Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult

Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige dissectieprocedure in één stap voor volwassen Drosophila-hersenen te beschrijven, waarmee snel hersenen kunnen worden verkregen met een goed behouden morfologie die geschikt is voor whole mount-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van neurowetenschappen en genetica. Dit omvat de fijnmazige mapping van hersencircuits, het bestuderen van de effecten van genetische manipulaties van neuronen en de functionele karakterisering van genen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een procedure betreft die gemakkelijk te leren is. Hiermee kan een volwassen vliegenbrein met een goed behouden morfologie in minder dan 10 seconden worden gedissecteerd. Een video-demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het beheersen van het benodigde momentum bij het loslaten van de pincet om het exoskelet rond de kop van de vlieg weg te scheuren, vaardigheid en oefening vereist.

Deze kleine, hinderlijke fruitvliegjes hebben ons veel geleerd over biologische principes. Ze kunnen ons mogelijk ook helpen bij het vinden van de oorzaken en behandelingen voor menselijke ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson. Immobiliseer een gebeneste vlieg met behulp van een dissectiemicroscoop ingesteld op een vergroting van 1,2 X en dompel deze onder in een koude dissectie-oplossing met het abdomen naar boven gericht.

Houd de pincet in een hoek van 160 tot 170 graden ten opzichte van de dissectieplaat en oefen vervolgens een kleine kracht uit op het abdomen van de vlieg. Dit zou de vlieg moeten immobiliseren, de kop 15 tot 25 graden naar achteren moeten dwingen en de proboscis naar boven moeten strekken. Na deze handeling zou een zacht, doorschijnend gebied van de cuticula onder de proboscis zichtbaar moeten worden.

Verhoog de vergroting en stel het brandvlak in op dit gebied. Neem met de dominante hand een dissectiepincet en oefen druk uit om de punten te sluiten. Plaats het pincet loodrecht op het pincet waarmee de vlieg wordt vastgehouden.

Steek de gesloten punten van de pincet door het zachte, doorschijnende deel van de cuticula, waarbij u erop let niet zo diep door te dringen dat de hersenen worden geraakt. Laat vervolgens de pincet snel, maar gelijkmatig, los zodat de punten openspringen en het exoskelet van de vliegenkop openscheuren. Gebruik de impuls van het loslaten van de pincetpunten om in één beweging het exoskelet en het grootste deel van de hoofdkapsel, inclusief het bijbehorende oog en de trachea, voorzichtig van het hersenweefsel te verwijderen.

Een intacte hersenen moeten nu zichtbaar zijn. Verwijder met de pincet voorzichtig de overgebleven hulpweefsels, zoals het wit vezelig tracheawefsel, waarbij u er goed op let dat u de hersenen zelf niet vasttrekt of beschadigt. Plaats de gedissekeerde hersenmonsters samen met de bijbehorende rompen gedurende 40 tot 60 minuten op ijs in ongeveer één milliliter 4%paraformaldehyde.

Verwijder het paraformaldehyde en spoel de monsters vervolgens met één milliliter 1X PBS door de oplossing drie keer op en neer te pipetteren, waarbij u er goed op let de hersenen niet weg te zuigen. Verwijder vervolgens de PBS en was vijf keer met één milliliter 1X PBT gedurende vijf minuten per keer onder nutatie. Voeg het gewenste primaire antilichaam in de juiste verdunning toe.

Incubeer de monsters vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius onder nutatie. Verwijder het primaire antilichaam en was de monsters vijf keer met 1 mL van 1X PBT gedurende vijf tot 10 minuten per wasbeurt onder nutatie. Voeg het secundaire antilichaam toe aan de gewassen monsters tegen de juiste verdunning en incubatietijd.

Was daarna de monsters zes keer in één milliliter 1X PBT gedurende 10 minuten per keer onder nutatie. Deze stap is cruciaal om eventuele aspecifiek gebonden secundaire antilichamen te verwijderen. Incubeer de monsters in een verdunning van 1:10.000 van 1 mg/mL DAPI in één milliliter 1X PBT-oplossing gedurende 30 tot 60 minuten onder nutatie.

Spoel ten slotte de monsters door één milliliter 1X PBS toe te voegen en de oplossing vervolgens drie keer op en neer te pipetteren. Plaats een dekglas op een objectglas. Breng de hersenen in 1X PBS-oplossing met een pipet met een afgeknipt tipje over naar het dekglas.

Scheid vervolgens de hersenen van de lichamen met een pincet. Gebruik een fijne pipetpunt om de vloeistof rondom het hersenweefsel te verwijderen. Voeg daarna 20 tot 40 µL anti-fade monteermedium toe.

Spreid de hersenen voorzichtig uit, terwijl het viskeuze medium naar buiten wordt verplaatst. Begin aan één zijde en laat voorzichtig een tweede dekglas op de monsters zakken, waarbij u erop let dat contact tussen de hersenen en luchtbellen wordt geminimaliseerd. Laat de glaasjes zetten en verwijder vervolgens overtollig vloeistof van de rand van de glaasjes met een laboratoriumdoekje.

Gebruik een klein stukje plakband om het paar dekglasjes tijdelijk aan de objectglasplaat te bevestigen. Gebruik voor het beeldvormen van de monsters een samengestelde fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop. Deze afbeeldingen tonen anterieure en posterieure aanzichten van dezelfde volwassen Drosophila.

Celkernen werden gevisualiseerd door middel van DAPI-kleuring en neuronen werden gelabeld met een pan-neuronaal marker en anti-ELAV-antilichamen. Dopaminerge, of DA, neuronen werden aangetoond met een anti-TH-antilichaamkleuring. Vergelijkbare intensiteitsniveaus werden waargenomen tussen beide zijden van het brein voor alle beeldkanalen.

Vergrote weergaven van het anterieure en posterieure deel van het brein maken een gedetailleerde bestudering van de DA-neuronenclusters mogelijk. Het gepaarde anterieure mediale cluster is zichtbaar in de anterieure beelden, en de gepaarde posterieure mediale en gepaarde posterieure laterale clusters bevinden zich aan de posterieure zijde van het brein. Kwantificering van deze neuronen onthulde dat driedaagse mannelijke vliegen van de w1118-stam doorgaans 27 DA-neuronen in het PPM-cluster in het gehele brein hebben, 16 in het PPL-cluster per hemisfeer en vijf in het PAL-cluster per hemisfeer.

In elk van de PAM-clusters werd gemiddeld 97 DA-neuronen waargenomen. 3D-reconstructie van de PAL- en PAM-clusters toonde tevens aan dat de DA-neuronen in de PAM-cluster relatief kleine afmetingen en een zwakkere TH-kleuring vertonen dan die in de andere clusters, zoals de PAL. Steeds meer studies richten zich op de hersenen van volwassen vliegen om moleculaire pathways en neurale circuits te ontleden die ten grondslag liggen aan hogere hersenfuncties, en om menselijke hersenziekten te modelleren.

Bij dergelijke hersenonderzoeken is het noodzakelijk om hersenmonsters met een goed behouden morfologie efficiënt voor te bereiden. Dit kan vooral van belang zijn bij grootschalige screenings van de hersenen. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik moeite had om vliegen met de pincet vast te houden.

In plaats van de pincetten met scherpe punten die de meeste Drosophila-onderzoekers gebruiken, probeerde Shebna pincetten met stompe uiteinden en merkte dat het makkelijker was om de hersenen te dissekeren. Zodra men deze techniek onder de knie heeft, kan deze in minder dan 10 seconden worden uitgevoerd als dit correct gebeurt. Eenmaal heb ik ongeveer 100 hersenen van zes verschillende genotypen voor één experiment in slechts één dag gedissekeerd.

Hoewel deze dissectieprocedure eenvoudig lijkt, is het belangrijk om deze eerst te oefenen met vliegen die niet essentieel zijn voor het onderzoek. De onderzoeker kan wellicht moeite hebben met het positioneren van de pincetten zonder het brein van de vlieg te beschadigen. De gedissecteerde breinen kunnen worden gebruikt voor andere studies, zoals RNA in situ hybridisatie en de extractie van eiwit- en RNA-monsters uit breinweefsel.

Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om vliegenhersenen te dissekeren met een goed behouden morfologie. Wij voorzien dat er verbeteringen ontwikkeld kunnen worden om deze procedure eenvoudiger en sneller te maken. Dit zou in de toekomst mogelijk geautomatiseerd kunnen worden voor grootschalige studies.

Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde en de scherpe dissectie-pincetten gevaarlijk kan zijn. Neem voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, bij het hanteren van fixeeroplossingen, en plaats direct na voltooiing van de dissectie de dop op de pincetten voordat u ze weglegt.