Name: Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult Drosophila Brains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer een eenvoudige één-staps dissectiemethode voor volwassen Drosophila-hersenen met behoud van morfologie. Deze techniek ondersteunt neurowetenschappelijk en genetisch onderzoek naar neurale circuits.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen Mr Enes Mehmet, mevrouw Kiara Andrade, mevrouw Pilar Rodriguez, Chris Kwok, en mevrouw Danna Ghafir voor hun enorme steun aan het project.

1. Oplossingen Gebruikt voor Brain Dissection en immunofluorescentiekleuring <ol><li> Ontleden de volwassen hersenen vliegen kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 1,3 mM MgCl2 en 10 mM glucose. Voor gebruik gas de aCSF met 5% CO2 / 95% O2 gedurende 10 - 15 min en piek met 2,5 mM CaCl2. Steriliseer de aCSF oplossing door filtreren door een 0,22 urn membraanfilter. Opmerking: WINKEL aCSF bij 4 ° C om bacteriële contaminatie te voorkomen. hersenen vlieg kan worden ontleed in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing, hoewel Vergelijk de effecten van de twee oplossingen dissectie van de uiteindelijke beeldkwaliteit van de ontleed hersenen werden niet uitgevoerd. </li><li> Met 4% paraformaldehyde (PFA) bereid in 1x PBS als fixatief, die normaal in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C. caution: PFA is giftig en bijtend en moet met zorg worden behandeld. </li><li> Gebruik 1x PBS om de PFA spoelen van de hersenen en na de laatste wasstap in de immunofluorescentie kleuring van de hersenen ontleed. Bereid de 1x PBS van PBS 10x voorraad-oplossing (1,37 M NaCl, 27 mM KCI, 100 mM Na 2 HPO 4 en 18 mm KH 2 PO 4). </li><li> Met 0,3% Tween-20 in 1x PBS (1x PBT) voor alle volgende wasstappen tijdens immunofluorescentie kleuring van de hersenen ontleed. </li></ol> 2. Microchirurgie Dissectie van Adult Fly Heads Opmerking: De dissectie procedure is geïllustreerd in figuur 1. <ol><li> Verdoven de volwassen vliegen met CO 2. Met behulp van een tang, pick-up een vlieg en kort Dewax haar cuticula door dompelen in 70% ethanol gedurende 3-5 s. Dit zorgt ervoor dat er geen luchtbellen vast te houden aan de vlieg cuticula bij onderdompeling in de aCSF of 1X PBS dissectie oplossing. </li><li> Onder eenontleden microscoop met een lichtbron onder een hoek die niet zal worden geblokkeerd door de handen, stelt het objectief om een ​​duidelijk beeld van de vlieg (1,2X vergroting) te bereiken. Tang met de niet-dominante hand om het dier te immobiliseren en dompel de vliegen in de koude dissectie oplossing zijn buik naar boven, zoals weergegeven in figuur 1A. </li><li> Houd de tang op 160-170 ° hoek ten opzichte van de dissectie plaat, onder uitoefening van een kleine kracht op de buik van de vlieg (getoond als pijlen in Figuur 1A). Deze stap zal de vlieg immobiliseren en dwingen om het hoofd naar achteren te verplaatsen met 15 - 25 °, terwijl de uitbreiding van de slurf omhoog. In het proces, een zacht en doorschijnend gebied van de cuticula, onder de zuigorganen, moet blijken. Verhoog de vergroting en stel de focal plane op deze regio. Let op: Laat de tang niet te strak te houden, maar liever gewoon stevig genoeg te stabiliserende vlieg. Te veel kracht zorgt ervoor dat de binnenste organen scheuren in de oplossing. </li><li> Gebruik de dominante hand de tang ontleden zodat de uiteinden gesloten zijn, waarbij een milde weerstandskracht op de uiteinden van de tang genereren drukken, zodat de tang springt open wanneer de druk van de vasthoudende hand wordt losgelaten. Plaats de tang loodrecht op de tang met de vlieg, zie figuur 1B. <ol><li> Pierce de gesloten uiteinden van de dissectie forceps door het zachte en doorschijnende gebied van de cuticula onder de zuigorganen, zoals blijkt uit de rode pijl in figuur 1B. Het is belangrijk om niet te vergeten de tang te diep dat het de hersenen raakt dringen. De hersenen juiste moet zichtbaar worden. Zorg voor een stabiele greep van de vlieg met de nondominant de hand. </li></ol></li><li> Snel maar gestaag, laat de uiteinden van de dissectie pincet door zijn eigen kracht en vertrouwen op het momentum van deze release om weg te scheuren tHij exoskelet rondom de vlieg hoofd. Een intactehersenen goede moet zichtbaar (wit weefsel onmiddellijk boven het uiteinde van de onderste tang in figuur 1C) Volg een denkbeeldige lijn om de dynamiek van de vrijgemaakte pincet tips (geïllustreerd als de uitwendige rode pijlen getoond in figuur 1C) te geleiden. Dit verwijder het exoskelet en de meeste van de hersenen geassocieerde ogen en luchtpijp uit de hersenen. De juiste timing en de kracht die wordt uitgeoefend om te openen het exoskelet zal afhankelijk zijn van de ervaring van de onderzoeker zijn. Let op: Dit is de meest kritische fase tijdens de dissectie. Het is belangrijk om te vertrouwen op de natuurlijke kracht gegenereerd door de dynamiek van de opening tang om het exoskelet te verwijderen terwijl de blootgestelde hersenen blijft bevestigd aan de rest van het lichaam. </li><li> Gebruik de tang in de dominante hand om verwijder voorzichtig het overblijfsel accessoire weefsels, zoals de tracheale dat verschijnt als witte fiber structuren remaining aan de hersenen. Wees voorzichtig niet te trekken of beschadiging van de hersenen juiste. </li></ol> 3. immunofluorescentiekleuring van de Brains <ol><li> Bevestig de ontleedde hersenstalen met bijbehorende torso in ongeveer 1 ml 4% PFA gedurende 40 - 60 min. Opmerking: Bij deze en volgende stappen houdt de buizen of platen met monsters op een nutator om de monsters te mengen goed in de oplossing. </li><li> Spoelen met 1 mL 1 x PBS door pipetteren de oplossing en neer 3 keer. Wees niet naar de hersenen weg te zuigen. </li><li> Was 5 keer met 1x PBT gedurende 5 minuten elk. Houd de monsters op de nutator tijdens incubatie. </li><li> Incubeer met primaire antilichamen bij juiste verdunning O / N bij 4 ° C. </li><li> De volgende dag, verwijder de primaire antilichamen, en was de monsters 5 keer met 1x PBT. Laat de monsters voor 5-10 min in 1x PBT-oplossing tussen elke wasbeurt. Houd de monsters op de nutator tijdens incubatie. </li><li> Incubeer de gewassenmonsters in geschikte secundaire antilichamen met de voorgestelde verdunning en incubatietijd. </li><li> Was de monsters zes keer met 1x PBT met een 10 minuten incubatie tussen elke wasbeurt. Deze stap is essentieel voor het verwijderen van niet-specifiek gebonden secundaire antilichamen uit het monster. </li><li> Incubeer in een 1: 10.000 verdunning van 1 mg / ml 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 1x PBT oplossing gedurende 30 min. DAPI is een DNA kleurstof die bindt aan de AT regio van DNA en kan worden gebruikt om de totale morfologie van de hersenen te onthullen. </li><li> Spoel driemaal met 1x PBS. </li><li> Transfer monsters naar een dissectie gerecht, en scheiden de hersenen uit de lichamen in een dissectie schotel met behulp van een tang. </li><li> Na de kleuring en wasstappen, zet de hersenen tussen twee dekglaasjes en plaats de dekglaasjes bovenop een montage dia. Op deze wijze kan de hersenstalen gemakkelijk worden omgedraaid zodat beide zijden van de hersenen kan worden afgebeeld met dezelfde signaalintensiteit. <strong&gt; Opmerking: Het monteren van de hersenen op het dekglaasje plaats van direct op de montageplaat slide laat wegknippen van de oriëntatie van het monster vrij. Het montageproces wordt in meer detail beschreven. <ol><li> Plaats een 18 x 18 mm dekglaasje bovenop een montage dia. Verbreden van de opening van een pipetpunt met een mes en gebruiken om de hersenen overdragen 1x PBS oplossing op de 18 x 18 mm dekglaasje. </li><li> Plaats de hersenen in het midden van het dekglaasje, verwijder de vloeistof rond de hersenen met een fijne pipet en voeg een 20 - 40 pl anti-fade montage medium (0,2% (w / v) n-propylgallaat in 99,5 % ACS niveau glycerol) over de hersenen. Opmerking: De hoeveelheid fixeermiddel toegevoegd is afhankelijk van het aantal hersenen onderzocht. </li><li> Voorzichtig verspreid de hersenen tijdens het verplaatsen van de viskeuze montage medium naar buiten. Plaats een tweede 18 x 18 mm dekglaasje bovenop de hersenen door eerst de schuif verlagen van de ene kant tot deze tegen maakthet oppervlak van de montage slip, en dan langzaam verlagen van de andere kant van de hersenen contact met luchtbellen te minimaliseren. Opmerking: Het is niet nodig om een afstandhouder te gebruiken tussen de twee dekglaasjes, als het volume van het fixeermiddel en de hersenen moet een ruimte volstaat de twee dekglaasjes scheiden verschaffen. </li><li> Laat de dia&#39;s om te settelen. Verwijder overmatige vloeistof die uit de zijkant van de glijstukken met een laboratorium tissue komen. </li><li> Om te voorkomen dat de dekglaasjes met gemonteerde hersenen van het vallen van de montage-slide tijdens het transport, gebruik dan een klein stukje tape om de dekglaasjes hechten aan de montage dia. Opmerking: Hersenen tussen de schuiven kan onmiddellijk worden afgebeeld of bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week zonder significant verlies van fluorescerend signaal, zonder noodzaak om afdichtmiddel om de objectglaasjes dichten gemonteerd. Voor de lange termijn behoud van het lood hersenen, kan de zijkant van de twee slips worden verzegeld wet nagellak en opgeslagen in een -20 ° C vriezer, hoewel in lood hersenen hun signalen na verloop van tijd zou kunnen verliezen. Dit wordt niet aanbevolen. </li></ol></li><li> Gebruik een geschikte verbinding fluorescentiemicroscoop of confocale microscoop om de afbeelding van de hersenen. <ol><li> Ten eerste, de afbeelding vanuit de kant van de hersenen dichter bij het doel, en dan voorzichtig flip de dekglaasjes naar de kern in het midden monsters. Deze stap vergemakkelijkt het ophalen van de afbeelding van de andere kant van dezelfde hersenen. </li><li> Gebruik een rechtopstaande samengestelde fluorescentiemicroscoop en een 20X objectief het imago van de hele hersenen (voorbeelden in figuur 2) en een 40X objectief beeld kleinere gebieden van de hersenen, zoals DA neuronen in de gepaarde voorste Medial (PAM) cluster regio (voorbeelden in figuur 3). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199, 639-653 (2015).</li>
<li>Bellen, H. J., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morgan%27s+legacy%3A+fruit+flies+and+the+functional+annotation+of+conserved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes.</a> Cell. 163, 12-14 (2015).</li>
<li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, 04577(2014).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).</li>
<li>Yamagata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dopamine+neurons+mediate+reward+signals+for+short-+and+long-term+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).</li>
<li>Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Plasticity%3A+Dopamine+Tunes+the+Mushroom+Body+Output+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network.</a> Curr Biol. 26, 109-112 (2016).</li>
<li>Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroarchitecture+and+neuroanatomy+of+the+Drosophila+central+complex%3A+A+GAL4-based+dissection+of+protocerebral+bridge+neurons+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits.</a> J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).</li>
<li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+adult+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology+and+muscle+and+dopaminergic+neuron+degeneration+caused+by+inactivation+of+Drosophila+Pink1+is+rescued+by+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).</li>
<li>Greene, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology+and+apoptotic+muscle+degeneration+in+Drosophila+parkin+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).</li>
<li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).</li>
<li>Pesah, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+parkin+mutants+have+decreased+mass+and+cell+size+and+increased+sensitivity+to+oxygen+radical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress.</a> Development. 131, 2183-2194 (2004).</li>
<li>Trinh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decaffeinated+coffee+and+nicotine-free+tobacco+provide+neuroprotection+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease+through+an+NRF2-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).</li>
<li>Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+s-transferase+omega+1+activity+is+sufficient+to+suppress+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met een toenemend belang bij volwassen Drosophila hersenen menselijke hersenziekten, neuronale circuits en hogere hersenfuncties bestuderen, is het noodzakelijk om eenvoudig en snel te ontwikkelen tot intacte fly hersenen krijgen voor hele-mount analyses, wat vooral belangrijk voor grote- schalen brain-based schermen. Onze methode biedt een eenvoudige en makkelijk te leren aanpak te ontleden uit een vlieg hoofd (vaak in minder dan 10 s met ervaring) met goed bewaard gebleven morfologie, dat is grotendeels ontda...

De modelorganisme Drosophila, algemeen bekend als de fruitvlieg, is al lange tijd gewaardeerd om zijn elegante genetische instrumenten, korte reproductieve keer, en sterk geconserveerd moleculaire en cellulaire routes. De fruitvlieg is met succes toegepast om fundamentele signaalwegen, welke patroonvormende mechanismen van meercellige organismen, en de onderliggende mechanismen van neuronale ontwikkeling, functies en ziekten 1,2 ontleden. Met recente ontwikkelingen in cel labeling en beeldvormende technieken, heeft Fruitvlieghersenen bijzonder krachtig in fine mapping van neuronale circuits en het ontleden van de moleculaire en cellulaire basis van hogere hersenfuncties, zoals leren en geheugen, en circadiane ritme 1,3 worden, 4,5,6,7,8. Een bijzonder voordeel van de Drosophila systeem is de relatief kleine omvang, waardoor whole-mount voorbereiding en onderzoek van de hersenen met behulp van een gewone verbinding of confocale microscoop. This functie maakt gedetailleerde anatomische en functionele analyse van neuronale circuits, wellicht slechts één neuron op cellulaire en subcellulaire niveaus, in de context van een hele hersenweefsel, waardoor zowel een holistische kijk op het onderzochte subject en de precieze geometrie in de hele hersenen. Echter, gezien de nogal miniatuur grootte van de hersenen, het presenteert ook een technische uitdaging in een intacte hersenweefsel efficiënt te ontleden uit de beschermende exoskelet hoofd geval in een volwassen vlieg. Verschillende effectieve en relatief eenvoudige dissectie werkwijzen zijn beschreven, die meestal betrekking voorzichtig en stapsgewijze verwijdering van de kop zaak en de omliggende weefsels zoals de ogen, de luchtpijp en vet van de hersenen juiste 9, 10. Deze microchirurgische dissectie methoden plaats vaak nogal strenge eisen aan de kwaliteit van de dissectie pincet, met een beroep op de tang met fijne goed uitgelijnd tips die gemakkelijk kunnen worden beschadigd. Bovendien, zoals de hersenen ontleed zijn vaak separated van de rest van het lichaam, kan de hersenen gemakkelijk verloren tijdens de daaropvolgende kleuring en wasprocessen vanwege hun kleine afmetingen en de transparantie bij de verwerking buffer. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en makkelijk te leren, éénfasige dissectie protocol voor volwassen hersenen die de hersenen ontleed aan de romp blijft. De dissectie proces is vaak gemakkelijk ruimt meeste van de hersenen weefsels zoals het oog en trachea en vermindert de vraag naar goede kwaliteit dissectie pincet. Bovendien, bij beeldvorming van de hersenen onder de fluorescerende verbinding microscoop of confocale microscoop, de kant van de hersenen dat is verwijderd van de fluorescerende lichtbron levert vaak een zwakker signaal en minder heldere beelden doordat de dikte van de hele-mount hersenen. We beschrijven ook een eenvoudige montage methode die eenvoudig omkeren van de hersenmonsters toelaat, waardoor gemakkelijke beeldvorming aan beide zijden van de hersenen met gelijke signaal intensity en kwaliteit. Als een proof-of-concept voor de toepassing van deze methode om de volwassen hersenen te bestuderen, we verder onderzocht op de aanwezigheid van DA neuronen in de hersenen van w 1118 vliegt; een genotype dat vaak wordt gebruikt als ouderlijn voor transgene vliegen en wildtype controle in vele studies Drosophila.

<table><tbody><tr><td>w*;&nbsp;park&Delta;21/TM3,&nbsp;P{GAL4-Kr.C}DC2,&nbsp;P{UAS-GFP.S65T}DC10,&nbsp;Sb1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>51652</td><td>Balancer werd omgezet naar TM6B</td></tr><tr><td>PBac{WH}parkf01950</td><td>Exelixis at Harvard Medical School</td><td>f01950</td><td>Balancer werd omgezet naar TM6C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-990</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-198</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-265</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-500G</td><td>Vervangt glucose</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp;Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 &micro;m Pore Size</td><td>Fisher Scientific</td><td>GVWP14250</td><td></td></tr><tr><td>Formalin Solution, 10% (Histological)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-20</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-823</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-055</td><td>Protocol vereist geen zeer fijne punten.&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 anti-elav</td><td>The Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>Clone 7E8A10</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Propyl gallate powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol ACS reagent, &ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axioimager Z1</td><td>Zeiss</td><td>Quote</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2</td><td>Zeiss</td><td>Quote</td><td></td></tr><tr><td>Zen lite software</td><td></td><td>Quote</td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige één stap dissection protocol voor whole-mount voorbereiding van adult<em&gt; drosophila</em&gt; brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Er is een toenemende belangstelling voor het gebruik Drosophila tot menselijke hersenen degeneratieve ziekten te modelleren, kaart neuronale circuits in volwassen hersenen, en de studie van de moleculaire en cellulaire basis van de hogere hersenfuncties. Een hele-mount voorbereiding van de volwassen hersenen met goed bewaarde morfologie is van cruciaal belang voor een dergelijke hersenen als geheel op basis van studies, maar kan technisch uitdagende en tijdrovend zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudig te leren, een stap dissectie aanpak van een volwassen vliegen kop in minder dan 10 s, terwijl de intacte hersenen aan de rest van het lichaam om verdere verwerkingsstappen vergemakkelijkt. De procedure helpt bij het verwijderen van de meeste oog en tracheale weefsels die normaal zijn voor de hersenen die kunnen interfereren met de latere beeldvormingsstap en plaatst ook minder eisen aan de kwaliteit van het ontleden tang. Daarnaast beschrijven we een eenvoudige methode die gemakkelijk omkeren van de gemonteerde hersenmonsters maakt op een dekglaasje, wat belangrijk is voor het afbeelden van beide zijden van de bregens met gelijke signaalintensiteit en kwaliteit. Als voorbeeld van het protocol, een analyse van dopaminerge (DA) neuronen presenteren we volwassen hersenen van WT (w 1118) vliegt. De hoge werkzaamheid van de dissectie methode maakt het bijzonder nuttig voor grootschalige volwassen hersenen-gebaseerde studies in Drosophila.

Figuur 1 illustreert de belangrijkste procedures voor volwassen hersenen dissectie, zoals hierboven beschreven figuren 2 en 3 zijn representatief afbeeldingen 3 dagen oude WT. (Genotype: w 1118) adulte hersenen, die werden costained met een antilichaam tegen tyrosine hydroxylase vlieg (TH , gekleurd in rood in figuur 2 en wit in figuur 3), een marker vaak gebruikt voor DA neuronen <su...

De volwassen Drosophila hersenen waardevol voor de studie van neuronale circuits, hogere hersenfuncties, en complexe aandoeningen. Een efficiënte methode om hele hersenweefsel van de kleine vlieg hoofd ontleden zal brain-based studies vergemakkelijken. Hier beschrijven we een eenvoudige, een-stap dissectie protocol van volwassen hersenen met goed bewaard gebleven morfologie.

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige dissectieprocedure in één stap voor volwassen Drosophila-hersenen te beschrijven, waarmee snel hersenen kunnen worden verkregen met een goed behouden morfologie die geschikt is voor whole mount-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van neurowetenschappen en genetica. Dit omvat de fijnmazige mapping van hersencircuits, het bestuderen van de effecten van genetische manipulaties van neuronen en de functionele karakterisering van genen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een procedure betreft die gemakkelijk te leren is. Hiermee kan een volwassen vliegenbrein met een goed behouden morfologie in minder dan 10 seconden worden gedissecteerd. Een video-demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het beheersen van het benodigde momentum bij het loslaten van de pincet om het exoskelet rond de kop van de vlieg weg te scheuren, vaardigheid en oefening vereist.Deze kleine, hinderlijke fruitvliegjes hebben ons veel geleerd over biologische principes. Ze kunnen ons mogelijk ook helpen bij het vinden van de oorzaken en behandelingen voor menselijke ziekten, zoals de ziekt

a-simple-one-step-dissection-protocol-for-whole-mount-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Deze video beschrijft een methode om intacte hersenen van volwassen vliegen onder een brugschuif te monteren en toont het protocol dat wordt uitgevoerd op immunostained hersenen voor fluorescerende microscopie.

Volwassen Drosophila-hersenen monteren: een methode om dia's voor confocale beeldvorming voor te bereiden

Deze video beschrijft hoe de volwassen Drosophila-hersenen kunnen worden ontleed en geïsoleerd - een procedure die nodig is voor het visualiseren van het orgaan, dat anders wordt verduisterd door de cuticula, het oog en het tracheaweefsel. Het voorbeeldprotocol toont een gedetailleerde demonstratie die hoogwaardige preparaten oplevert die kunnen worden gebruikt voor immunostaining- en beeldvormingsmethoden in de drosophila-neurobiologie.

Drosophila Volwassen hersendissectie: een methode in vliegneurobiologie

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.

Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren

Hier bieden we protocollen om drie eenvoudige door verwondingen veroorzaakte axondegeneratie (axondood) tests in Drosophila melanogaster uit te voeren om het morfologische en functionele behoud van afgehakte axonen en hun synapsen te evalueren.

Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster

Dit protocol beschrijft drie stappen om larvale en volwassen Drosophila optische kwabben voor te bereiden op beeldvorming: 1) hersendissecties, 2) immunohistochemie en 3) montage. De nadruk wordt gelegd op stap 3, omdat er verschillende montagerichtingen nodig zijn om specifieke optische lobstructuren te visualiseren.

Dissectie, immunohistochemie en montage van larvale en volwassen Drosophila-hersenen voor visualisatie van optische kwabben

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

Leer een eenvoudige één-staps dissectiemethode voor volwassen Drosophila-hersenen met behoud van morfologie. Deze techniek ondersteunt neurowetenschappelijk en genetisch onderzoek naar neurale circuits.

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult

Meer video's verkennen