Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay
11 januari 2017
We rapporteren en demonstreren een geoptimaliseerde nitrocellulose-bindendheidstest die kan worden gebruikt om de autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidinekinasen te kwantificeren. Onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van traditionele SDS-PAGE-gebaseerde technieken en biedt een waardevolle alternatief voor het karakteriseren van deze belangrijke eiwitten.
Het algemene doel van dit protocol is om autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidinekinasen te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van twee-component signaaltransductie. Zoals het effect van cognate stimuli op de eiwit-eiwit interacties op de autofosforylering van histidinekinasen.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge doorvoer methode is die kan worden gebruikt om nauwkeurig picomolen van gevormde fosfohistadine te detecteren en kinetische parameters voor histidinekinasen te verkrijgen. Als post-doctoraal fellow gebruik ik filtratie op nitrocellulose membranen om eiwit-gebonden radioactieve liganden te kwantificeren. Daarom was het logisch om een vergelijkbare techniek te ontwikkelen voor het kwantificeren van histidinefosforylering in bacteriële histidinekinasen.
Begin deze procedure met de voorbereiding van reagentia en materialen zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de 96-well dot-plot apparaat in te stellen, knip een stuk nitrocellulose membraan van acht centimeter bij 12 centimeter. Plaats het nitrocellulose in het dot-plot apparaat.
Zorg ervoor dat het membraan past zodat het apparaat afgesloten is en alle putjes volledig bedekt zijn door het membraan. Om het filtraat te verzamelen, verbind het apparaat met een secundaire zijarmkolf. Vanaf de klepsteel, verbind voldoende slangen om het apparaat comfortabel te kunnen gebruiken zonder de secundaire kolf te kantelen.
Verbind vervolgens de secundaire zijarmkolf met een afzuigvacuümbron. Controleer of het apparaat volledig afgesloten is door een vacuüm op het apparaat toe te passen. Als het apparaat correct is samengesteld, zal er een sterk vacuüm in alle putjes aanwezig zijn.
Alle slangverbindingen kunnen worden verpakt in Parafilm of Saran-folie om een strakke afsluiting te garanderen. Voorafgaand aan de start, bereid alle vier de reactiecomponenten voor als vier X stockoplossingen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng gelijke volumes reactiebuffer, histidinekinase en tweemaal gedistilleerd water.
Laat deze reactiecomponenten even op kamertemperatuur komen. Om de reactie te starten, voeg een volume gamma-32 P ATP-oplossing toe en meng door op en neer te pipetteren. Volg de verstreken reactietijd met een timer en laat de reactie doorgaan gedurende de gewenste tijd.
Demp de reactie. Voeg een aliquot van de reactie toe aan 325 millimolair fosforzuur. Plaats de gedempte reacties onmiddellijk op ijs totdat alle reacties zijn beëindigd.
Plaats het voorgeassembleerde 96-well dot-plot apparaat in een secundaire container. Deze container moet groot genoeg zijn om het apparaat gemakkelijk te kunnen demonteren, aangezien het apparaat en het membraan na gebruik radioactief zullen zijn. Breng een vacuüm aan op het 96-well dot-plot apparaat.
Zodra het apparaat onder vacuüm staat, pipet de gedempte reactie voorzichtig direct op het nitrocellulose membraan in elke put. Herhaal dit proces totdat alle reacties op het membraan zijn geladen. Aangezien de bindingscapaciteit van nitrocellulose groter is dan de hoeveelheid aangebrachte histidinekinase, kan worden aangenomen dat bijna alle kinase bindt aan het membraan wanneer het correct is geladen.
Pas op dat u, afhankelijk van het gebruikte apparaat, het nitrocellulose niet doorboort. Observeer dat de gehele reactie contact heeft gemaakt met het nitrocellulose. Het is gemakkelijk voor een deel van de reactie om aan de wanden van de put te blijven plakken.
Was de putjes met 100 microliter ijskoud 25 millimolair fosforzuur. Dit zal ervoor zorgen dat elk reactievolume dat mogelijk in de put is gevangen, het membraan bereikt, waardoor alle reacties volledig worden geladen. Laat het volledige volume door het membraan stromen.
Demonteer het apparaat voorzichtig voordat u het vacuüm uitschakelt. Houd er rekening mee dat zowel het apparaat als het nitrocellulose membraan op dit moment radioactief zijn. Verwijder geen enkel onderdeel van het apparaat uit de secundaire container.
Breng met behulp van een pincet het nitrocellulose membraan voorzichtig over van het apparaat naar een container met ongeveer 200 milliliter 25 millimolair ijskoud fosforzuur. Plaats een deksel op deze container, omdat de wasbeurt radioactief zal zijn. Op dit moment kan het vacuüm worden uitgeschakeld.
Plaats de container met het wasmembraan op een rocker. Laat het membraan gedurende 20 minuten zachtjes wiegen. Na 20 minuten, decanteer voorzichtig de gebruikte wasoplossing in een grote emmer voor tijdelijke afvalopslag.
Voeg 200 milliliter ijskoud 25 millimolair fosforzuur toe aan het membraan. Was het membraan op deze manier minimaal drie keer om achtergrond gamma-32 P ATP-signaal van het membraan te verwijderen. Test na de derde wasbeurt de gebruikte wasoplossing op straling met een Geigerteller.
Ga door met het wassen van het membraan totdat er geen signaal meer in de wasoplossing aanwezig is. Nadat het membraan voldoende is gewassen, laat het membraan kort luchtdrogen, wat doorgaans vijf minuten of minder duurt. Na de blootstelling van het nitrocellulose aan een fosforgroen, zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid u voor op Ponceau S-kleuring en ontkleur.
Dompel het nitrocellulose membraan kort in Ponceau S-kleuringsoplossing gedurende één tot twee minuten. Bevochtig het gehele membraan met de kleurstof voorafgaand aan ontkleuring. Decanteer vervolgens het overtollige Ponceau S van het membraan.
Spoel het membraan met tweemaal gedistilleerd water totdat alleen de vlekken van de histidinekinase zijn gekleurd. Merk op dat deze procedure alleen werkt als alle vlekken detecteerbare hoeveelheden eiwit bevatten. Knip met een schaar elke vlek op het nitrocellulose membraan uit.
Het is niet nodig om perfect langs de rand van de gekleurde vlek te snijden. Als het membraan voldoende is gewassen, is achtergrond vanwege de variërende grootte van de uitgesneden vlekken verwaarloosbaar. Het is alleen belangrijk om de hele vlek voor elke reactie uit te snijden.
Breng met behulp van een pincet elke vlek voorzichtig over in scintillatievialen. Er is ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde nitrocellulose-bindingsassay voor het kwantificeren van de autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidinekinasen. De methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele SDS-PAGE-technieken, waardoor het een waardevol instrument is voor het karakteriseren van deze eiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Celbiologie
- Signaaltransductie
Achtergrond
- Histidinekinasen spelen een cruciale rol in twee-componentensignaleringssystemen.
- Kennis van hun autofosforylering is essentieel voor het ontrafelen van signaleringspaden.
- Traditionele methoden bieden mogelijk niet de gevoeligheid die vereist is voor eiwitten in lage concentraties.
- Deze studie heeft tot doel de kwantificering van histidinekinasen te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een high-throughput methode te ontwikkelen voor het detecteren van autofosforylering.
- Om de effecten van stimuli op eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken.
- Om kinetische parameters voor histidinekinasen te verkrijgen.
Gebruikte Methoden
- Filtratie op nitrocellulosemembranen.
- Kwantificering van proteïne-gebonden radioactieve liganden.
- Detectie van picomolen fosfohistidine.
- Karakterisering van de autofosforyleringskinetiek van histidinekinasen.
Belangrijkste resultaten
- De geoptimaliseerde assay maakt een nauwkeurige kwantificering van autofosforylering mogelijk.
- De hoge gevoeligheid maakt de detectie van lage concentraties fosfohistidine mogelijk.
- De methode biedt kinetische inzichten in de activiteit van histidinekinase.
- Het dient als een betrouwbaar alternatief voor traditionele SDS-PAGE-technieken.
Conclusies
- De nitrocellulose-bindingsassay is effectief voor het bestuderen van histidinekinasen.
- Deze benadering vergroot ons begrip van twee-componentensignalering.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies van eiwitinteracties omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve meting van de autofosforylering van bacteriële histidinekinasen is essentieel voor het beperken van risico's tijdens de vroege ontdekkingsfase in anti-infectieve en op het microbioom gerichte R&D. De nitrocellulose-bindingsassay maakt high-throughput, sensitieve detectie van fosfohistidine mogelijk, wat robuuste targetvalidatie en mechanistische studies in twee-componentensignaleringssystemen ondersteunt. Deze mogelijkheid verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de cruciale overgangspunten van target-interrogatie en assayontwikkeling, wat een directe impact heeft op de triage en prioritering van de portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve analyse van histidinekinase-activiteit mogelijk in reactie op omgevings- of chemische stimuli.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de functionele rol van twee-componentensignaleringsproteïnen te verduidelijken.
- Faciliteert robuuste targetvalidatie door directe meting van autofosforyleringsgebeurtenissen.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het verder ontwikkelen van bacteriële signaleringstargets in discovery-pipelines.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd high-throughput assayformaat voor het evalueren van kinaseactiviteit onder meerdere condities.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingenbibliotheken of eiwitmodulatoren.
- Maakt een snelle assay-opzet en schaalbaarheid mogelijk voor platformgebaseerde screening-workflows.
- Ondersteunt een betrouwbare vergelijking van kinaseactiviteit onder verschillende experimentele variabelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door kwantificering van pathway-activatie toestanden mogelijk te maken.
- Faciliteert continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie voor bacteriële signaleringsdoelen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistische gegevens over target engagement te verschaffen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze nitrocellulose-bindingsassay past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot leadidentificatie en biedt een herbruikbaar platform voor hypothesetoetsing en pathway-analyse in bacteriële systemen.
- Discovery Biology: Kwantificeert autofosforylering om pathway-activatie en target-engagement te verduidelijken.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid voor het evalueren van modulatoren van kinase-activiteit.
- Analytics: Genereert kwantitatieve read-outs en standaardcurves voor een robuuste gegevensvergelijking.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt biomarker-afstemming door functionele pathway-outputs te meten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbare, aanpasbare assay voor voortdurend onderzoek naar bacteriële signalering.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit bij doelwitvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, high-throughput en reproduceerbare assay-workflows.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en bevordering van bacteriële signaleringsdoelwitten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met radiolabels en het ontwerp van kinase-assays.
- Toegang tot nitrocellulosefiltratieapparatuur en scintillatiemeting-infrastructuur is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid en data-integriteit.
- Aanpasbaar aan diverse bacteriële kinasesystemen mits passend geoptimaliseerd.
- Veiligheidsprotocollen voor radioactiviteit en afvalbeheer zijn essentiële operationele vereisten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Setting up the 96-well Dot Blot Apparatus
2:02
Reaction Initiation and Quenching
2:57
Spotting of Quenched Reactions on Nitrocellulose
4:51
Nitrocellulose Processing
5:48
Preparing Nitrocellulose Membrane for Scintillation Counting
7:31
Results: Quantification of the Autophosphorylation of V. parahaemolyticus H-NOX Associated Histidine Kinase (Vp1876)
8:35
Conclusion
