Temporal bestellen van Dynamic Expression gegevens van Uitgebreide Ruimtelijke Expression Maps

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de spatio-temporele dynamiek van genexpressie van de vertebraten segmentatieklok in kaart te brengen met behulp van gefixeerde weefselbemonstering. Deze methode maakt een onbevooroordeelde beoordeling mogelijk van oscillerende gendynamiek in het presomitische mesoderm, wat cruciaal is voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die de somatogenese van vertebraten beheersen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er veel monsters gelijktijdig kunnen worden gegenereerd en verwerkt, wat een analyse met een hoge resolutie van de genexpressiedynamiek in gefixeerd weefsel mogelijk maakt.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Charlotte Bailey, een voormalig post-doc in mijn laboratorium. Na het verkrijgen van een uterine horn van een muis volgens het tekstprotocol, is onder een stereomicroscoop gebruikgemaakt van gebogen scharen om het dikke spiervliez van de uterine horn door te snijden en elk embryo voorzichtig te extraheren. Disseceer met gebogen scharen en fijne pincetten de vruchtzak weg van elk embryo.

Oogst vervolgens met een chirurgische naald of een gebogen schaar het staartweefsel van elk embryo door het embryo anterieur van de achterste ledemaatknoppen door te snijden. Balanceer het staartweefsel met de ventrale zijde naar beneden. Genereer vervolgens paren PSM-explantaten door het staartweefsel langs de middellijn in twee helften te ontleden, waarbij u met de naald een voorzichtige wiegende beweging maakt.

Zorg ervoor dat de neurale buis, de chorda dorsalis en het PSM-weefsel gelijkmatig worden verdeeld over de twee explantaten. Pipetteer vervolgens elk contralateraal PSM-explantat op de onderzijde van het deksel van een plastic kweekschaal van 35 mm in een klein volume voorverwarmd kweekmedium. Plaats de schaal bovenop het deksel en keer deze snel om, zodat het PSM-weefsel vanuit het deksel wordt opgehangen in een hangende druppel medium.

Kweek vervolgens de PSM-explantaten in een bevochtigingskamer bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Breng paren PSM-explantaten over naar de individuele putjes van een 24-wells weefselkweekplaat. Voeg daarna 4%paraformaldehyde in PBS toe aan de monsters en incubeer de plaat een uur bij kamertemperatuur, of een nacht bij vier graden Celsius op een schudplatform.

Was na de incubatie de monsterputjes met PBS bij kamertemperatuur op een schudplatform. Vervang de PBS-oplossing bij de monsters drie tot vier keer met een fijne plastic Pasteurpipet. Om immunohistochemie uit te voeren, voegt u 2% Triton X-100 in PBS toe aan één PSM-explantaat van elk embryonaal paar en incubeert u de monsters één uur bij kamertemperatuur op een schudplatform om ze te wassen.

Gebruik PBS om de monsters kort te spoelen. Vervang vervolgens de PBS door blokkeringsoplossing en incubeer de monsters een nacht bij vier graden Celsius op een schudplatform. Verdun de gewenste primaire antilichamen met behulp van werkbuffer.

In dit voorbeeld worden antilichamen tegen Delta-like 1 en Notch1 gebruikt in een verdunning van 1:25. Voeg de antilichamen toe aan de explantaten en incubeer de monsters op een schudplatform bij vier graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen. Was na de incubatie de monsters twee keer gedurende vijf tot tien minuten per keer met PBS.

Voer vervolgens drie wasbeurten uit in 0,3% Triton X-100 in PBS bij kamertemperatuur op een schudplatform. Voeg na het verdunnen van de secundaire antilichamen in werkbuffer 250-500 µL van de antilichaamoplossing toe aan elke monsterput, waarbij u er op let de laatste paar microliters van de oplossing niet te gebruiken, aangezien deze antilichaamaggregaten kunnen bevatten. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer de monsters in de secundaire antilichaamoplossing in het donker bij 4 °C gedurende drie tot vijf dagen.

Was na de incubatie de monsters twee keer gedurende tien minuten met PBST. Was het weefsel vervolgens één keer met PBS bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten op een schudplatform. Dehydrateer en rehydrateer de overgebleven contralaterale PSM-explantaten volgens het tekstprotocol via een ethanol PBST-verdunningsreeks.

Voeg tien microgram per milliliter Proteinase K in 0,1% PBST toe aan de explantaten en incubeer het weefsel gedurende vijf minuten zonder agitatie. Verwijder vervolgens snel de Proteinase K-oplossing en gebruik PBST om de monsters kort te spoelen. Voeg 4% formaldehyde en 0,1% glutaaraldehyde in PBST toe aan de PSM-explantaten om ze na te fixeren en incubeer de monsters gedurende 30 minuten.

Was daarna de monsters twee keer gedurende tien minuten met PBST, voeg vervolgens 50% hybridisatiemix toe aan het weefsel en incubeer dit tien minuten bij 65 graden Celsius zonder agitatie. Nadat de monsters en de hybridisatiemix volgens het tekstprotocol zijn geïncubeerd, wordt de oplossing verwijderd en worden 0,25 tot 0,5 milliliter voorverwarmde hybridisatiemix toegevoegd die een digoxigenine-gelabelde antisense RNA-probe tegen een bekend onderdeel van de segmentatieklok bevat. Gebruik plakband om de plaat af te sluiten en incubeer de monsters twee nachten bij 65 graden Celsius.

Was na de incubatie de monsters gedurende 15 minuten met voorverwarmde 50% hybridisatiemix in TBST. Spoel de monsters vervolgens twee keer met TBST voordat het weefsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform in TBST wordt geïncubeerd. Pre-incubeer de explantaten vervolgens gedurende minimaal twee uur in blokkeringsoplossing.

Vervang vervolgens de oplossing door verse blokkeringsoplossing, met een 1:200 verdunning van HRB-geconjugeerd anti-digoxigenine-antilichaam. Incubeer de monsters gedurende één nacht bij vier graden Celsius. Spoel de monsters de volgende dag drie keer met TBST bij kamertemperatuur en breng ze over naar individuele putjes van een nieuwe 24-well weefselkweekplaat.

Was daarna de explantaten drie keer gedurende één uur met TBST. Gebruik een tyramide-signaalversterkingskit om het gedetecteerde mRNA te visualiseren voordat de monsters worden voorbereid voor beeldvorming. Bereid voor elk paar explantaten één geladen adhesie-glasplaatje voor door de plakstrip van een 0,12 mm dikke imaging spacer te verwijderen en deze op een glasplaatje te plakken.

Nadat een paar explantaten op de objectglas is geplaatst volgens het tekstprotocol, laat u de monsters 45-60 seconden hechten aan het glas, totdat het weefsel plakkerig en doorschijnend begint te worden zonder volledig uit te drogen. Verwijder ondertussen met een pincet de resterende kleefstrip van de spacer en voeg een grote druppel dual function mounting medium en clearing solution toe aan de monsters in het midden van de spacer. Plaats een rond dekglas over de monsters en zorg ervoor dat het montagemedium gelijkmatig is verdeeld en dat alle randen contact maken met de spacer.

Plaats vervolgens het dekglasplaatje ondersteboven op pluisvrij papier. Druk stevig aan om ervoor te zorgen dat het dekglas volledig aan de spacer hecht en dat alle overtollige monteermedium wordt verwijderd. Herhaal dit proces totdat er geen monteermedium meer op het papier vlekt.

Reinig en label de slide en bewaar deze in het donker tot aan de beeldvorming. Voer vervolgens de beeldvorming en analyse uit volgens het tekstprotocol. In dit experiment wordt aangetoond dat de eiwitexpressie van Delta-Like 1 en Notch1 asynchroon oscilleert door embryo's tijdelijk te rangschikken op basis van de beginnende transcriptie van het Notch-gereguleerde segmentatieklokgen intronic lunatic fringe, gedetecteerd in één helft van elk explantaatpaar.

De panelen zijn gerangschikt volgens fase één, twee en drie van de cyclus van de segmentatieklok. De omvang van de expressiedomeinen voor Delta-Like 1, Notch1 en intronisch lunatic fringe langs de anteroposteriore as van de PSM zijn afgebakend door kleurgecodeerde balken. Zoals hier wordt getoond, is er een plot gegenereerd om de signaalintensiteit van Delta-Like 1, Notch1 en intronisch lunatic fringe te kwantificeren in relatie tot de anteroposteriore as van de PSM, wat de axiale variatie en signaalintensiteit over de PSM gedurende de klokcyclus illustreert.

Kymografen visualiseren de ruimtelijke distributie van Delta-Like 1, Notch1 en intronisch lunatic fringe over talrijke PSM's. Elke rij van de kymograaf representeert de signaalintensiteit van een individueel PSM-explantaat. Kwantificering van de signaalintensiteit van Delta-Like 1, Notch1 en intronisch lunatic fringe in relatie tot de anteroposterieure as van de PSM onthult duidelijke oscillatorische expressiedynamiek voor deze targets.

Ten slotte tonen deze kymografen de ruimtelijke distributie van de gesplitste en geactiveerde vorm van de Notch-receptor NICD, Delta-Like 1, intronic lunatic fringe en Notch1 over talrijke PSM's. Deze techniek heeft onderzoekers op het gebied van mitogenese bij gewervelden geholpen om de oscillatiedynamiek van segmentatiegenen in het presomitische mesoderm van het kuiken en de muis beter te begrijpen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden uitgevoerd op grote aantallen monsters, waardoor de expressieprofielen van verschillende mRNAs en eiwitten van belang gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd.

Na het volgen van deze procedure kan aanvullende kwantificering van de beeldgegevens inzicht bieden in temporele vertragingen in genexpressie, evenals de subcellulaire lokalisatie van zowel de RNA- als eiwitsignalen waarin de onderzoeker geïnteresseerd is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de spatio-temporele genexpressiedynamiek van de segmentatieklok van gewervelden in kaart kan worden gebracht met behulp van dikke weefselmonsters. Dit kan worden gevolgd door geautomatiseerde beeldanalyse, zoals gedetailleerd beschreven in het tekstprotocol.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een gelijke verdeling van PSM, chorda dorsalis en neurale buis tussen de PSM-explantaten te waarborgen en de antilichaamverdunningen zorgvuldig te optimaliseren voordat u begint. Houd er rekening mee dat het werken met formamide, paraformaldehyde en glutaaraldehyde zeer gevaarlijk kan zijn. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt en werk, waar van toepassing, in een zuurkast.