Temporal bestellen van Dynamic Expression gegevens van Uitgebreide Ruimtelijke Expression Maps

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de ruimte-tijdelijke genexpressiedynamiek van de segmentatieklok van gewervelde dieren in kaart te brengen met behulp van vast weefselmonsters. Deze methode maakt een onbevooroordeelde beoordeling van oscillerende gendynamiek in het presomitisch mesoderm mogelijk, en dit is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die de somatogene van gewervelde dieren beheersen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er veel monsters gelijktijdig kunnen worden gegenereerd en verwerkt, waardoor een hoogwaardige driedelige analyse van genexpressiedynamiek in vast weefsel mogelijk wordt.

De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Charlotte Bailey, een voormalige post-doc in mijn laboratorium. Na het verkrijgen van een muisbaarhoorn volgens het protocol, gebruikt onder een stereomicroscoop gekromde schaar om de dikke gespierde membraan van de baarmoeder te snijden en voorzichtig elk embryo te extraheren. Met gekromde schaar en fijne pincetten, verwijder de amnionzak van elk embryo.

Gebruik vervolgens een chirurgische naald of gekromde schaar om het staartweefsel van elk embryo te verzamelen door het embryo vooraan te snijden tot aan de achterste ledematen. Balanceer het staartweefsel met de buikzijde naar beneden. Genereer vervolgens paarsgewijs PSM-explanten door het staartweefsel in twee helften langs de middenlijn te snijden, met behulp van een zachte wiegenbeweging met de naald.

Zorg ervoor dat de neurale buis, chorda dorsalis en PSM-weefsel gelijk verdeeld zijn tussen de twee explanten. Pipetteer vervolgens elk contralaterale PSM-explant op de onderkant van een 35 mm plastic kweekschaaldeksel in een kleine hoeveelheid voorverwarmd kweekmedium. Plaats de schaal op het deksel en draai het snel om, zodat het PSM-weefsel in een hangende druppel medium van het deksel hangt.

Kweek vervolgens de PSM-explanten in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Breng paarsgewijs PSM-explanten over naar de afzonderlijke putjes van een 24-puts kweekplaat. Voeg vervolgens 4% paraformaldehyde in PBS toe aan de monsters en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende één uur, of bij vier graden Celsius op een wiegend platform gedurende de nacht.

Na de incubatie, gebruik PBS om de monsters in de putjes bij kamertemperatuur op een wiegend platform te wassen. Met een fijne plastic Pasteurpipet, vervang de PBS-oplossing op de monsters drie tot vier keer. Om immunohistologie uit te voeren, voeg 2% Triton X-100 in PBS toe aan een PSM-explant van elk embryopaar en incubeer de monsters bij kamertemperatuur op een wiegend platform gedurende één uur om ze te wassen.

Gebruik PBS om de monsters kort te spoelen. Vervang vervolgens de PBS door een blokkeeroplossing en incubeer de monsters bij vier graden Celsius op een wiegend platform gedurende de nacht. Gebruik werkbuffer om de gewenste primaire antilichamen te verdunnen.

In dit voorbeeld worden antilichamen tegen Delta-like 1 en Notch1 gebruikt bij een verdunning van 1:25. Voeg de antilichamen toe aan de explanten en incubeer de monsters op een wiegend platform bij vier graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen. Na de incubatie, gebruik PBS om de monsters twee keer gedurende vijf tot tien minuten elk te wassen.

Voer vervolgens drie wasbeurten uit in 0,3% Triton X-100 in PBS bij kamertemperatuur op een wiegend platform. Na het verdunnen van secundaire antilichamen in werkbuffer, voeg 250-500 microliter van de antilichaamoplossing toe aan elk monsterputje, zorg ervoor dat je de laatste paar microliters oplossing niet gebruikt, die antilichaammolekulaire aggregaten kunnen bevatten. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer de monsters in secundaire antilichaamoplossing in het donker bij vier graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen.

Na de incubatie, was de monsters twee keer gedurende tien minuten elk met PBST. Was vervolgens het weefsel eenmaal bij kamertemperatuur op een wiegend platform gedurende vijf minuten met PBS. Volg het protocol en dehydrateer en rehydrateer de resterende contralaterale PSM-explanten door een ethanol PBST verdunningsserie.

Voeg tien microgram per milliliter Proteinase K in 0,1% PBST toe aan de explanten en incubeer het weefsel zonder agitatie gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens snel de Proteinase K-oplossing en spoel de monsters kort met PBST. Voeg 4% formaldehyde en 0,1% glutaraldehyde in PBST toe aan de PSM-explanten om ze te postfixeren en incubeer de monsters gedurende 30 minuten.

Voeg vervolgens, na het wassen van de monsters twee keer gedurende tien minuten elk met PBST, 50% hybridisatiemix toe aan het weefsel en incubeer gedurende tien minuten bij 65 graden Celsius zonder agitatie. Na het incuberen van de monsters en hybridisatiemix volgens het protocol, verwijder de oplossing en voeg 0,25 tot 0,5 milliliter voorverwarmde hybridisatiemix toe die een digoxigenine-gelabelde antisense RNA-probe bevat tegen een bekend segmentatieklokcomponent. Gebruik plakband om de plaat te verzegelen en incubeer de monsters gedurende twee nachten bij 65 graden Celsius.

Na de incubatie, gebruik voorverwarmde 50% hybridisatiemix in TBST om de monsters gedurende 15 minuten te wassen. Spoel vervolgens de monsters twee keer met TBST voordat je het weefsel in TBST incubeert bij kamertemperatuur op een wiegend platform gedurende 30 minuten. Bereid vervolgens de explanten voor in blokkeeroplossing gedurende minimaal twee uur.

Vervolgens vervang de oplossing door verse blokkeeroplossing, die een 1:200 verdunning van HRB geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam bevat. Incubeer de monsters bij vier graden Celsius gedurende de nacht. De volgende dag, spoel de monsters drie keer bij kamertemperatuur met TBST en breng ze over naar individuele putjes van een nieuwe 24-puts kweekplaat.

Was vervolgens de explanten drie keer gedurende één uur elk met TBST. Gebruik een tyramide signaal versterkingskit om het gedetecteerde mRNA te visualiseren voordat je de monsters voorbereidt voor beeldvorming. Bereid voor elke explantenpaar een geladen glasplaat voor door de kleefstofliner van een