Name: Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Leer de productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcel-sferoïden onder xeno-vrije omstandigheden. Deze methode verbetert celretentie en functionaliteit voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door grant P40RR17447 van het National Institute of Health en award RP150637 van het Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We willen Dr. Darwin J. Prockop bedanken voor zijn steun aan het project.

<ol><li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+New+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: New directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li>
<li>English, K., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation+rejection+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance.</a> Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).</li>
<li>Le Blanc, K., Mougiakakos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+and+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system.</a> Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).</li>
<li>Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Paracrine+Immunomodulatory+Potential+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+in+Three-Dimensional+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells Int. , 9176357(2016).</li>
<li>Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+formation%2C+use+and+understanding+of+multi-cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids.</a> Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).</li>
<li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells%3A+cellular+mechanisms%2C+biological+properties%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Potapova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+support+migration%2C+extracellular+matrix+invasion%2C+proliferation%2C+and+survival+of+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C.Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+Improve+Myocardial+Infarction+in+Mice+because+Cells+Embolized+in+Lung+Are+Activated+to+Secrete+the+Anti-inflammatory+Protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compaction+of+human+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+into+spheres+self-activates+caspase-dependent+il1+signaling+to+enhance+secretion+of+modulators+of+inflammation+and+immunity+%28PGE2%2C+TSG6%2C+and+STC1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1).</a> Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+cultured+as+spheroids+are+self-activated+to+produce+prostaglandin+E2+that+directs+stimulated+macrophages+into+an+anti-inflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype.</a> Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+human+mesenchymal+stromal%2Fprogenitor+cells+pre-activated+in+3-dimensional+cultures+under+different+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions.</a> Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).</li>
<li>Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html"> http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html</a> (2016).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mesenchymal+Stromal+Cells%27+Paracrine+Immunomodulatory+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.Med.Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects.</a> Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production.</a> Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+two+negative+feedback+loops+place+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+at+the+center+of+early+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation.</a> Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).</li>
<li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+%27licensing%27%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process.</a> Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).</li>
<li>Saleh, F. A., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+round%3A+multipotent+stromal+cells%2C+a+three-dimensional+revolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?</a> Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+bullet+formation+via+E-cadherin+promotes+therapeutic+potency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction.</a> Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De optimale MSC voor gebruik in sommige onderzoek en klinische toepassingen moet sterk worden geactiveerd om hun voordeel te maximaliseren, en bij voorkeur opgesteld onder chemisch gedefinieerde XF voorwaarden voor de afgifte van potentiële antigenen van xenogene mediumbestanddelen zoals FBS minimaliseren. In de hier beschreven protocollen hebben we aangetoond methoden 1) activeren MSCs in 3D cultuur door de vorming van sferoïden, 2) bereiken de 3D activatie van MSCs onder omstandigheden XF, 3) hoe de activering niveaus...

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) hebben laten zien een groot potentieel voor diverse regeneratieve geneeskunde benaderingen. MSCs werden aanvankelijk geïsoleerd als een stromale component van beenmerg maar zijn inmiddels verkregen zoveel andere volwassen weefsels, zoals vetweefsel 1, 2, 3. Interessant is dat de belangrijkste isolatiewerkwijze omarmt de opmerkelijke eigenschap van MSCs strak hechten aan weefselkweek kunststof in de aanwezigheid van foetaal runderserum (FBS). Hoewel dit traditionele isolatietechniek maakt gemakkelijke en snelle expansie van MSCs in tweedimensionale (2D) cultuur, is ook erg kunstmatige en voorbij betekenis van de natieve driedimensionale (3D) omgeving waarvoor eventueel verlies van belangrijke cellulaire elementen 4, 5 , 6. Daarom is de studie van MSCs in 3D culturen, diezijn meer fysiologische dan de traditionele 2D-culturen, is ontstaan ​​in de zoektocht naar &quot;verloren / verminderd&quot; MSC kenmerken. Bovendien heeft grote belangstelling gestegen tot xeno-vrij (XF) chemisch welbepaalde voorwaarden te identificeren voor MSC cultuur en activering, en zodoende de cellen meer vatbaar voor klinische toepassingen. Veel studies zijn gepubliceerd waaruit de 3D cultuur van MSC&#39;s zowel in biomaterialen en als bolvormige aggregaten of sferoïden. MSCs in biomaterialen werden oorspronkelijk ontworpen voor weefselengineering om beschadigde weefsels te vervangen cel geplaatste steigers, terwijl sferoïde culturen van MSC&#39;s werden als manier om MSC gedrag in vivo na toediening van de cellen voor therapieën in preklinische of klinische proeven begrijpen 4, 5, 7. Interessant is dat MSC vorm bolletjes spontaan bij hechting aan weefselkweek plastic is niet toegestaan8, 9, 10. Traditioneel werd celaggregatie vergemakkelijkt door centrifugekolf methoden of vloeibare overlaytechnieken, die aanvankelijk zijn gebruikt in kankerbiologie bij pogingen om te proberen de tumor micro-omgeving nabootsen. Meer recent zijn andere methoden opgedoken die aantonen celaggregatie in kweekschalen vooraf gecoat met specifieke chemicaliën om cel-adhesie kunststof 4, 5, 6 voorkomen. Een van de eenvoudigste en goedkoopste methode MSC sferoïden te genereren is om ze in cultuur opknoping druppels, een techniek die vaak werd gebruikt om embryoiden organen uit embryonale stamcellen. Met opknoping druppel cultuur techniek wordt celhechting de weefselkweekkunststof voorkomen door suspenderen van de cellen in een medium druppel op de onderkant van een weefselkweekplaat deksel en waardoor zwaartekracht cel vergemakkelijken aggregatie in de top van de druppel. De sferoïde grootte kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door het veranderen van de celconcentratie of druppelvolume, waardoor hangende druppel culturen bijzonder eenvoudig te bedienen. Vroege studies op de 3D cultuur van MSC&#39;s aangetoond radicale verschillen in de eigenschappen van de cellen in 3D vergelijking met hun tegenhangers 2D 6, 8, 9. Tegelijkertijd, rapporten aangetoond dat de gunstige effecten van MSC&#39;s in vivo gesteund op hun vermogen om geactiveerd door micro-omgevingsfactoren en in reactie worden, produceren anti-inflammatoire en immunomodulerende factoren 11. Interessant, veel van deze factoren, zoals prostaglandine E2 (PGE2), tumornecrose-factor gestimuleerde gen 6 (TSG6) en hepatocyt groeifactor (HGF) werden geproduceerd in veel grotere hoeveelheden door MSC sferoïden dan traditionele 2D MSC weg vrijmaakt voor de idee vangebruiken 3D culturen naar cellen 8, 12, 13 te activeren. Bovendien genactivering in 3D culturen bleek mechanismen herhalen, ten minste gedeeltelijk, van celactivering na injectie in muizen 12. Door het activeren van MSCs vóór hun gebruik in experimenten kunnen effecten van de cellen verlengd en prominent als de traditionele MSC effect in vivo vaak vertraagd en voorbijgaand en kan worden omschreven als &quot;hit and run&quot;. Gedurende de afgelopen jaren belangrijke onderbouwd met MSC sferoïden hebben aangetoond dat zij ontstekingsreacties kunnen onderdrukken en moduleren immuniteit in vivo door beïnvloeding effectorcellen zoals macrofagen, dendritische cellen, neutrofielen, en T-cellen die sferoïden een aantrekkelijke vorm van geprimede MSCs 2 , 3. Bovendien productie van anti-kanker moleculen, zoals interleukin-24 (IL-24) en tumor necrosis factor-gerelateerde apoptose inducerende ligand (TRAIL), zijn verhoogd bij 3D culturen van MSC&#39;s ten opzichte van MSC monolaag, een fenomeen dat kan worden benut voor gerichte kankertherapieën 8, 10, 14. Aangezien de traditionele cultuur MSC vereist niet alleen het gebruik van weefselkweek plastic maar FBS, andere hindernis MSC sferoïden ontvankelijker te maken voor klinisch gebruik moesten worden overwonnen. Om deze hindernis te pakken, hebben we onlangs toonde vorming van MSC sferoïden onder specifieke omstandigheden chemisch gedefinieerde XF en vastgesteld dat de verkregen MSC sferoïden werden geactiveerd met dezelfde anti-inflammatoire en anti-kanker moleculen als sferoïden gegenereerd onder omstandigheden met FBS 14 produceren. Hier worden deze bevindingen in een aantal gedetailleerde protocollen die de generatie van de pre-geactiveerde MSC&#39;s te tonen in 3D culturen met behulp XFmedia. Daarnaast zijn protocollen geleverd dat manieren om het activeringsniveaus van de MSC&#39;s met betrekking tot hun ontstekingsremmende, immunomodulerende en anti-kanker effecten te evalueren, alsmede een praktische methode om de intacte bolletjes geven in muizen beschreven.

<table><tbody><tr><td>MEM-&alpha; (minimal essential medium alpha)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)</td></tr><tr><td>FBS (fetal bovine serum), premium select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td><td>component van complete kweekmedia voor alle soorten cellen</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td><td>component van complete kweekmedia voor alle soorten cellen</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>15070063</td><td>component van complete kweekmedia voor alle soorten cellen</td></tr><tr><td>Sterilization Filter Units, 0.22 &micro;m PES membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td><td>media sterilisatie</td></tr><tr><td>150 mm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp;SIGMA</td><td>celkweek</td></tr><tr><td>Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 3110</td><td>incubatie van gekweekte cellen</td></tr><tr><td>Early passage MCSs</td><td>Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&amp;M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott &amp; White</td><td>NA</td><td>voorbereiding van 2D en 3D culturen van MSCs</td></tr><tr><td>water bath</td><td>VWR</td><td>89501-468</td><td>media verwarmen tot 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>manuele vloeistofverwerking</td></tr><tr><td>Pipete-Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>hantering van serologische pipetten</td></tr><tr><td>Costar steriele serologische pipet (5, 10, 25 en 50 ml)</td><td>Corning</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>vloeistofverwerking</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td><td>celkweekverwerking</td></tr><tr><td>0.25% trypsin/EDTA solution</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>adherente cellen opnemen en celaggregaten verspreiden</td></tr><tr><td>15 ml conische buis</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td><td>celcentrifugeren</td></tr><tr><td>50 ml conische buis</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352098</td><td>celcentrifugeren</td></tr><tr><td>Eppendor gekoelde centrifuge</td><td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>Model 5810R</td><td>celcentrifugeren</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>celtelling</td></tr><tr><td>trypan blauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 SIGMA</td><td>uitsluiting van dode cellen tijdens celtelling in hemacytometer</td></tr><tr><td>Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>Xeno-vrij media specifiek geformuleerd voor de groei en expansie van menselijke mesenchymatische stamcellen</td></tr><tr><td>Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5420</td><td>Gedefinieerd, xeno-vrij medium voor menselijke mesenchymatische stamcellen</td></tr><tr><td>HSA (Human serum albumin)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>Component van xeno-vrij MSC-medium</td></tr><tr><td>rHSA (recombinant Human serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp;SIGMA</td><td>Component van xeno-vrij MSC-medium</td></tr><tr><td>Total RNA isolation Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Totale RNA extractie</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Sample homogenisatie voorafgaand aan totale RNA extractie</td></tr><tr><td>RNAse-free DNase Set&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>On-column DNA eliminatie tijdens totale RNA extractie</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;ALDRICH</td><td>remming van RNAsen in RLT-buffer</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>meng monster</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>RNA concentratie en kwaliteit</td></tr><tr><td>High capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>transcriptie van totaal RNA in cDNA</td></tr><tr><td>Gene Expression Assays</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>varieerd</td><td>primer/probe combinatie voor real-time PCR</td></tr><tr><td>Fast Universal PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td><td>master mix voor real-time PCR reactie</td></tr><tr><td>Real-time PCR systeem (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td><td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>real-time PCR</td></tr><tr><td>1.5 ml centrifugebuis</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>celcentrifugeren, monsterverzameling en opslag</td></tr><tr><td>(-80 &deg;C) vriezer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model Thermo Forma 8695</td><td>monsteropslag</td></tr><tr><td>PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit</td><td>R&amp;D Systems</td><td>KGE004B</td><td>schatting van cytokineconcentratie in het monster</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&rsquo;s modified Eagle medium)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024;10566-032</td><td>macrofaagkweekmedium</td></tr><tr><td>J774 muismacrofagen</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>muismacrofaagcellijn</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>in vitro macrofaagstimulatie</td></tr><tr><td>LPS (lipopolysaccharide)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>in vitro macrofaagstimulatie</td></tr><tr><td>Mouse TNF-a ELISA kit</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MTA00B</td><td>schatting van cytokineconcentratie in het monster</td></tr><tr><td>Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit</td><td>R&amp;D Systems</td><td>M1000B</td><td>schatting van cytokineconcentratie in het monster</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>spleencel kweekmedium</td></tr><tr><td>BALB/c muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td>in vivo spheroid levering; spleencel bereiding</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11

productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / stromal cell (msc) sferoïden primer in 3-d cultures onder xeno-free voorwaarden

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) houdt een grote belofte in biotechnologie en regeneratieve geneeskunde. MSC&#39;s kunnen uit verschillende volwassen weefsels worden geïsoleerd door hun sterke hechting aan weefselkweek plastic en vervolgens verder uitgebreid in vitro, meestal via foetaal runderserum (FBS). Omdat FBS kunnen veroorzaken MSCs op immunogene worden, zijn aanwezigheid in MSC kweken beperkt zowel klinische en experimentele toepassingen van de cellen. Daarom is het in dienst hebben studies chemisch gedefinieerde xeno-vrij (XF) media voor MSC culturen zijn zeer waardevol. Vele gunstige effecten van MSC&#39;s zijn toegeschreven aan hun vermogen om ontsteking en immuniteit regelen, vooral door secretie van immunomodulerende factoren zoals tumor necrosis factor-gestimuleerde gen 6 (TSG6) en prostaglandine E2 (PGE2). Echter, MSC&#39;s moeten worden geactiveerd om deze factoren produceren en omdat het effect van MSCs dikwijls voorbijgaande, grote belangstelling ontstaan ​​om manieren pre-activering van de cellen prio ontdekkenr het gebruik ervan, zodat het niet langer de vertragingstijd voor activering in vivo. Hier presenteren we protocollen om efficiënt te activeren of prime MSC&#39;s in de driedimensionale (3D) culturen onder chemisch welbepaald XF voorwaarden en deze pre-geactiveerde MSC&#39;s in vivo toe te dienen. In het bijzonder, we eerst beschrijven methoden om sferische MSC micro-weefsels of &#39;bolletjes&#39; in opknoping druppels gebruik XF medium te genereren en laten zien hoe de sferen en geconditioneerd medium (CM) voor verschillende toepassingen kunnen worden geoogst. Ten tweede, beschrijven we genexpressie schermen en in vitro functionele testen om snel het niveau van MSC activering in sferoïden beoordelen, met nadruk op de anti-inflammatoire en anti-kanker potentieel van de cellen. Ten derde, beschrijven we een nieuwe methode om intacte MSC sferoïden injecteren in de peritoneale holte muis in vivo testen. Over het geheel genomen de protocollen hierin te overwinnen grote uitdagingen van het verkrijgen van pre-geactiveerde MSC onder chemisch welbepaald XF convoorwaarden en een flexibel systeem MSC sferoïden administreren therapieën.

In het huidige werk, waren opknoping druppel culturen gebruikt om compacte sferische micro-weefsels of &#39;bolletjes&#39; geactiveerde MSC onder XF omstandigheden te genereren. Het onderzoek routekaart in figuur 1 toont dat MSCs worden aangemoedigd om zelfassemblage tot sferoïden bij suspensie in opknoping druppels gedurende 72 uur, waarna de sferoïden, of CM geladen met bol afgeleide therapeutische factoren, kan worden verzameld en mogelijk gebruikt in beide onderzoek ...

Het therapeutische potentieel van mesenchymale stam-/stromacellen (MSC's) is goed gedocumenteerd, maar de beste methode om de cellen voor patiënten voor te bereiden blijft controversieel. Hierin communiceren we protocollen om efficiënt therapeutische sferische aggregaten of 'sferoïden' van MSC's te genereren en toe te dienen, die onder xeno-vrije omstandigheden zijn voorbereid voor experimentele en klinische toepassingen.

Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Het algemene doel van deze experimenten is om therapeutische sferische aggregaten, of sferoïden, van mesenchymale stam-/stromale cellen (MSC's), geprimed onder xeno-vrije omstandigheden, efficiënt te genereren en te injecteren in experimentele en klinische toepassingen. Deze methoden kunnen helpen belangrijke barrières in het veld van MSC-therapieën te overwinnen, zoals een slechte retentie, overleving en functionaliteit van cellen. Dit wordt vaak waargenomen na transplantatie van gedispergeerde cellen en bij ongunstige omstandigheden die gewoonlijk geassocieerd worden met weefselletsel.Het belangrijkste voordeel van deze procedures is dat de MSC-sferoïden kunnen worden geprepareerd, geprimed en geïnjecteerd zonder immunogene dierlijke producten, zoals FBS, wat momenteel sommige klinische toepassingen van de cellen beperkt en ook de interpretatie van sommige preklinische gegevens kan bemoeilijken. Hoewel dit mechanisme potentieel zeer gunstig is bij het bemiddelen van de MSC-gebaseerde effectiviteit, kan het ook worden gebruikt om MSC-gemedieerd weefselherstel te begrijpen en hoe andere mediaformuleringen het therapeutische genex plus kunnen veranderen. Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door Josh Beaver en Bret Clough, twee technici uit mijn laboratorium.Na het uitzaaien en incuberen van mesenchymale stamcellen, volgens het tekstprotocol, worden de cellen geoogst met trypsine en EDTA. Na centrifugatie van de geoogste cellen bij 450 ×g, worden alle cellen samengebracht in één conische buis met het juiste medium. Centrifugeer de cellen en resuspendeer het pellet in een klein volume medium. Tel vervolgens de cellen en verdun de geoogste MSC's in een van de volgende media bij een concentratie van 714 cellen per µL, om sferoïden van ongeveer 25.000 cellen te genereren.Pipetteer vervolgens druppels van 35 µL van de cellen op de onderzijde van een omgekeerd culturele schaaltje van 150 mm. Breng 20 mL PBS op kamertemperatuur over naar de bodem van de schaal en kantel in één continue, gestage beweging het deksel met de druppels zodanig dat de toppen van de druppels naar beneden wijzen. Plaats vervolgens het deksel voorzichtig op de bodem van de cultureschaal.Plaats de schaal gedurende drie dagen in de incubator zonder deze te verstoren om een adequate assemblage van de sferoïden mogelijk te maken. Begin na de incubatie met het oogsten van de sferoïden door voorzichtig het deksel te verwijderen en dit om te keren zodat de druppels opnieuw naar boven gericht zijn. Kantel het deksel vervolgens onder een hoek van ongeveer 10 tot 20 graden en gebruik een cellifter om de druppels met de sferoïden naar de rand van de plaat te duwen.Breng met een pipet van 1 ml het medium van de sferoïden over in een conische buis van 15 ml en was de plaat met PBS op kamertemperatuur en dezelfde pipetpunt om een maximale terugwinning van de sferoïden te garanderen. Centrifugeer voor real-time PCR-assays de suspensie van sferoïden bij 450 ×g gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het supernatant.Was de sferoïden met PBS en herhaal zowel de centrifugatie- als de aspiratiestappen. Voor toediening aan dieren laat u de sferen naar de bodem van de buis zakken zonder te centrifugeren. Om geconditioneerd medium, of CM, te verzamelen voor assays naar immunomodulerend en antikankerpotentieel, oogst u de sferoïden en het CM-medium in een conische buis van 15 milliliter met behulp van een cell lifter en een pipet, zoals zojuist gedemonstreerd.Was de deksels echter niet met PBS. Na centrifugatie bij 450 ×g gedurende 5 tot 10 minuten wordt de supernatant overgebracht naar 1,5 ml buisjes. Centrifugeer de supernatant bij 10.000 ×g en kamertemperatuur gedurende 5 tot 10 minuten.Gebruik vervolgens een pipet om het geklaarde CM zorgvuldig op te vangen in nieuwe 1,5 milliliter buisjes voor bewaring bij minus 80 graden Celsius. Nadat de sferoïden zijn voorbereid zoals zojuist in deze video is gedemonstreerd en er drie tot vier minuten is gewacht tot ze naar de bodem van de buis zijn gezakt, wordt het supernatant afgezogen en worden de sferoïden gewassen door HBSS toe te voegen, aangevuld met 0,2 tot 0,5% HSA om xeno-vrije omstandigheden te handhaven. Zuig vervolgens het supernatant af.Voeg 100 tot 200 µL steriel HBSS/HSA toe bovenop de sferoïden en plaats de buisjes op ijs. Nadat een muis volgens het tekstprotocol is geanestheseerd, wordt het dier in de BSL-2-kast geplaatst met de rugzijde naar beneden en wordt 70% ethanol gebruikt om de onderbuik van de muis te desinfecteren. Verwijder de dop van een 20-gauge intravenuze katheter en zoek, terwijl u met één hand de huid van de muis vasthoudt, het midden van een denkbeeldige lijn die een gebogen kniegewricht en het genitale gebied verbindt; voer vervolgens met de andere hand een intraperitoneale injectie uit, waarbij de naaldpunt van de katheterstiletto-eenheid naar de middellijn is gericht.Verwijder voorzichtig de metalen stiletto-naald uit de catheter-stiletto-assemblage. Controleer de stiletto op bloed, urine en feces en gooi deze weg. Bevestig de juiste plaatsing van de plastic catheter door een pipetpunt van 100 tot 200 microliter met 100 microliters steriele HBSS/HSA in de catheter-spuitenadapter te plaatsen, waarbij een luchtdichte afsluiting wordt gevormd.Injecteer vervolgens langzaam de vloeistof in de peritoneale holte. Verzamel met een pipetpunt van 100 tot 200 µL de MSA-sferoïden en HBSS/HSA en breng het volledige volume via de katheter over naar de peritoneale holte, zoals zojuist gedemonstreerd. Was daarna de buis met de sferoïden met 100 µL HBSS/HSA en breng het volledige volume sferoïden over naar de peritoneale holte.Plaats een met antisepticum doordrenkt gaasje over de katheter, verwijder de katheter vervolgens langzaam uit de peritoneale holte en gooi deze weg. Controleer de katheter op eventueel achtergebleven sferoïden. Masseer daarna voorzichtig de peritoneale holte met de vingers om een gelijkmatige verdeling van de sferoïden te waarborgen.Evalueer direct na het toedienen van de sferoïden bij de muizen het activatieniveau van de voor injecties geprepareerde sferoïden door 40 tot 120 sferen via de katheter over te brengen naar een plaat met 12 of 6 wells die één tot twee milliliter Alpha MEM bevat, aangevuld met 2% FBS en één X penicilline-streptomycine. Breng zes uur later het medium uit de wells over naar 1,5 of 15 milliliter buisjes en centrifugeer de buisjes 450 ×g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng tot slot het geklaarde CM over naar nieuwe 1,5 milliliter buisjes en gebruik een commerciële ELISA-kit volgens het tekstprotocol om de PGE-2 concentratie te bepalen.Zoals hier te zien is, wanneer ongeveer 25.000 MSC's worden gesuspendeerd in druppels van 35 µL CCM, assembleren de cellen zich eerst tot kleine aggregaten, maar vloeien ze uiteindelijk samen om na 72 uur een enkele compacte sfeer te vormen in de apex van de druppel. Deze figuur demonstreert dat de vorming van enkele compacte sferen en XFM-1 supplementatie met 13 mg/mL HSA vereist, een concentratie die de geschatte totale eiwitinhoud in CCM weerspiegelt. Tijdens de assemblage van de sfeer verandert het MSC-fenotype radicaal en wanneer ze zich in het passende, chemisch gedefinieerde xeno-vrije medium bevinden, wordt de expressie van talrijke ontstekingsremmende factoren, waaronder PGE2 en TSG6, opgereguleerd.Echter, de productie van TSG6 en PGE2 wordt niet merkbaar verhoogd in MSC's die als sferen zijn gekweekt in XFM-2 of XFM-1 zonder HSA. Ten slotte, vergelijkbaar met de in vitro effecten, verhoogden XFM-1 HSA-sferen die in de peritoneale holte van muizen werden geïnjecteerd, direct na de inductie van systemische ontsteking door IV-toediening van LPS, de PGE2- en IL-10-spiegels in het peritoneum, terwijl de pro-inflammatoire TNF alpha werd verlaagd. Zodra dit onder de knie is, kan elke plaat met hangende druppels in één tot twee minuten worden voorbereid.En de intraperitoneale toediening van intacte sferoïden kan, mits correct uitgevoerd, in 5 tot 10 minuten per dier worden voltooid. Bij het produceren van MSC-sferoïden met de hanging drop-techniek is het belangrijk om te onthouden dat verschillende xeno-vrije mediumformuleringen niet gelijkwaardig zijn wat betreft sfeerformatie en het versterken van de expressie van therapeutische genen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals confocale microscopie, worden gebruikt om de organisatie van de MSC's in de sferoïden te begrijpen en om vast te stellen welke aanvullende signaleringspaden mogelijk geactiveerd zijn in de MSC's in verschillende delen van de sferoïde.Na deze ontwikkeling stelde deze methode de MSC-wetenschappers in staat om andere 3D-kweekcondities te bestuderen en te onderzoeken hoe deze de priming van MSC's en de therapeutische genexpressie beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe MSC's als sferoïden geprimed kunnen worden met behulp van de hanging-drop-techniek, hoe hun therapeutische werkzaamheid in vitro kan worden geëvalueerd en hoe intacte sferoïden effectief in muizen kunnen worden gebracht voor in vivo werkzaamheidstesten. En vergeet niet dat het werken met volwassen menselijke stamcellen speciale apparatuur en training vereist en gevaarlijk kan zijn als de cellen niet correct worden behandeld.Tijdens het werken met menselijke stamcellen van volwassenen moeten te allen tijde passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.

production-administration-therapeutic-mesenchymal-stemstromal-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Hier presenteren we protocollen van kweken menselijke parodontitis ligament (PDL) cel sferoïden door Chitosan films. De cultuur van drie-dimensionale (3D) cellulaire sferoïden biedt een alternatief voor conventionele weefselcultuur polystyreen (TCPS) cultuursysteem.

Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.

Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur

Hier beschrijven we de grootschalige productie van van vetweefsel afgeleide stromale / stamcel (ASC) sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor homogeniteit van sferoïde grootte en vorm wordt gegarandeerd. Deze ASC-sferoïden kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor 3D-bioprintingbenaderingen.

Grootschalige, geautomatiseerde productie van van vetweefsel afgeleide stamcelsferoïden voor 3D-bioprinting

Hier presenteren we een protocol om aanhangende cellen uit meerlaagse kolven op een gesloten semi-geautomatiseerde manier te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatiesysteem. Dit protocol kan worden toegepast voor het oogsten van zowel adherente als suspensiecellen van andere celexpansieplatforms met weinig aanpassingen aan de bestaande stappen.

Menselijke mesenchymale stamcelverwerking voor klinische toepassingen met behulp van een gesloten semi-geautomatiseerde workflow

Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.

Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Er wordt een protocol beschreven voor de productie van ankerafhankelijke cellen door microcarrier-microbioreactoren als potentiële cellengebaseerde therapieën. Met een doel van acuut respiratoire noodsyndroom worden vergelijkbare celopbrengst en gunstige genexpressie ten opzichte van fles-gebaseerde procesomstandigheden geïllustreerd. Dit protocol is uitbreidbaar naar andere ankerafhankelijke cellen en doelindicaties.

Microbioreactor-gebaseerde productie van ankerafhankelijke mesenchymale stromale cellen die voorbereid zijn op acuut respiratoire distress syndroom

Hierin beschrijven we werkwijzen voor de ontleding van foetale en maternale weefsels van menselijke term placenta, gevolgd door isolatie en expansie van mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) van deze weefsels.

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

Een methode voor het kweken van Drosophila melanogaster onder axenic en gnotobiotische voorwaarden wordt gepresenteerd. Fly embryo's worden dechorionated in natriumhypochloriet, aseptisch in steriele voeding en grootgebracht in gesloten containers. Inenten van voeding en embryo's met bacteriën leidt tot gnotobiotische verenigingen, en bacteriële aanwezigheid wordt bevestigd door plating whole-body Drosophila homogenaten.

Het grootbrengen de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Onder Axenische en gnotobiotische voorwaarden

Leer de productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcel-sferoïden onder xeno-vrije omstandigheden. Deze methode verbetert celretentie en functionaliteit voor regeneratieve geneeskunde.

Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden (Video) | JoVE Journal

Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden

Meer video's verkennen