Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay
11 januari 2017
We rapporteren en demonstreren een geoptimaliseerde nitrocellulose-bindendheidstest die kan worden gebruikt om de autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidinekinasen te kwantificeren. Onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van traditionele SDS-PAGE-gebaseerde technieken en biedt een waardevolle alternatief voor het karakteriseren van deze belangrijke eiwitten.
Het algemene doel van dit protocol is om autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidinekinasen te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van twee-component signaaltransductie. Zoals het effect van cognate stimuli op de eiwit-eiwit interacties op de autofosforylering van histidinekinasen.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge doorvoer methode is die kan worden gebruikt om nauwkeurig picomolen van gevormde fosfohistadine te detecteren en kinetische parameters voor histidinekinasen te verkrijgen. Als post-doctoraal fellow gebruik ik filtratie op nitrocellulose membranen om eiwit-gebonden radioactieve liganden te kwantificeren. Daarom was het logisch om een vergelijkbare techniek te ontwikkelen voor het kwantificeren van histidinefosforylering in bacteriële histidinekinasen.
Begin deze procedure met de voorbereiding van reagentia en materialen zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de 96-well dot-plot apparaat in te stellen, knip een stuk nitrocellulose membraan van acht centimeter bij 12 centimeter. Plaats het nitrocellulose in het dot-plot apparaat.
Zorg ervoor dat het membraan past zodat het apparaat afgesloten is en alle putjes volledig bedekt zijn door het membraan. Om het filtraat te verzamelen, verbind het apparaat met een secundaire zijarmkolf. Vanaf de klepsteel, verbind voldoende slangen om het apparaat comfortabel te kunnen gebruiken zonder de secundaire kolf te kantelen.
Verbind vervolgens de secundaire zijarmkolf met een afzuigvacuümbron. Controleer of het apparaat volledig afgesloten is door een vacuüm op het apparaat toe te passen. Als het apparaat correct is samengesteld, zal er een sterk vacuüm in alle putjes aanwezig zijn.
Alle slangverbindingen kunnen worden verpakt in Parafilm of Saran-folie om een strakke afsluiting te garanderen. Voorafgaand aan de start, bereid alle vier de reactiecomponenten voor als vier X stockoplossingen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng gelijke volumes reactiebuffer, histidinekinase en tweemaal gedistilleerd water.
Laat deze reactiecomponenten even op kamertemperatuur komen. Om de reactie te starten, voeg een volume gamma-32 P ATP-oplossing toe en meng door op en neer te pipetteren. Volg de verstreken reactietijd met een timer en laat de reactie doorgaan gedurende de gewenste tijd.
Demp de reactie. Voeg een aliquot van de reactie toe aan 325 millimolair fosforzuur. Plaats de gedempte reacties onmiddellijk op ijs totdat alle reacties zijn beëindigd.
Plaats het voorgeassembleerde 96-well dot-plot apparaat in een secundaire container. Deze container moet groot genoeg zijn om het apparaat gemakkelijk te kunnen demonteren, aangezien het apparaat en het membraan na gebruik radioactief zullen zijn. Breng een vacuüm aan op het 96-well dot-plot apparaat.
Zodra het apparaat onder vacuüm staat, pipet de gedempte reactie voorzichtig direct op het nitrocellulose membraan in elke put. Herhaal dit proces totdat alle reacties op het membraan zijn geladen. Aangezien de bindingscapaciteit van nitrocellulose groter is dan de hoeveelheid aangebrachte histidinekinase, kan worden aangenomen dat bijna alle kinase bindt aan het membraan wanneer het correct is geladen.
Pas op dat u, afhankelijk van het gebruikte apparaat, het nitrocellulose niet doorboort. Observeer dat de gehele reactie contact heeft gemaakt met het nitrocellulose. Het is gemakkelijk voor een deel van de reactie om aan de wanden van de put te blijven plakken.
Was de putjes met 100 microliter ijskoud 25 millimolair fosforzuur. Dit zal ervoor zorgen dat elk reactievolume dat mogelijk in de put is gevangen, het membraan bereikt, waardoor alle reacties volledig worden geladen. Laat het volledige volume door het membraan stromen.
Demonteer het apparaat voorzichtig voordat u het vacuüm uitschakelt. Houd er rekening mee dat zowel het apparaat als het nitrocellulose membraan op dit moment radioactief zijn. Verwijder geen enkel onderdeel van het apparaat uit de secundaire container.
Breng met behulp van een pincet het nitrocellulose membraan voorzichtig over van het apparaat naar een container met ongeveer 200 milliliter 25 millimolair ijskoud fosforzuur. Plaats een deksel op deze container, omdat de wasbeurt radioactief zal zijn. Op dit moment kan het vacuüm worden uitgeschakeld.
Plaats de container met het wasmembraan op een rocker. Laat het membraan gedurende 20 minuten zachtjes wiegen. Na 20 minuten, decanteer voorzichtig de gebruikte wasoplossing in een grote emmer voor tijdelijke afvalopslag.
Voeg 200 milliliter ijskoud 25 millimolair fosforzuur toe aan het membraan. Was het membraan op deze manier minimaal drie keer om achtergrond gamma-32 P ATP-signaal van het membraan te verwijderen. Test na de derde wasbeurt de gebruikte wasoplossing op straling met een Geigerteller.
Ga door met het wassen van het membraan totdat er geen signaal meer in de wasoplossing aanwezig is. Nadat het membraan voldoende is gewassen, laat het membraan kort luchtdrogen, wat doorgaans vijf minuten of minder duurt. Na de blootstelling van het nitrocellulose aan een fosforgroen, zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid u voor op Ponceau S-kleuring en ontkleur.
Dompel het nitrocellulose membraan kort in Ponceau S-kleuringsoplossing gedurende één tot twee minuten. Bevochtig het gehele membraan met de kleurstof voorafgaand aan ontkleuring. Decanteer vervolgens het overtollige Ponceau S van het membraan.
Spoel het membraan met tweemaal gedistilleerd water totdat alleen de vlekken van de histidinekinase zijn gekleurd. Merk op dat deze procedure alleen werkt als alle vlekken detecteerbare hoeveelheden eiwit bevatten. Knip met een schaar elke vlek op het nitrocellulose membraan uit.
Het is niet nodig om perfect langs de rand van de gekleurde vlek te snijden. Als het membraan voldoende is gewassen, is achtergrond vanwege de variërende grootte van de uitgesneden vlekken verwaarloosbaar. Het is alleen belangrijk om de hele vlek voor elke reactie uit te snijden.
Breng met behulp van een pincet elke vlek voorzichtig over in scintillatievialen. Er is ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde nitrocellulose-bindingsassay voor het kwantificeren van autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidinekinasen. De methode biedt significante voordelen ten opzichte van traditionele SDS-PAGE-technieken, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het karakteriseren van deze eiwitten.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Celbiologie
- Signaaltransductie
Achtergrond
- Histidinekinasen spelen een cruciale rol in twee-component signaalsystemen.
- Het begrijpen van hun autofosforylering is essentieel voor het ophelderen van signaalroutes.
- Traditionele methoden bieden mogelijk niet de gevoeligheid die nodig is voor eiwitten met een lage abundantie.
- Deze studie beoogt de kwantificering van histidinekinasen te verbeteren.
Doel van de Studie
- Om een hoge-doorvoer methode te ontwikkelen voor het detecteren van autofosforylering.
- Om de effecten van stimuli op eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken.
- Om kinetische parameters voor histidinekinasen te verkrijgen.
Gebruikte Methoden
- Filtratie op nitrocellulosemembranen.
- Kwantificering van eiwit-gebonden radioactieve liganden.
- Detectie van picomolen fosfohistidine.
- Karakterisering van de kinetische eigenschappen van de autofosforylering van histidinekinasen.
Belangrijkste Resultaten
- De geoptimaliseerde assay maakt nauwkeurige kwantificering van autofosforylering mogelijk.
- Hoge gevoeligheid maakt detectie van lage niveaus van fosfohistidine mogelijk.
- De methode biedt inzicht in de kinetische eigenschappen van histidinekinaseactiviteit.
- Het dient als een betrouwbaar alternatief voor traditionele SDS-PAGE-technieken.
Conclusies
- De nitrocellulose-bindingsassay is effectief voor het bestuderen van histidinekinasen.
- Deze benadering verbetert ons begrip van twee-component signaalsystemen.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies van eiwitinteracties omvatten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of bacterial histidine kinase autophosphorylation is critical for de-risking early discovery in anti-infective and microbiome-targeted R&D. The nitrocellulose binding assay enables high-throughput, sensitive detection of phosphohistidine, supporting robust target validation and mechanistic studies in two-component signaling systems. This capability enhances predictive confidence at the target interrogation and assay development inflection points, directly impacting portfolio triage and prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of histidine kinase activity in response to environmental or chemical stimuli.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the functional role of two-component signaling proteins.
- Facilitates robust target validation through direct measurement of autophosphorylation events.
- Improves predictive confidence for advancing bacterial signaling targets in discovery pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-throughput assay format for evaluating kinase activity across multiple conditions.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for screening compound libraries or protein modulators.
- Enables rapid assay setup and scalability for platform-based screening workflows.
- Supports reliable comparison of kinase activity under different experimental variables.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling quantification of pathway activation states.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation for bacterial signaling targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic data on target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This nitrocellulose binding assay fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a reusable platform for hypothesis testing and pathway analysis in bacterial systems.
- Discovery Biology: Quantifies autophosphorylation to clarify pathway activation and target engagement.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for evaluating modulators of kinase activity.
- Analytics: Generates quantitative readouts and standard curves for robust data comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by measuring functional pathway outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable assay for ongoing bacterial signaling research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, high-throughput, and reproducible assay workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of bacterial signaling targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabel handling and kinase assay design.
- Needs access to nitrocellulose filtration apparatus and scintillation counting infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data integrity.
- Adaptable to various bacterial kinase systems with appropriate optimization.
- Radioactivity safety protocols and waste management are essential operational requirements.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Setting up the 96-well Dot Blot Apparatus
2:02
Reaction Initiation and Quenching
2:57
Spotting of Quenched Reactions on Nitrocellulose
4:51
Nitrocellulose Processing
5:48
Preparing Nitrocellulose Membrane for Scintillation Counting
7:31
Results: Quantification of the Autophosphorylation of V. parahaemolyticus H-NOX Associated Histidine Kinase (Vp1876)
8:35
Conclusion
