Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden

Het algemene doel van deze experimenten is om therapeutische sferische aggregaten, of sferoïden, van mesenchymale stam-/stromale cellen (MSC's), geprimed onder xeno-vrije omstandigheden, efficiënt te genereren en te injecteren in experimentele en klinische toepassingen. Deze methoden kunnen helpen belangrijke barrières in het veld van MSC-therapieën te overwinnen, zoals een slechte retentie, overleving en functionaliteit van cellen. Dit wordt vaak waargenomen na transplantatie van gedispergeerde cellen en bij ongunstige omstandigheden die gewoonlijk geassocieerd worden met weefselletsel.

Het belangrijkste voordeel van deze procedures is dat de MSC-sferoïden kunnen worden geprepareerd, geprimed en geïnjecteerd zonder immunogene dierlijke producten, zoals FBS, wat momenteel sommige klinische toepassingen van de cellen beperkt en ook de interpretatie van sommige preklinische gegevens kan bemoeilijken. Hoewel dit mechanisme potentieel zeer gunstig is bij het bemiddelen van de MSC-gebaseerde effectiviteit, kan het ook worden gebruikt om MSC-gemedieerd weefselherstel te begrijpen en hoe andere mediaformuleringen het therapeutische genex plus kunnen veranderen. Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door Josh Beaver en Bret Clough, twee technici uit mijn laboratorium.

Na het uitzaaien en incuberen van mesenchymale stamcellen, volgens het tekstprotocol, worden de cellen geoogst met trypsine en EDTA. Na centrifugatie van de geoogste cellen bij 450 ×g, worden alle cellen samengebracht in één conische buis met het juiste medium. Centrifugeer de cellen en resuspendeer het pellet in een klein volume medium. Tel vervolgens de cellen en verdun de geoogste MSC's in een van de volgende media bij een concentratie van 714 cellen per µL, om sferoïden van ongeveer 25.000 cellen te genereren.

Pipetteer vervolgens druppels van 35 µL van de cellen op de onderzijde van een omgekeerd culturele schaaltje van 150 mm. Breng 20 mL PBS op kamertemperatuur over naar de bodem van de schaal en kantel in één continue, gestage beweging het deksel met de druppels zodanig dat de toppen van de druppels naar beneden wijzen. Plaats vervolgens het deksel voorzichtig op de bodem van de cultureschaal.

Plaats de schaal gedurende drie dagen in de incubator zonder deze te verstoren om een adequate assemblage van de sferoïden mogelijk te maken. Begin na de incubatie met het oogsten van de sferoïden door voorzichtig het deksel te verwijderen en dit om te keren zodat de druppels opnieuw naar boven gericht zijn. Kantel het deksel vervolgens onder een hoek van ongeveer 10 tot 20 graden en gebruik een cellifter om de druppels met de sferoïden naar de rand van de plaat te duwen.

Breng met een pipet van 1 ml het medium van de sferoïden over in een conische buis van 15 ml en was de plaat met PBS op kamertemperatuur en dezelfde pipetpunt om een maximale terugwinning van de sferoïden te garanderen. Centrifugeer voor real-time PCR-assays de suspensie van sferoïden bij 450 ×g gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het supernatant.

Was de sferoïden met PBS en herhaal zowel de centrifugatie- als de aspiratiestappen. Voor toediening aan dieren laat u de sferen naar de bodem van de buis zakken zonder te centrifugeren. Om geconditioneerd medium, of CM, te verzamelen voor assays naar immunomodulerend en antikankerpotentieel, oogst u de sferoïden en het CM-medium in een conische buis van 15 milliliter met behulp van een cell lifter en een pipet, zoals zojuist gedemonstreerd.

Was de deksels echter niet met PBS. Na centrifugatie bij 450 ×g gedurende 5 tot 10 minuten wordt de supernatant overgebracht naar 1,5 ml buisjes. Centrifugeer de supernatant bij 10.000 ×g en kamertemperatuur gedurende 5 tot 10 minuten.

Gebruik vervolgens een pipet om het geklaarde CM zorgvuldig op te vangen in nieuwe 1,5 milliliter buisjes voor bewaring bij minus 80 graden Celsius. Nadat de sferoïden zijn voorbereid zoals zojuist in deze video is gedemonstreerd en er drie tot vier minuten is gewacht tot ze naar de bodem van de buis zijn gezakt, wordt het supernatant afgezogen en worden de sferoïden gewassen door HBSS toe te voegen, aangevuld met 0,2 tot 0,5% HSA om xeno-vrije omstandigheden te handhaven. Zuig vervolgens het supernatant af.

Voeg 100 tot 200 µL steriel HBSS/HSA toe bovenop de sferoïden en plaats de buisjes op ijs. Nadat een muis volgens het tekstprotocol is geanestheseerd, wordt het dier in de BSL-2-kast geplaatst met de rugzijde naar beneden en wordt 70% ethanol gebruikt om de onderbuik van de muis te desinfecteren. Verwijder de dop van een 20-gauge intravenuze katheter en zoek, terwijl u met één hand de huid van de muis vasthoudt, het midden van een denkbeeldige lijn die een gebogen kniegewricht en het genitale gebied verbindt; voer vervolgens met de andere hand een intraperitoneale injectie uit, waarbij de naaldpunt van de katheterstiletto-eenheid naar de middellijn is gericht.

Verwijder voorzichtig de metalen stiletto-naald uit de catheter-stiletto-assemblage. Controleer de stiletto op bloed, urine en feces en gooi deze weg. Bevestig de juiste plaatsing van de plastic catheter door een pipetpunt van 100 tot 200 microliter met 100 microliters steriele HBSS/HSA in de catheter-spuitenadapter te plaatsen, waarbij een luchtdichte afsluiting wordt gevormd.

Injecteer vervolgens langzaam de vloeistof in de peritoneale holte. Verzamel met een pipetpunt van 100 tot 200 µL de MSA-sferoïden en HBSS/HSA en breng het volledige volume via de katheter over naar de peritoneale holte, zoals zojuist gedemonstreerd. Was daarna de buis met de sferoïden met 100 µL HBSS/HSA en breng het volledige volume sferoïden over naar de peritoneale holte.

Plaats een met antisepticum doordrenkt gaasje over de katheter, verwijder de katheter vervolgens langzaam uit de peritoneale holte en gooi deze weg. Controleer de katheter op eventueel achtergebleven sferoïden. Masseer daarna voorzichtig de peritoneale holte met de vingers om een gelijkmatige verdeling van de sferoïden te waarborgen.

Evalueer direct na het toedienen van de sferoïden bij de muizen het activatieniveau van de voor injecties geprepareerde sferoïden door 40 tot 120 sferen via de katheter over te brengen naar een plaat met 12 of 6 wells die één tot twee milliliter Alpha MEM bevat, aangevuld met 2% FBS en één X penicilline-streptomycine. Breng zes uur later het medium uit de wells over naar 1,5 of 15 milliliter buisjes en centrifugeer de buisjes 450 ×g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng tot slot het geklaarde CM over naar nieuwe 1,5 milliliter buisjes en gebruik een commerciële ELISA-kit volgens het tekstprotocol om de PGE-2 concentratie te bepalen.

Zoals hier te zien is, wanneer ongeveer 25.000 MSC's worden gesuspendeerd in druppels van 35 µL CCM, assembleren de cellen zich eerst tot kleine aggregaten, maar vloeien ze uiteindelijk samen om na 72 uur een enkele compacte sfeer te vormen in de apex van de druppel. Deze figuur demonstreert dat de vorming van enkele compacte sferen en XFM-1 supplementatie met 13 mg/mL HSA vereist, een concentratie die de geschatte totale eiwitinhoud in CCM weerspiegelt. Tijdens de assemblage van de sfeer verandert het MSC-fenotype radicaal en wanneer ze zich in het passende, chemisch gedefinieerde xeno-vrije medium bevinden, wordt de expressie van talrijke ontstekingsremmende factoren, waaronder PGE2 en TSG6, opgereguleerd.

Echter, de productie van TSG6 en PGE2 wordt niet merkbaar verhoogd in MSC's die als sferen zijn gekweekt in XFM-2 of XFM-1 zonder HSA. Ten slotte, vergelijkbaar met de in vitro effecten, verhoogden XFM-1 HSA-sferen die in de peritoneale holte van muizen werden geïnjecteerd, direct na de inductie van systemische ontsteking door IV-toediening van LPS, de PGE2- en IL-10-spiegels in het peritoneum, terwijl de pro-inflammatoire TNF alpha werd verlaagd. Zodra dit onder de knie is, kan elke plaat met hangende druppels in één tot twee minuten worden voorbereid.

En de intraperitoneale toediening van intacte sferoïden kan, mits correct uitgevoerd, in 5 tot 10 minuten per dier worden voltooid. Bij het produceren van MSC-sferoïden met de hanging drop-techniek is het belangrijk om te onthouden dat verschillende xeno-vrije mediumformuleringen niet gelijkwaardig zijn wat betreft sfeerformatie en het versterken van de expressie van therapeutische genen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals confocale microscopie, worden gebruikt om de organisatie van de MSC's in de sferoïden te begrijpen en om vast te stellen welke aanvullende signaleringspaden mogelijk geactiveerd zijn in de MSC's in verschillende delen van de sferoïde.

Na deze ontwikkeling stelde deze methode de MSC-wetenschappers in staat om andere 3D-kweekcondities te bestuderen en te onderzoeken hoe deze de priming van MSC's en de therapeutische genexpressie beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe MSC's als sferoïden geprimed kunnen worden met behulp van de hanging-drop-techniek, hoe hun therapeutische werkzaamheid in vitro kan worden geëvalueerd en hoe intacte sferoïden effectief in muizen kunnen worden gebracht voor in vivo werkzaamheidstesten. En vergeet niet dat het werken met volwassen menselijke stamcellen speciale apparatuur en training vereist en gevaarlijk kan zijn als de cellen niet correct worden behandeld.

Tijdens het werken met menselijke stamcellen van volwassenen moeten te allen tijde passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.