Temporal bestellen van Dynamic Expression gegevens van Uitgebreide Ruimtelijke Expression Maps
February 9th, 2017
De segmentatieklok stuurt oscillerende genexpressie aan in het presomische mesoderm (PSM). Dynamische Notch-activiteit is de sleutel tot dit proces. We gebruiken beeldvorming en computationele analyses om temporele dynamica uit ruimtelijke expressiegegevens te extraheren om aan te tonen dat Delta-ligand en Notch-receptorexpressie oscilleren in het PSM van gewervelde dieren.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de ruimte-tijdelijke genexpressiedynamiek van de segmentatieklok van gewervelde dieren in kaart te brengen met behulp van vast weefselmonsters. Deze methode maakt een onbevooroordeelde beoordeling van oscillerende gendynamiek in het presomitisch mesoderm mogelijk, en dit is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die de somatogene van gewervelde dieren beheersen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er veel monsters gelijktijdig kunnen worden gegenereerd en verwerkt, waardoor een hoogwaardige driedelige analyse van genexpressiedynamiek in vast weefsel mogelijk wordt.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Charlotte Bailey, een voormalige post-doc in mijn laboratorium. Na het verkrijgen van een muisbaarhoorn volgens het protocol, gebruikt onder een stereomicroscoop gekromde schaar om de dikke gespierde membraan van de baarmoeder te snijden en voorzichtig elk embryo te extraheren. Met gekromde schaar en fijne pincetten, verwijder de amnionzak van elk embryo.
Gebruik vervolgens een chirurgische naald of gekromde schaar om het staartweefsel van elk embryo te verzamelen door het embryo vooraan te snijden tot aan de achterste ledematen. Balanceer het staartweefsel met de buikzijde naar beneden. Genereer vervolgens paarsgewijs PSM-explanten door het staartweefsel in twee helften langs de middenlijn te snijden, met behulp van een zachte wiegenbeweging met de naald.
Zorg ervoor dat de neurale buis, chorda dorsalis en PSM-weefsel gelijk verdeeld zijn tussen de twee explanten. Pipetteer vervolgens elk contralaterale PSM-explant op de onderkant van een 35 mm plastic kweekschaaldeksel in een kleine hoeveelheid voorverwarmd kweekmedium. Plaats de schaal op het deksel en draai het snel om, zodat het PSM-weefsel in een hangende druppel medium van het deksel hangt.
Kweek vervolgens de PSM-explanten in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Breng paarsgewijs PSM-explanten over naar de afzonderlijke putjes van een 24-puts kweekplaat. Voeg vervolgens 4% paraformaldehyde in PBS toe aan de monsters en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende één uur, of bij vier graden Celsius op een wiegend platform gedurende de nacht.
Na de incubatie, gebruik PBS om de monsters in de putjes bij kamertemperatuur op een wiegend platform te wassen. Met een fijne plastic Pasteurpipet, vervang de PBS-oplossing op de monsters drie tot vier keer. Om immunohistologie uit te voeren, voeg 2% Triton X-100 in PBS toe aan een PSM-explant van elk embryopaar en incubeer de monsters bij kamertemperatuur op een wiegend platform gedurende één uur om ze te wassen.
Gebruik PBS om de monsters kort te spoelen. Vervang vervolgens de PBS door een blokkeeroplossing en incubeer de monsters bij vier graden Celsius op een wiegend platform gedurende de nacht. Gebruik werkbuffer om de gewenste primaire antilichamen te verdunnen.
In dit voorbeeld worden antilichamen tegen Delta-like 1 en Notch1 gebruikt bij een verdunning van 1:25. Voeg de antilichamen toe aan de explanten en incubeer de monsters op een wiegend platform bij vier graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen. Na de incubatie, gebruik PBS om de monsters twee keer gedurende vijf tot tien minuten elk te wassen.
Voer vervolgens drie wasbeurten uit in 0,3% Triton X-100 in PBS bij kamertemperatuur op een wiegend platform. Na het verdunnen van secundaire antilichamen in werkbuffer, voeg 250-500 microliter van de antilichaamoplossing toe aan elk monsterputje, zorg ervoor dat je de laatste paar microliters oplossing niet gebruikt, die antilichaammolekulaire aggregaten kunnen bevatten. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer de monsters in secundaire antilichaamoplossing in het donker bij vier graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen.
Na de incubatie, was de monsters twee keer gedurende tien minuten elk met PBST. Was vervolgens het weefsel eenmaal bij kamertemperatuur op een wiegend platform gedurende vijf minuten met PBS. Volg het protocol en dehydrateer en rehydrateer de resterende contralaterale PSM-explanten door een ethanol PBST verdunningsserie.
Voeg tien microgram per milliliter Proteinase K in 0,1% PBST toe aan de explanten en incubeer het weefsel zonder agitatie gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens snel de Proteinase K-oplossing en spoel de monsters kort met PBST. Voeg 4% formaldehyde en 0,1% glutaraldehyde in PBST toe aan de PSM-explanten om ze te postfixeren en incubeer de monsters gedurende 30 minuten.
Voeg vervolgens, na het wassen van de monsters twee keer gedurende tien minuten elk met PBST, 50% hybridisatiemix toe aan het weefsel en incubeer gedurende tien minuten bij 65 graden Celsius zonder agitatie. Na het incuberen van de monsters en hybridisatiemix volgens het protocol, verwijder de oplossing en voeg 0,25 tot 0,5 milliliter voorverwarmde hybridisatiemix toe die een digoxigenine-gelabelde antisense RNA-probe bevat tegen een bekend segmentatieklokcomponent. Gebruik plakband om de plaat te verzegelen en incubeer de monsters gedurende twee nachten bij 65 graden Celsius.
Na de incubatie, gebruik voorverwarmde 50% hybridisatiemix in TBST om de monsters gedurende 15 minuten te wassen. Spoel vervolgens de monsters twee keer met TBST voordat je het weefsel in TBST incubeert bij kamertemperatuur op een wiegend platform gedurende 30 minuten. Bereid vervolgens de explanten voor in blokkeeroplossing gedurende minimaal twee uur.
Vervolgens vervang de oplossing door verse blokkeeroplossing, die een 1:200 verdunning van HRB geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam bevat. Incubeer de monsters bij vier graden Celsius gedurende de nacht. De volgende dag, spoel de monsters drie keer bij kamertemperatuur met TBST en breng ze over naar individuele putjes van een nieuwe 24-puts kweekplaat.
Was vervolgens de explanten drie keer gedurende één uur elk met TBST. Gebruik een tyramide signaal versterkingskit om het gedetecteerde mRNA te visualiseren voordat je de monsters voorbereidt voor beeldvorming. Bereid voor elke explantenpaar een geladen glasplaat voor door de kleefstofliner van een
Overzicht
Deze studie onderzoekt de ruimtelijk-tijdelijke dynamica van genexpressie in de segmentatieklok van gewervelde dieren, met focus op het presomische mesoderm (PSM). Het onderzoek benadrukt de rol van Notch-signalering in oscillerende genexpressie met behulp van beeldvormings- en computationele technieken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genexpressiedynamica
Achtergrond
- De segmentatieklok is cruciaal voor somatogeneze bij gewervelde dieren.
- Notch-signalering speelt een belangrijke rol in het reguleren van genexpressiepatronen.
- Het begrijpen van deze dynamica is essentieel voor inzichten in ontwikkelingsprocessen.
- Gestaalde weefselmonsters maken een uitgebreide analyse van genexpressie mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om genexpressiedynamica in het PSM in kaart te brengen.
- Om de rol van Delta en Notch in de segmentatieklok te beoordelen.
- Om een methode te ontwikkelen voor onbevooroordeelde evaluatie van oscillerende genexpressie.
Gebruikte methoden
- Dissectie van muizenembryo's om PSM-explantaten te verkrijgen.
- Immunohistochemische methoden om genexpressie te visualiseren.
- Gebruik van digoxigenine-gelabelde RNA-probes voor hybridisatie.
- Beeldvormingstechnieken om genexpressiepatronen te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Aantoon van oscillerende expressie van Delta en Notch in het PSM.
- Een betrouwbare methode voor het analyseren van gendynamica in vast weefsel vastgesteld.
- Inzichten geboden in de moleculaire mechanismen van somatogeneze bij gewervelde dieren.
- De belangrijkheid van Notch-signalering in de segmentatieklok benadrukt.
Conclusies
- De segmentatieklok wordt aangedreven door oscillerende genexpressie beïnvloed door Notch-activiteit.
- Deze studie biedt een raamwerk voor toekomstig onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van ontwikkelingsmechanismen bij gewervelde dieren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the temporal dynamics of gene expression in developmental systems provides critical insights for target validation in early discovery. This method enables mechanistic de-risking by revealing oscillatory patterns in signaling pathways such as Notch, Wnt, and FGF, which are frequently implicated in disease mechanisms and therapeutic targeting. By mapping spatio-temporal expression profiles, researchers can assess target continuity and predictive confidence in preclinical models, supporting informed portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing dynamic expression of Notch1, Dll1, and clock genes across oscillation cycles.
- Operational Value: Supports biological de-risking through synchronized detection of receptor, ligand, and target expression in spatially resolved tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, phase-resolved expression data suitable for assay standardization and reproducibility assessment.
- Operational Value: Produces kymographs that serve as standardized readouts for monitoring oscillatory dynamics in preclinical systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links dynamic expression in PSM explants to disease-relevant systems by capturing Notch pathway activity across developmental time.
- Operational Value: Enables translational biomarker alignment by correlating NICD, Dll1, and lunatic fringe oscillations with functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing temporal resolution of gene expression, supporting hypothesis testing and pathway clarification before lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by revealing phase-specific expression of Notch signaling components in vertebrate PSM.
- Screening: Delivers quantitative signal intensity measurements along the anteroposterior axis for comparative condition analysis.
- Analytics: Enables temporal ordering of expression snapshots to reconstruct oscillatory cycles for kinetic modeling.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by expressing dynamic gene patterns in chick and mouse PSM, relevant to conserved segmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for simultaneous multi-target analysis across numerous explants, enhancing throughput in pathway validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving temporal delays and subcellular localization of RNA and protein signals.
- Operational Value: Ensures reproducibility through fixed tissue sampling and standardized staining, imaging, and computational ordering protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in oscillatory pathway activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated dynamic expression in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological dissection, immunohistochemistry, and RNA in situ hybridization.
- Depends on confocal microscopy, image analysis software, and computational modeling for kymograph generation.
- Necessitates standardization across teams for explant preparation, antibody titration, and phase alignment using lunatic fringe as a phase marker.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems or developmental stages.
- Includes practical limitations such as the need for precise synchronization of explant pairs and optimization of signal detection for low-abundance targets.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
PSM Explant Dissection
2:49
Immunohistochemistry of PSM Explants
4:38
Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) of PSM Explants
7:09
Prepare Samples for Imaging
8:33
Results: Spatiotemporal Expression Profiles for Dll1 and Notch1 According to Expression of the Clock Gene Lfng
10:21
Conclusion
