Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction
8 juli 2017
Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.
Hallo, mijn naam is Dimitry Samigullin. Ik werk in het laboratorium voor Biofysica van Synaptische Processen van het Kazan Instituut voor Biochemie en Biofysica, de Russische Academie van Wetenschappen. In ons laboratorium bestuderen we uiteenlopende manieren van calciumsignalering in de Neuromusculaire Junctie. Een van de meest toegankelijke methoden om het synaptische calciumniveau te meten is een optische registratie.
Hier beschrijven we de methode van het laden van een calciumgevoelige kleurstof, via een zenuwstomp, in de kikkerzenuwende. Ook presenteren we het protocol om een grote calciumtransient in kikkerterminals te meten en te analyseren. Met behulp van deze methode is het mogelijk om de invloed van actieve geneesmiddelen op het presynaptische calciumniveau tijdens synaptische activiteit te bestuderen.
Bereiding van de kleurstofoplossing. Fluoresceine's Calciumkleurstof Oregon Green BAPTA, komt in 500 microliters via een kleine hoeveelheid 500 microgram poeder. Voeg 14 microliters oplossing toe, bevattende HEPES, aan het poeder.
Vortex de laadoplossing en centrifugeer om grondig te mengen. Wikkel de flacon met de laadoplossing in folie om blootstelling aan licht te voorkomen. Bewaar de laadoplossing op min 20 graden Celsius in een vriezer.
Kleurstofopladende procedure. Disseceer een cutaneus pectoris spier van het dier. Monteer het gedissecteerde weefsel in een zilver gevoerde Petri-schaal.
Rek het weefsel uit met fijne roestvrijstalen pinnen. Voeg Ringer's oplossing toe aan de Petri-schaal. Gebruik een scheermes om een klein stukje, ongeveer 2 millimeter van de tien microliters pipettenbuis vanaf het dunne uiteinde te snijden.
Bereid een stukje plasticine voor om de vulpijp op de Petri-schaal vast te houden. Verbind de vulpijp met een plastic spuit door middel van een siliconenbuis en adapters gemaakt van pipettenbuizen. Verwijder tijdelijk Ringer's oplossing uit de Petri-schaal met een plastic pipet.
Droog de voorbereiding met een spuit. Dat voorkomt dat de oplossing in de vulpijp wordt gezogen. Haal de flacon met laadoplossing uit de vriezer en laat deze op kamertemperatuur op een donkere plaats ontdooien.
Met een fijne pincet en schaar, onder visuele controle, met een steriele microscoop, snij de zenuw dichtbij het spier. Laat ongeveer twee millimeter zenuwstomp over. Bevestig de vulpijp met een buis en de spuit op de Petri-schaal met behulp van plasticine.
Breng het dicht bij de zenuwtak. Aspirant de zenuwstomp voorzichtig in de vulpijp. Verwijder de aanzuigbuis vanaf het stompe uiteinde van de vulpijp.
Droog de zenuwstomp in de vulpijp met de spuit. Beweeg de vulpijp met de zenuwstomp omhoog. Isoleer de zenuwstomp van buitenaf met vaseline.
Nogmaals droog de zenuwstomp in de vulpijp met de spuit. Trek de nulpunt vijf microliters laadoplossing op met een pipet met een lange pipettip. Plaats voorzichtig de pipettip met de laadoplossing in de vulpijp.
Spuit het mengsel direct in de zenuwstomp. Verzegeld de open uiteinden van de vulpijp met vaseline. Voeg een kleine hoeveelheid oplossing toe aan de Petri-schaal.
Incubeer de voorbereiding bij kamertemperatuur in een donkere en natte locatie gedurende vijf uur. Na de incubatieprocedure, neem de voorbereiding en verwijder de vulpijp met de laadoplossing. Plaats de voorbereiding in een bad en spoel het uit met Ringer's oplossing.
Bewaar het bad met de voorbereiding een nacht in een koelkast op een temperatuur van acht graden Celsius. Bereid het weefsel voor voor microscopie. Neem de voorbereiding uit het bad.
Monteer de voorbereiding in een zilver gevoerde kamer en rekt het weefsel lichtjes uit. Spoel het weefsel met verse Ringer's oplossing. Neem de zuigstimulatie-elektrode.
Plaats de stimulatiezuigingselektrode in de kamer met de punt dicht bij het gesneden uiteinde van de zenuw. Trek de zenuw naar de elektrode. De constructie van de elektrode wordt beschreven in het artikel van Khazokoff, een link naar het artikel staat in de materialen.
Bevestig de voorbereidingskamer op de microscoopstandaard. Plaats de temperatuurvoeler. Verbind de instroombuizen in een netsnoer voor Peltier-element in de voorbereidingskamer.
Plaats de uitstroombuis in de voorbereidingskamer. Zet een perfusiepomp aan. Schakel de temperatuurregelaar eenheid in.
Stel de temperatuur op de regelaar eenheid in op 20 graden Celsius. Installeer een ultravioletbeschermingsschild. Stel de vertragingsduur en de periode in op de stimulator.
Verbind een draad van de zuigelektrode met de stimulator. Zet het aan. Controleer onder een laag vergrotingsobjectief de spiercontractie door de stimulus aan te zetten.
Vul het perfusiesysteem met een Ringer's oplossing met laag calcium en hoog magnesium. Stel de perfusiesnelheid in op ongeveer twee milliliters per minuut. Vervang de objectief voor 40 maal vergroting.
Schakel de Polychrome V aan. Selecteer emissiegolflengte en continue modus verlichting. Open de sluiter. Zorg eronder voor dat de terminals zijn geladen met een 40 maal vergroting objectief in de fluorescentiemodus.
Zoek de terminal en focus erop. De geladen zenuw en goed geladen motorische zenuwterminals worden weergegeven op de figuur. Video-opname met Red-Short Neuro CCD Camera.
Start Turbo-SM Software. Selecteer, wijzig instellingen. Voer het aantal frames in, 500.
Voer de experimentnaam in. Basisconfiguratie is 1000 frames per seconde. 80 bij 80.
Kies externe trigger. Voer de pre-triggertijd in. Min tien milliseconden.
Voer het aantal herhalingen in, 20. Selecteer in de Polychrome software de externe triggerverlichtingsmodus. Start Clampex software.
Laad het stimulatieprotocol. Het protocol is beschikbaar om te downloaden vanaf onze labpagina op de website van de Kazan Federal University. Voordat u begint met opnemen, neemt u een donkere frame in Turbo-SM software.
Selecteer op de trinocular kubus de wisseling van lichtpadniveaus. 100 procent voor camera.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof in zenuwuiteinden van kikkers via een zenuwstomp. Daarnaast wordt er een protocol beschreven voor het registreren en analyseren van snelle calciumtransiënten in deze perifere zenuwuiteinden.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Calciumsignalering
Achtergrond
- Calciumsignalering speelt een cruciale rol bij de synaptische transmissie.
- Optische registratiemethoden zijn effectief voor het meten van calciumgehaltes op synaptisch niveau.
- Het begrijpen van de calciumdynamiek kan helpen bij het verduidelijken van de effecten van geneesmiddelen op de synaptische activiteit.
- Neuromusculaire juncties van kikkers dienen als model voor het bestuderen van deze processen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het laden van calciumgevoelige kleurstoffen in zenuwuiteinden.
- Het vaststellen van een protocol voor het meten van calciumtransiënten als reactie op zenuwstimulatie.
- Het faciliteren van de studie naar de effecten van geneesmiddelen op presynaptische calciumspiegels tijdens synaptische activiteit.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een calciumkleurstof-laadoplossing met gebruik van Oregon Green BAPTA.
- Dissectie en montage van kikkerspierweefsel voor de applicatie van de kleurstof.
- Gebruik van een vulpipet om de kleurstof in de zenuwstomp te laden.
- Registratie van fluorescentieveranderingen als reactie op zenuwstimulatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle belading van de calciumgevoelige kleurstof in zenuwuiteinden van kikkers.
- Observatie van snelle calciumtransiënten tijdens synaptische activiteit.
- Vaststelling van een protocol voor het analyseren van calciumdynamiek in zenuwterminalen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode voor het bestuderen van drugseffecten op calciumsignalering.
Conclusies
- De ontwikkelde methode maakt effectieve belading en meting van calciumsignalen in zenuwuiteinden van kikkers mogelijk.
- Deze aanpak kan ons begrip van synaptische mechanismen en interacties tussen geneesmiddelen verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol om diverse aspecten van calciumsignalering in de neurowetenschappen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Kwantitatieve meting van presynaptische calciumtransiënten is cruciaal voor het verminderen van risico's bij vroege neurobiologische targets en het valideren van mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische transmissie. Dit protocol maakt een precieze optische registratie van calciumdynamiek in neuromusculaire juncties van kikkers mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van target-engagement en farmacologische modulatie. Deze aanpak versterkt de translationele continuïteit van discovery-biologie naar preklinische beoordeling van de synaptische functie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de presynaptische calciuminstroom tijdens neurotransmissie mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de door geneesmiddelen geïnduceerde modulatie van de calciuminstroom te kwantificeren.
- Faciliteert functionele targetvalidatie in ziekterelevante synaptische systemen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare workflow voor het laden van calciumgevoelige kleurstoffen in zenuwuiteinden.
- Levert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen die geschikt zijn voor de comparatieve evaluatie van verbindingen.
- Stelt assaycondities vast voor detectie van calciumtransiënten met een hoge temporele resolutie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door functionele synaptische responsen te meten.
- Maakt continuïteit mogelijk van in vitro-ontdekking naar preklinische modellen van neuromusculaire functie.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve synaptische eindpunten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar prekliniek door hypothesegedreven testen van synaptische calciumdynamiek en farmacologische interventies mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt het toetsen van de nulhypothese met betrekking tot de effecten van geneesmiddelen op de presynaptische calciuminstroom.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve fluorescentiemetingen voor de ontwikkeling van assays.
- Analytics: Biedt gegevens met een hoge temporele resolutie voor statistische vergelijking van experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische bevindingen en preklinische neuromusculaire modellen.
- Hergebruik in de Organisatie: Biedt een herbruikbaar protocol voor diverse synaptische en neuromusculaire onderzoekstoepassingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van synaptische targets en mechanistische studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert het laden van kleurstoffen en beeldvorming voor reproduceerbare, schaalbare workflows.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door functionele synaptische responsen op kandidaatverbindingen te kwantificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuromusculaire en synaptische targets mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neurofysiologie, fluorescentie-imaging en kwantitatieve data-analyse.
- Vereist toegang tot snelle CCD-camera's, fluorescentiemicroscopen en analysesoftware.
- Noodzaak van strikte timing en temperatuurbeheersing tijdens het laden van de kleurstof en de incubatie.
- De selectie van het region-of-interest en de achtergrondsubtractie moeten worden gestandaardiseerd voor de vergelijkbaarheid van de gegevens.
- Zorgvuldige behandeling van weefsel en minimalisering van fototoxiciteit zijn essentieel voor de integriteit van de gegevens.
