr><td>Microspin FV 2400&nbsp;</td><td>Biosan, Letland</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Multi-spin MSC 3000</td><td>Biosan, Letland</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermische naalden voor eenmalig gebruik</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0.4&times;40mm</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>local producer</td><td></td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Microscoop, BX51</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data-acquisitiesysteem&nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Digitdata 1550</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>pClamp software, versie 10</td><td>protocol kan worden gedownload van: http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td></tr><tr><td>Bad- en badtemperatuurregelaar</td><td>Experiment Builder</td><td></td><td>kan worden vervangen door elke kamer met temperatuurregeling. Bijvoorbeeld van https://www.warneronline.com/&nbsp;</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Till Photonics, Duitsland</td><td>Polychrome V</td><td>niet langer beschikbaar, kan worden vervangen door een andere&nbsp;&nbsp; geschikte stabiele lichtbron 488 nm</td></tr><tr><td>Monochromator besturingssoftware</td><td>Till Photonics, Duitsland</td><td>Polycon</td><td></td></tr><tr><td>Digitale CCD-camera</td><td>Redshirt imaging, USA</td><td>Neuro CCD SMQ</td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 Isolated Pulse Stimulator</td><td>A-M Systems, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisitiesoftware voor CCD-camera</td><td>Redshirt imaging, USA</td><td>Turbo SM software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Spreadsheetprogramma</td><td>Microsoft, USA</td><td>Microsoft Office Excel&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: calcium transient registratie in de kikker neuromusculaire junction

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Een van de meest haalbare methoden voor het meten van presynaptische calciumniveaus in presynaptische zenuwterminals is optische opname. Het is gebaseerd op het gebruik van calciumgevoelige fluorescerende kleurstoffen die hun emissieintensiteit of golflengte veranderen afhankelijk van de concentratie van vrij calcium in de cel. Er zijn verschillende methoden gebruikt om cellen met calciumkleurstoffen te vlek. Meest voorkomend zijn de processen om de kleurstoffen te laden door middel van een micropipet of pre-incubatie met de acetoxymethylestervormen van de kleurstoffen. Deze methoden zijn echter niet goed van toepassing op neuromusculaire kruispunten (NMJ&#39;s) als gevolg van methodologische problemen die zich voordoen. In dit artikel presenteren we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp van de kikkernauw in de zenuwuitgangen. Aangezien de invoer van extern calcium in zenuwterminals en de daaropvolgende binding aan de calciumverf binnen de milliseconde tijdschaal plaatsvinden, is het nodig om een ​​snel beeldvormingssysteem te gebruiken om deze interactie te registrerenNS. Hier beschrijven we een protocol voor het opnemen van het calcium transient met een snelle CCD camera.

Na het laden van de kleurstof en bij motorische zenuwstimulatie kan een toename van de amplitude van het fluorescerende signaal (Ca 2+ transiënt) worden gedetecteerd in de zenuwterminals (zie Figuur 2 ). Parameters van Ca 2+ transiënten worden weergegeven in Tabel 1 . Kwantitatief zijn de parameters van de Ca 2+ transiënten gemeten in onze studie dicht bij de gegevens verkregen door andere wetenschappers bij synaptes van koudbloedige dieren 15 , 34 . De parameters van de Ca 2+ transienten zijn afhankelijk van de bindingssnelheid van Ca 2+ met de kleurstof en de daaropvolgende dissociatie. De toedieningssnelheid van Ca 2+ in de zenuwuitgang, de interactie met de kleurstof en diffusie in het cytoplasma beïnvloeden allemaal de stijgtijd van de Ca 2+ transient. De vervalstijd van het fluorescerende signaal hangt af van de affiniteit van de kleurstof,De snelheid van de Ca 2+ interactie met intracellulaire buffers en de verwijdering door ionpompen 35 . De amplitude analyse van Ca 2+ transiënten kan worden gebruikt om de invloed van verschillende stoffen op de calciuminvoer te onderzoeken die deelneemt aan neurotransmitter vrijgave 33 . <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" /> Figuur 2 : De gemiddelde Ca 2+ Voorbijgaande gemeten in de kikker NMJ. De Ca 2+ transient werd berekend op basis van het gemiddelde van signalen van 13 kikker NMJ&#39;s. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> HoogtepuntΔF / F (%) </td><td> Stijgingstijd 20% -80% (ms) </td><td> Τ (ms) </td></tr><tr><td> 12,6 ± 1,1 (n = 13) </td><td> 4,6 ± 0,5 (n = 13) </td><td> 115,3 ± 8,3 (n = 13) </td></tr></tbody></table> Tabel 1: De gemiddelde parameters van de Ca 2+ transient. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SE; N is het aantal metingen in verschillende NMJ&#39;s. De piek ΔF / F is de gemiddelde amplitude van ΔF / F.

Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Hallo, mijn naam is Dimitry Samigullin en ik werk in het laboratorium voor Biofysica van Synaptische Processen van het Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics van de Russische Academie van Wetenschappen. In ons laboratorium bestuderen we diverse manieren van calciumsignalering in de neuromusculaire overgang. Een van de meest toegankelijke methoden om het synaptische calciumgehalte te meten, is optische registratie.Hier beschrijven we de methode voor het laden van een calciumsensitieve kleurstof in zenuwuiteinden van de kikker via een zenuwstomp. Daarnaast presenteren we het protocol voor het meten en analyseren van een grote calciumtransiënt in zenuwuiteinden van de kikker. Met deze methode is het mogelijk om de invloed van actieve geneesmiddelen op het presynaptische calciumniveau tijdens synaptische activiteit te bestuderen.Bereiding van de kleurstoflaadoplossing. De calciumkleurstof Fluoresceïne Oregon Green BAPTA wordt geleverd als 500 micrograms poeder in een volume van 500 microliters. Voeg 14 microliters van de oplossing, die HEPES bevat, toe aan het poeder.Vortex de laadoplossing en centrifugeer kort om deze grondig te mengen. Wikkel het flacon met de laadoplossing in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Bewaar de laadoplossing bij -20 °C in een vriezer.Procedure voor het laden van kleurstof. Disseceer een cutaneous pectoris-spier uit het dier. Plaats het gedissecteerde weefsel in een zilveren gepolijste Petrischaal.Span het weefsel op met fijne roestvrijstalen pinnen. Voeg Ringer-oplossing toe aan de Petrischaal. Snijd met een scheermesje een klein stukje, ongeveer 2 millimeter, van de dunne zijde van de buis van de tien microliters pipet uit.Bereid een stukje plasticine voor om de vulpipet op de Petrischaal te bevestigen. Verbind de vulpipet met een plastic spuit via een siliconen slang en adapters gemaakt van pipetbuisjes. Verwijder de tijdelijke Ringer-oplossing uit de Petrischaal met een plastic pipet.Droge preparatie met een spuit. Dit voorkomt het opzuigen van de oplossing in de vulpipet. Haal het vial met laadoplossing uit de vriezer en laat het ontdooien bij kamertemperatuur op een donkere plaats.Knip met een fijne pincet en schaar, onder visuele controle met een steriele microscoop, de zenuw dicht bij de spier door. Laat een zenuwstomp van ongeveer twee millimeter achter. Fixeer de vulpipet met een buisje en de spuit op de Petrischaal met behulp van plasticine.Breng het dicht bij de zenuwtak. Aspireer de zenuwstomp voorzichtig in de vulpipet. Verwijder de zuigbuis uit het stompe uiteinde van de vulpipet.Droog de zenuwstomp in de vulpipet met de spuit. Beweeg de vulpipet met de zenuwstomp omhoog. Isoleer de zenuwstomp aan de buitenzijde met Vaseline.Droog de zenuwstomp in de vulpipet nogmaals met de spuit. Trek 0,5 µL laadoplossing op met een pipet met een lange pipetpunt. Voeg de pipetpunt met de laadoplossing voorzichtig toe aan de vulpipet.Injecteer het mengsel direct in de zenuwstomp. Afdichten het open uiteinde van de vulpipet met Vaseline. Voeg een kleine hoeveelheid oplossing toe aan de Petrischaal.Incubeer het preparaat gedurende vijf uur bij kamertemperatuur op een donkere en vochtige plaats. Verwijder na de incubatie de vulpipet met de laadoplossing uit het preparaat. Plaats het preparaat in een bad en spoel het uit met Ringers oplossing.Bewaar het bad met het preparaat een nacht in een koelkast bij een temperatuur van 8 °C. Bereid het weefsel voor op microscopie. Haal het preparaat uit het bad.Bevestig de preparatie in een zilvergevoerde kamer en rek het weefsel lichtjes uit. Spoel het weefsel met verse Ringersoplossing. Neem de zuigstimulatie-elektrode.Plaats de stimulatie-zuigelektrode in de kamer met de punt dicht bij het doorgesneden uiteinde van de zenuw. Trek de zenuw naar de elektrode toe. De constructie van de elektrode wordt beschreven in het artikel van Khazokoff; een link naar het artikel staat bij de materialen.Bevestig de preparatiekamer op de microscooptafel. Plaats de temperatuurprobe. Sluit de instroombuizen aan en sluit het Peltier-element in de preparatiekamer aan op de stroomvoorziening.Plaats de uitstroombuis in de preparatiekamer. Zet de perfusiepomp aan. Schakel de temperatuurregelaar in.Stel de temperatuur op de controllerunit in om 20 °C te bereiken. Installeer het ultravioletbeschermingsschild. Stel de vertragingsduur en de periode in op de stimulator.Verbind een draad van de zuigelektrode met de stimulator. Zet deze aan. Controleer onder een objectief met lage vergroting de spiercontractie door de stimulus in te schakelen.Vul het perfusiesysteem met een Ringer-oplossing met een laag calciumgehalte en een hoog magnesiumgehalte. Stel de perfusiesnelheid in op ongeveer twee milliliter per minuut. Vervang het objectief door een met 40-voudige vergroting.Schakel de emissiegolflengte en de continue verlichtingsmodus van de Polychrome V.Select in. Open de sluiter. Controleer onder een objectief met 40-voudige vergroting, bij fluorescentieverlichting, of de terminals zijn geladen.Zoek het axonale uiteinde en focus hierop. Het geladen zenuwuiteinde en de goed geladen motorische zenuwuiteinden zijn in de figuur weergegeven. Videocapture met Red-Short Neuro CCD Camera.Start de Turbo-SM software. Selecteer 'Change Settings'. Voer 500 in als aantal frames.Voer de naam van het experiment in. De basisconfiguratie is 1000 frames per seconde. 80 bij 80.Kies de externe trigger. Voer de pre-trigger tijd in. Min tien milliseconden.Voer het aantal herhalingen in, 20. Selecteer in de Polychrome-software de externe trigger-verlichtingsmodus. Start de Clampex-software.Laad het stimuleringsprotocol. Het protocol is beschikbaar voor download op de labpagina van de website van de Kazan Federal University. Leg vóór de opname een dark frame vast in de Turbo-SM software.Select op de trinoculaire kubus de niveaus voor de uitwisseling van het lichtpad. 100 procent voor de camera. Voer het stimulatieprotocol uit.Selecteer het interessegebied en controleer het signaal. Als reactie op de zenuwstimulatie registreren we de verandering in fluorescentie-intensiteit, wat de calciuminstroom in het zenuwuiteinde weerspiegelt. Gegevensanalyse.Selecteer in de Turbo-SM software 'file'. Selecteer vervolgens 'average files'. Selecteer de bestanden.Voer de naam van het gemiddelde bestand in en bereken het gemiddelde. Sla het gemiddelde bestand op als fit-bestand. Selecteer en sla op als fit-bestand.Voer de bestandsnaam in en sla deze op. Start Image J en open de volgende instrumenten: Analyse, tools, ROI Manager.Zoek het opgeslagen gemiddelde bestand in fit-formaat. Sleep en laat het bestand los in Image J. Zoom in op het venster voor een beter zicht. Selecteer een rechthoekig interessegebied over het gedeelte dat u als achtergrond beschouwt.Voeg dit toe aan de ROI-manager. Selecteer in de ROI-manager 'more' en vervolgens 'Multi-measure'. Download de gemiddelde waarden.Kopieer de gegevens en exporteer deze naar Excel. Gebruik in Excel de gemiddelde-functie om de gemiddelde waarde van de achtergrond voor een ratio te berekenen. Keer terug naar Image J zonder Excel te sluiten. Sluit het venster met de achtergrondberekening zonder op te slaan.Gebruik de ROI Manager om de rechthoekige achtergrondtekening te verwijderen. Open instrument process, math, subtract. Voer de berekende gemiddelde drempelwaarde uit Excel in en trek de achtergrond af van de stacks.Selecteer een rechthoekig interessegebied rond een zenuwuiteinde. Voeg dit toe aan de ROI Manager. Selecteer in de ROI Manager vervolgens: more, Multi-measure, load down, mean.Kopieer en plak in het Excel-venster. Gebruik de instrumentplotgrafiek van Excel. Selecteer een vlak gebied voordat het signaal begint.Vul de grafiek met de gegevens van de eerste fluorescentiewaarden in rust tot aan het begin van het signaal. Bepaal vervolgens het aantal punten om de fluorescentiewaarden in rust te middelen. Bereken het gemiddelde van deze waarden en bepaal vervolgens de gemiddelde fluorescentiewaarde in rust.Deel de signalen door de fluorescentie in rust. Trek er één vanaf en vermenigvuldig dit met 100 procent. Zet het signaal uit en bereken de amplitude van de calciumtransiënt.De tijdsparameters van fluorescentiesignalen zijn afhankelijk van de snelheid van de voorwaartse en/of omgekeerde reacties bij de vorming van het calcium-kleurstofcomplex. De stijgtijd van het calciumsignaal representeert de dynamiek van de calciuminstroom. Dit betreft de diffusie in de terminal en de interactie van calcium met de kleurstof.Het verval van de calciumtransiënt is afhankelijk van de affiniteit van de kleurstof en de snelheid van calciumbuffering en de terugtrekking daarvan. Analyse van de amplitude van de calciumtransiënt kan worden gebruikt om de invloed van verschillende actieve stoffen te bestuderen op de calciuminstroom die betrokken is bij de afgifte van neurotransmitters. Deze ladingstechniek is zeer geschikt voor het beelden van veranderingen in het cytosolische calcium.Met fluorescentie-indicatoren en zowel enkelvoudige zenuwstimulatie als rytmische synaptische activiteit kan de analyse van de amplitude van calciumtransiënten worden gebruikt om de invloed van verschillende stoffen op de calciuminstroom die bij de afgifte van neurotransmitters betrokken is, te bestuderen. Er zijn enkele belangrijke punten waar we aandacht aan willen besteden.De incubatieprocedure bestaat uit twee stappen: incubatie bij kamertemperatuur en incubatie in een koelkast. Het is belangrijk om de incubatietijd met de kleurstof bij kamertemperatuur nauwkeurig te controleren.Afhankelijk van de lengte van de zenuwstomp, de kleurstof en de temperatuur in de kamer, kan de incubatietijd variëren. Bij overbelichting kunnen de preoperatieve terminalen en proximale delen, dicht bij de zenuwstomp, overbelast raken. Door de lange incubatie in de koelkast wordt de kleurstof gelijkmatig verdeeld over de zenuwuiteinden.Het is essentieel om de zenuw binnen enkele minuten na het doorsnijden in de kleurstoflaadoplossing te plaatsen, zodat de kleurstof de zenuw kan binnendringen, aangezien langere tijdsintervallen leidden tot een ineffectieve lading, vermoedelijk door het sluiten van de ontvangende zenuw. Om compartimentering van de kleurstof te verminderen, is het mogelijk om de verlengde vorm van de kleurstof te gebruiken. Het is zeer belangrijk om langdurige fluorescente belichting van het weefsel te voorkomen, omdat dit de overleving ervan beïnvloedt.We gebruiken Nomarski-optiek in het kanaal voor zichtbaar licht om de terminals te zoeken. Tijdens de opname beperken we het verlichte gezichtsveld met het diafragma. De lange duur van het laadproces kan worden verkort door gebruik te maken van een shutter-stamp van de zenuw.In dit geval kan een glazen micro-bypass worden gebruikt.

loading-calcium-dye-into-frog-nerve-endings-through-nerve-stump

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Calcium is een alomtegenwoordige boodschapper in het zenuwstelsel, essentieel voor het activeren van vrijkomen van neurotransmitters en veranderingen in de synaptische sterkte. Hier laten we zien een techniek voor het laden van Ca 2 +-indicatoren in Drosophila zenuwuiteinden. We tonen ook aan de fabricage van de benodigde apparatuur en benadrukken punten van cruciaal belang voor het succes van de techniek is.

Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren

Hier presenteren we de methodologie voor een snelle en hoge resolutie tl-voltage-gevoelige kleurstof in beeld brengen van gedetailleerde activiteit van neuronen in de krab stomatogastric ganglion.

Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

Wij beschrijven een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen hoge concentratie van fluorescerende en calcium-gevoelige kleurstoffen in neuronen of neuronale kanaal met een polyethyleen zuig pipet.

Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen

In this video, Drosophila larvae nerve fibers are immersed in FM dye, which binds to cell membrane lipids. Suction microelectrode and electrical pulses stimulate the endocytosis process, incorporating the FM dye into newly formed endocytic vesicles. This method, which visualizes presynaptic stages of neurotransmission, is useful for studying synaptic function and neurotransmitter release.

Microelectrode-Mediated FM Dye Loading and Unloading in Drosophila Larvae Nerve Cells

Source: Heredia, D. J., et. al. Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates fluorescence imaging of calcium dynamics at neuromuscular junctions (NMJs) in a transgenic mouse expressing genetically encoded calcium indicators. A NJM is identified by fluorescently tagged acetylcholine receptors in the diaphragm with the phrenic nerve. An image splitter is used to visualize multiple signals...

Fluorescence Imaging of Calcium Dynamics at Neuromuscular Junctions in the Diaphragm of a Transgenic Mouse

Source: Zhilyakov, N. V. et. al., Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the imaging technique of recording fast calcium transients at nerve endings using confocal microscopy. By stimulating the nerve and capturing fluorescence changes from calcium-binding dyes, it visualizes dynamic calcium influx and clearance at the nerve ending, offering precise insights into...

Imaging Fast Calcium Transients in Mouse Nerve Endings Using Confocal Microscopy

Het enterische zenuwstelsel (EZS) is een netwerk van neuronen en gliacellen in de darmwand dat intestinale reflexen controleert. Dit protocol beschrijft methoden voor het opnemen van de activiteit van enterische neuronen en gliacellen in levende bereidingen van EZS met behulp van Ca2+ beeldvorming.

In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel

Hier beschrijven we een protocol voor het meten en analyseren van temperatuurresponsen in de reukbol van Xenopus laevis. Reukreceptorneuronen en mitralvormige cellen worden differentieel gekleurd, waarna calciumveranderingen worden geregistreerd, wat een gevoeligheid aangeeft van sommige neurale netwerken in de bol voor temperatuurdalingen die in de neus worden geïnduceerd.

Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em&gt; Xenopus laevis</em

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Het protocol beschrijft de methode om een fluorescerende calciumkleurstof door de gesneden zenuw in de motorische zenuwuiteinden van de muis te laden. Daarnaast wordt een unieke methode gepresenteerd voor het registreren van snelle calciumtransiënten in de perifere zenuwuiteinden met behulp van confocale microscopie.

Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie

Leer een methode om calciumgevoelige kleurstoffen via een zenuwstomp in kikkerzenuwuiteinden te laden. Dit protocol maakt optische registratie van snelle calciumtransiënten mogelijk voor onderzoek naar synaptische signalering.

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction (Video) | JoVE Journal

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

Meer video's verkennen