Name: Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer wild-type blocking PCR met directe sequencing voor het detecteren van lage frequentie somatische mutaties in botmergmonsters. Deze methode biedt hoge gevoeligheid voor myd88-genanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen dankbetuigingen.

Ethiek Verklaring: Alle testen van menselijke monsters werd uitgevoerd na het verkrijgen van Institutional Review Board (IRB) goedkeuring. 1. DNA-extractie uit FFPE weefsel, perifeer bloed en beenmergaspiraat <ol><li> Beenmerg FFPE weefsel met DNA FFPE extractiekit <ol><li> Beginnen FFPE weefsel van ongekleurd slides (5-10 secties 5-10 urn dikte). Opmerking: Als begin met weefsel spaanders, gebruik 3-6 secties 5-10 urn dikte en verder met stap 1.1.6. </li><li> Plaats dia&#39;s in een dia mand en voor te bereiden vier wassen reservoirs (twee voor xyleen en twee voor 100% alcohol). Voeg een minimumvolume van 600 ml oplossing voor elke mand. </li><li> Deparaffinize de objectglaasjes door het doen van een 5 min xyleen wassen in de eerste bak. Breng de objectglaasjes tweede xyleen wasreservoir gedurende nog 5 min. </li><li> Na deparaffineren Was de dia&#39;s met 100% alcohol gedurende 5 minuten. Breng de dia&#39;s naar de tweedealcoholwassing reservoir gedurende nog 5 min. </li><li> Laat de objectglaasjes volledig drogen in een zuurkast voor hen schrapen met een scheermesje in een microcentrifugebuis. OPMERKING: Indien een H &amp; E dia met tumorgebied aangegeven beschikbaar is, verplaats de geleiders en schraap alleen tumorgebied. </li><li> Ga verder met de instructies van de fabrikant handout opgenomen in de kit. </li></ol></li><li> Voor BM aspireren en perifere bloed <ol><li> Extract volgens de fabrikant instructies van hand-out met deze specificaties. LET OP: Er zijn tal van commercieel verkrijgbare kits en methoden voor DNA-extractie uit FFPE weefsels en cellen. Vrijwel alle kunnen worden gebruikt. Gebruik een methode die is vastgelegd in het laboratorium. <ol><li> Met 200 pi van perifeer bloed (PB) of 100 pl BM + 100 pi PBS. </li><li> Met 4 pi RNase A voorraadoplossing. </li><li> Elueer met 100 ul elutiebuffer. </li></ol></li></ol></li><li> DNA kwantificering<ol><li> DNA concentraties meet met behulp van een spectrofotometer zorgen voor een 260 nm / 280 nm verhouding van ongeveer 1,8 (bij zuiver DNA). Wanneer de verhouding aanzienlijk lager is, kan de aanwezigheid van eiwitten, fenol of andere verontreinigingen die kunnen interfereren met verdere toepassingen geven. </li><li> Passen DNA concentraties ongeveer 50-100 ng / ul met geschikte elutiebuffer. </li></ol></li></ol> 2. wildtype blokkeren PCR <ol><li> primer ontwerp <ol><li> Ontwerpen verkrijgen primers voor genen van belang volgens de eerder beschreven algemene richtlijnen PCR primer ontwerp 13. Omvatten M13-voorwaartse en achterwaartse universele sequencing primers in PCR primers. OPMERKING: De MyD88 assay ontwikkeld tot exon 5 van MyD88 amplificeren (G259 - N291) en 110 nucleotiden in het 5&#39; gebied intronische de splitsingsplaats en een deel van intron 4. De voorwaartse en achterwaartse primers bedekken ontworpen met een 5&#39; -M13 sequentie (M13-forward: TGT aaa acg acg gcc agt; M13-omgekeerde: cag gaa ACA GCT ATG acc) mogelijk te maken voor hybridisatie van complementaire sequencing primers (zie Materials Table). </li></ol></li><li> Locked Nucleic Acid Oligonucleotide ontwerp <ol><li> Het ontwerp van de blokkerende oligonucleotide op ongeveer 10-15 basen lang en complementair met de WT matrijs waarin mutant verrijking gewenst. OPMERKING: Een kortere oligo zal mismatch discriminatie te verbeteren. Om een ​​hoge specificiteit te bereiken, is het belangrijk te veel blokkeren van nucleotiden niet te gebruiken, omdat dit kan leiden tot een zeer &quot;sticky&quot; oligonucleotide. De inhoud en de lengte en nucleotide blokkering moet worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke nucleotide die moeten worden geblokkeerd. Het is belangrijk om hoge bindingsspecificiteit bereiken zonder afbreuk secondaire structuur en riskeren zelf-complementariteit. </li><li> Ontwerp het blokkeerorgaan oligo een Tm hebben 10-15 ° C boven het verlengstuk temperature tijdens thermocycli. Pas de Tm door het toevoegen of verwijderen blokkerende basen of door vervanging blokkeren basen DNA met vermijding van lange stukken (3-4 basen) blokkeren G of C basen. <ol><li> Navigeer naar de oligo gereedschappen website (zie tabel van Materialen) en selecteer de &quot;blokkerende Oligo Tm Prediction&quot; tool. </li><li> Plak de sequentie van het template WT die gewenst is geblokkeerd in het vak &quot;Oligo Sequence&quot;. Add &quot;+&quot; voor bases te blocker bases aan te geven. </li><li> Selecteer de &quot;Bereken&quot; knop om de geschatte Tm van de DNA-Blocker hybride te bepalen. </li></ol></li><li> Ontwerp de blokkerende oligo om de vorming van secundaire structuur of self-dimeren te vermijden. <ol><li> Navigeer naar de oligo gereedschappen website (zie tabel van Materialen) en selecteer de &quot;blokkerende Oligo Optimizer&quot; tool. </li><li> Plak de sequentie van het template WT die gewenst is geblokkeerd in het vak. Add &quot;+&quot; voor bases aan te geven blokkeren bases. </li><li> Selecteer de twee vakken voor &quot;Secundaire structuur&quot; en &quot;Self Only&quot;. Druk op de knop Analyseren om de oligo voor potentieel lastige secundaire structuren of zelf-dimeren te herzien. LET OP: De scores vertegenwoordigen zeer ruwe schattingen van de T m &#39;s van de secundaire structuren en zelf-dimeren. Lagere scores zijn dus optimaal en kan worden gerealiseerd door de blocker-blocker koppelen. De blokkerende oligonucleotide voor MyD88 [MYD88blocker (TCAGA AG + + C + G + A + C + G + T + A + T + CC / invdT /)] ontworpen aminozuren Q262-I266 bedekken en heeft een 3&#39;-omgekeerde dT beide verlenging door DNA-polymerase en afbraak door 3&#39;-exonuclease remmen. Deze specifieke blokkerende oligo is een 17-meer met 10 blokkerende basen die worden aangeduid als &quot;+ N&quot;. De resterende 7 basen zijn normale DNA nucleotiden. </li></ol></li></ol></li><li> WTB-PCR Setup en Thermocycling <ol><li> Bereid een WTB-PCR meester mix (MMX) met 2,5 ui PCR-reactiebuffer 10x w / 20 mM MgCl2, 250 uM dNTPs, 0,2 uM voorwaartse en reverse primer, 1,2 uM MYD88blocker en DNAse, RNAse-vrij, ultrazuivere H2O ter verkrijging van een uiteindelijke creëren oplossing volume van 21,75 gl per reactie. OPMERKING: Bedriifsconcentraties zijn voor het uiteindelijke reactievolume van 25 pl (na toevoeging van DNA template en polymerase). Conventionele PCR MMX wordt bereid door eenvoudig weglaten van de toevoeging van blokker. Alle stappen protocol blijft voor beide WTB en conventionele PCR. Dit kan worden gebruikt bij de validatie en het bepalen van de verrijking bereikt door toevoeging van blokker. <ol><li> Bij de berekening van MMX voorbereiding ervoor zorgen om rekening te houden met 3 extra reacties (positieve en negatieve controles en een niet-template controle om te controleren op contaminatie) en ten minste nog 1 reactiemengsel voor pipetteerfout. </li></ol></li><li> Vortex MMX grondig. De MMX kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot ayoor. </li><li> Voeg 0,25 ul Taq DNA polymerase per reactie op de MMX en zwenken om te mengen. Zodra de polymerase is toegevoegd aan de MMX, houd het op ijs. </li><li> Plaats een nieuwe 96 well PCR plaat op een koude plaat en pipetteer 22 pl met MMX polymerase aan elk reactieputje. </li><li> Voeg 3 ul genomisch DNA (50-100 ng / ul aan elk van de putjes die de MMX met polymerase. </li><li> Dicht de platen en centrifuge kort te zorgen voor de oplossing de bodem van elke put bereikt. </li><li> Laad de PCR plaat op een thermocycler. <ol><li> Stel de temperatuurrondvoercondities voor WTB-PCR-reactie als volgt: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 6 min; 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, primer annealing bij 56 ° C gedurende 30 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min 20 s; laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten. OPMERKING: Best practice betreft het invullen van de rest van het protocol in een fysiek gescheiden ruimte om amplicon besmetting te voorkomen in toekomst setups. </li></ol></li></ol></li><li> Voeren gelelektroforese volgens eerder beschreven protocollen 14 om te bepalen of WTB-PCR succesvol was en een gebrek aan amplificatie in de niet-matrijsstreng controle bevestigen. </li><li> Zuivering van PCR product door magnetische beads <ol><li> Verwijder magnetische korrels bij 4 ° C en breng aan kamertemperatuur. </li><li> Breng 10 pl PCR product aan een nieuwe PCR-plaat. </li><li> Vortex de magnetische korrels krachtig volledig resuspenderen van de magnetische deeltjes. </li><li> Voeg 18 ul magnetische bolletjes aan elk goed op de nieuwe plaat. Pipet mengen 10 keer. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats de PCR-plaat op de zijde rokken magneetplaat gedurende 2 min te scheiden beads uit de oplossing. </li><li> Zuig het supernatant met een meerkanaalspipet, vermijden de kraal pellet. </li><li> Afzien 150 pl 70% ethanol in elk putje en incuberen bij kamertemperatuur for ten minste 30 s. Zuig het ethanol met een multichannel pipet en tips te verwijderen. Herhaal deze wasprocedure eens te meer. </li><li> Toepassing van een 20 pi multikanaalspipet zuig het resterende ethanol uit elk putje en tips ontdoen. </li><li> Zodra putjes droog (~ 10 min) verwijderen uit magneetplaat en voeg 40 ul nuclease-vrij water aan elk putje en pipet mix 15 keer of wervel voorzichtig. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Plaats de PCR-plaat op magneetplaat gedurende 1 min tot afzonderlijke korrels uit de oplossing. </li><li> Overdracht 35 pi gezuiverd produkt een nieuwe PCR-plaat. Dit gezuiverde PCR-product kan nu doorgaan met bidirectionele sequentiebepaling of kan worden opgeslagen bij -20 ° C totdat het nodig is. OPMERKING: Bij de ontwikkeling van een nieuw assay kan kwantificatie van gezuiverde PCR-product vereist. 1-3 ng / ul amplicon DNA optimaal is voor bidirectionele sequentiebepaling. Indien concentratie constant laag verhogen PCR product en magnetische korrels proportionally (1: 1,8). Indien concentratie constant hoog, elueer met een groter volume water. </li></ol></li></ol> 3. Sequencing van WTB-PCR-product <ol><li> Bi-Directional Sequencing OPMERKING: Het volgende protocol is een gemodificeerde vorm van de instructies van de fabrikant die is geoptimaliseerd om minder reagentia gebruiken. <ol><li> Bereid voorwaartse en omgekeerde sequentiereactie mengt met 0,25 gl Ready Reaction mix, 1,88 pl Sequencing Buffer, 1,78 uM M13-F of M13-R sequencing primers en voeg en DNAse, RNAse-vrij, ultrazuivere H2O ter verkrijging van een uiteindelijke oplossing te creëren volume van 9 pi per reactie. Deze sequentie reactiemengsel kan tot een jaar opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Pipet 9 ul van de voorwaartse sequentie reactiemengsel in elk putje van een nieuwe 96-puts PCR platen voor de voorwaartse sequentie reactie. Herhaal op een afzonderlijke plaat voor de omgekeerde sequentiereactie. </li><li> Voeg 1 ul van het gezuiverde PCR-product WTB to elk putje van zowel de voorwaartse en achterwaartse platen. </li><li> Dicht de platen en centrifuge kort te zorgen voor de oplossing de bodem van elke put bereikt. </li><li> Laad de PCR plaat op een thermocycler. <ol><li> Stel de temperatuurrondvoercondities de sequentie reactie als volgt: 96 ° C gedurende 1 min; 30 cycli van 96 ° C gedurende 10 s, 50 ° C gedurende 5 seconden, 60 ° C gedurende 4 min; houden op 4 ° C tot gereed voor zuivering. </li></ol></li></ol></li><li> Zuiver Sequencing Producten <ol><li> Bereid een verse 1:25 oplossing van 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 100% ethanol. </li><li> Bereid een verse 70% ethanol-oplossing. </li><li> Voeg 30 ul natriumacetaat / 100% ethanol oplossing in elk putje van zowel de voorwaartse en teruggaande sequentie borden en pipet mengsel 5 maal. </li><li> Bedek de plaat en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 2250 xg gedurende 15 min. </li><li> Verwijder het plaatafsluiter en zwenken over een verspillingcontainer. LET OP: Omkeren slechts één of de korrel kan los te maken uit de put bodems. </li><li> Plaats de omgekeerde plaat op een schone papieren handdoek en centrifugeer bij 150 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg 150 ul 70% ethanol aan elk putje. </li><li> Bedek de plaat en draaien bij 2250 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Herhaal stap 3.2.6 en 3.2.7. </li><li> Als de putten zijn niet helemaal droog, laat ze aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de monsters worden beschermd tegen het licht tijdens het drogen. </li><li> Voeg 10 pi formamide aan elk putje en pipet mix 10 keer. Bedek de plaat. </li><li> Denatureren op thermocycler bij 95 ° C gedurende 3 min gevolgd door 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Na denaturering vervangen plaatafdichter met een septum en reeks aan sequentiebepaling platform volgens instructies van de fabrikant 15. </li></ol></li></ol> 4. Analyse van sequentiebepalingsresultaten <ol><li> Visualiseren sequencing sporen met behulp van een sequentie DATeen analyse software volgens de instructies van de fabrikant en lijn 16 met de respectievelijke referentiesequenties. Uitlijnen MyD88 naar NCBI referentiesequentie &quot;NM_002468&quot;. </li></ol>

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/96/16/9236.abstract">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+and+high+sensitivity+test+for+MYD88+mutations+using+locked+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid.</a> Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).</li>
<li>Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+blocking+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+single+nucleotide+minority+mutations+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.</a> Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).</li>
<li>Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+All+Next+Generation+Sequencing+Diagnostics+are+Created+Equal%3A+Understanding+the+Nuances+of+Solid+Tumor+Assay+Design+for+Somatic+Mutation+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection.</a> Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).</li>
<li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+estimates+of+clonal+evolution+and+subclonal+heterogeneity+can+arise+from+PCR+duplicates+in+deep+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments.</a> Genome Biol. 15 (8), 420(2014).</li>
<li>Varettoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+the+MYD88+%28L265P%29+somatic+mutation+in+Waldenstr%C3%B6m%27s+macroglobulinemia+and+related+lymphoid+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms.</a> Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYD88+L265P+in+Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%2C+immunoglobulin+M+monoclonal+gammopathy%2C+and+other+B-cell+lymphoproliferative+disorders+using+conventional+and+quantitative+allele-specific+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction.</a> Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).</li>
<li>Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%3A+2012+update+on+diagnosis%2C+risk+stratification%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management.</a> Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).</li>
<li>Salar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/124/21/1690">MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL).</a> Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).</li>
<li>Ngo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenically+active+MYD88+mutations+in+human+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma.</a> Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).</li>
<li>Pasqualucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+coding+genome+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).</li>
<li>Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://imbi.bio.indiana.edu/includes/content/documents/3730%20Usage/ABI%203730%20User%20guide.pdf">User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4474242A.pdf">User Guide for SeqScape Software 3</a>. , (2012).</li>
<li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).</li>
<li>Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+mutation+artifacts+after+formalin+fixation+and+error+prone+translesion+synthesis+during+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR.</a> BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).</li>
<li>Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+and+K-ras+mutation+analysis+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+comparison+of+paraffin+embedded+versus+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol%22%5BJournal%5D)">EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens.</a> Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).</li>
<li>Solassol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+detection+in+paired+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+colorectal+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues.</a> Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).</li>
<li>Yost, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high-confidence+somatic+mutations+in+whole+genome+sequence+of+formalin-fixed+breast+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens.</a> Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).</li>
<li>Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+sequence+artifacts+in+amplicon-based+massively+parallel+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+DNA+by+enzymatic+depletion+of+uracil-containing+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.</a> Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).</li>
<li>Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+amplification+of+rare+mutations+using+locked+nucleic+acid+oligonucleotides+that+competitively+inhibit+primer+binding+to+wild-type+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA.</a> J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).</li>
<li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+methods+for+rapid+detection+and+quantification+of+DNMT3A+R882+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia.</a> J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).</li>
<li>Parsons, B. L., Heflich, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+selection+methods+for+the+direct+analysis+of+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Muta+Res%22%5BJournal%5D)">Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations.</a> Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).</li>
<li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+amplification%3A+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li>
<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De WTB-PCR-test beschreven maakt gebruik van een generieke reeks primers met een blokkerende oligo ontworpen om amplificatie van WT DNA blokkeren tijdens verlenging (Figuur 1). De WTB-PCR-product wordt vervolgens gesequenced voor mutatie-analyse. De bruikbaarheid van WTB-PCR / Sanger ligt in de eenvoud, hoge gevoeligheid en hoge doorvoer. Met de hier beschreven richtlijnen kunnen de meeste bestaande Sanger gebaseerde testen eenvoudig gemodificeerd worden door de toevoeging van een blokkerend oligonucleo...

Sanger sequencing is van oudsher de gouden standaard in het testen voor zowel bekende als onbekende somatische mutaties geweest. Een van de beperkingen van Sanger sequentiebepaling is de detectiegrens (~ 10-20% mutant allel in een achtergrond van WT) 1. Dit niveau van gevoeligheid is niet geschikt voor het detecteren van lage somatische mutaties die in de monsters aanwezig kan zijn van premaligne weefsels of patiënten met weinig circulerende tumorcellen, of wanneer beenmerg (BM) is fragmentarisch. Dit maakt het ook de beoordeling van residuele ziekte na de behandeling of het opsporen van opkomende resistentie mutaties tijdens de behandeling bemoeilijkt door alleen 2 conventionele sequencing. Door vervanging van conventionele PCR met gesloten nucleïnezuur (LNA) gemedieerde wildtype blokkerende PCR (WTB-PCR) Sanger sequentiebepaling, gevoeligheden van maximaal 0,1% mutante allel in een achtergrond van WT worden gerealiseerd 2, 3, 4. InWTB-PCR, verrijking van mutante allelen wordt bereikt door de toevoeging van een korte (~ 10-14 NT) blokkeren (LNA) oligonucleotide dat bij voorkeur bindt aan WT DNA waardoor voorkomen amplificatie van WT DNA. De mutant-verrijkte WTB PCR-product kan daarna worden gesequenst. Door het blokkeren WT DNA in plaats van het selecteren op mutaties WTB-PCR maakt verrijking van zowel bekende als onbekende mutaties aanwezig in minieme celfracties. Meerdere methoden worden momenteel gebruikt voor het detecteren van mutaties in kleine cellen fracties. Dit omvat allelspecifieke PCR-amplificatie-refractaire mutatiesysteem (ARMS), denaturerende vloeistofchromatografie (DHPLC), korrels, emulsies, amplificatie en magnetisme (stralend), elektrisch veld geïnduceerde afgifte en meting (Efirm), hoge resolutie smeltpunt en anderen. Echter, de meeste van deze methoden zijn beperkt door vals-positieven en de mogelijkheid om slechts één mutatie dat de test is ontworpen voor 4 sporen </sup&gt;. WTB-PCR, echter, kan de gebruiker sequencing sporen waarbij de detectie van verschillende types mutaties mogelijk maakt en kan helpen bij het uitsluiten van vals positieven als gevolg van artefacten of deaminering te visualiseren. Nieuwe generatie sequencing (NGS) kan een geschikt alternatief voor conventionele sequencing bieden echter aanzienlijk hogere kosten, complexiteit en langere analysetijd maken het onnodig optie voor veel soorten ziekte met enkele verschillende moleculaire merkers of controle van patiënten therapie voor opkomende resistentie mutaties. Verder hoge vals positieven bij het detecteren van varianten met gemuteerde allel een frequentie van minder dan 5% kan problemen opleveren voor amplicon gebaseerde NGS 5, 6. Hier laten we zien de toename van de gevoeligheid verkregen door WTB-PCR screenen op mutaties in de myeloïde differentiatie factor 88 gen zoals beschreven door Albitar et al. 3 MyD88 mutations zijn belangrijke diagnostische en prognostische factoren in Waldenström Macroglobulinemia (WM), IgM monoclonale gammopathie van onbekende betekenis (IgM-MGUS), milt marginale zone lymfoom (SMZL) en diffuus grootcellig B-cellymfoom (DLBCL). MyD88 mutaties gevonden in bijna alle gevallen van WM en ongeveer 50% van de patiënten met immunoglobuline M (IgM) -secreting MGUS. Daartegenover zijn MyD88 mutaties gevonden in slechts 0-6% van de patiënten met SMZL en afwezig zijn bij multipel myeloom 7, 8. Omdat overlappende morfologische, immuunfenotypische, cytogenetische en klinische kenmerken tussen WM en SMZL of IgM-multiple myeloom vaak bemoeilijken differentiaaldiagnoses kan de aanwezigheid van een mutatie MyD88 een nuttig identificeren factor 9. MyD88 mutaties zijn ook geassocieerd met een grotere ziektelast bij patiënten met DLBCL en slechte algemene overleving na behandeling 7, </sup&gt; 10. Bovendien, omdat MyD88 mutaties voorkomen bij geactiveerde B-cel-achtige (ABC) DLBCL dan kiemcentrum B-cel-achtige (GCB) DLBCL of primaire mediastinale B-cellymfoom (PMBL) kan MyD88 mutatiestatus als dienst surrogaat marker voor de ABC-subtype 11, 12. De gedetailleerde protocol die hier als een matrijs waaruit nieuwe assays kunnen worden ontwikkeld en de meeste bestaande sequentie bepalingen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan laagfrequente mutaties in diverse soorten monsters nauwkeurig te detecteren. De benadering kan ook worden gebruikt voor het bewaken en detecteren van resistente mutaties die kunnen ontwikkelen tumoren of zelfs bacteriën die kan optreden terwijl patiënten behandeld met gerichte therapie of antibiotica. Verder behandelt het en rechtsmiddelen veel van de problemen in verband met mutatie verrijking, met name in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel.

<table><tbody><tr><td>1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% alcohol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol</td></tr><tr><td>3730XL sequencer</td><td>ABI</td><td></td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Voor magnetische kraal PCR zuivering</td></tr><tr><td>Aluminum sealing foils</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>Voor PCR en koude opslag</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>Voor bi-directionele sequencing. Met 5x Sequencing Buffer</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 Series</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP rotor (voor PCR plate)</td></tr><tr><td>Cold plate for 96 well plates</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse-free, ultra-pure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side-Skirted Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>Voor gebruik in PCR zuivering.</td></tr><tr><td>Ethanol Absolute&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>Exiqon website Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/&micro;L)</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>Met10x geconcentreerde PCR reactie buffer, met 20 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td></td><td></td><td>2% agarose gel</td></tr><tr><td>GeneRead DNA FFPE extraction Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>Bevat uracil DNA glycosylase noodzakelijk voor het verminderen van sequencing artefacten</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>Voor sequencing.</td></tr><tr><td>LNA oligonucleotide</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA basen)</td></tr><tr><td>M13-F Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Model 5430</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 rotor (voor 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR reverse primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR plates</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1.000 &micro;L</td></tr><tr><td>Plate septa, 96 well</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Voor BM aspiraat en perifeer bloed</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>Voor sequencing analyse</td></tr><tr><td>Slide basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtered pipette tips</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1.000 &micro;L</td></tr><tr><td>Thermomixer C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wash reservoir</td><td></td><td></td><td>~ 1.000 mL</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Histology grade</td></tr></tbody></table>

wild-blokkering van pcr in combinatie met direct sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor low-frequency somatische mutaties

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Nauwkeurige detectie en identificatie van laagfrequente mutaties kan problematisch zijn bij de beoordeling residuele ziekte na therapie screenen op opkomende resistentie mutaties tijdens de therapie, of wanneer patiënten hebben weinig circulerende tumorcellen. Wildtype blokkerende PCR en sequentieanalyse biedt een hoge gevoeligheid, flexibiliteit en eenvoud een methode voor detecteren van deze laagfrequente mutaties. Door een speciaal ontworpen vergrendeld nucleïnezuur oligonucleotide een nieuwe of eerder vastgestelde conventionele PCR sequencing assay kan gevoeligheden van ongeveer 1 mutant allel in een achtergrond van 1000 WT allelen worden bereikt (1: 1000). Sequencing artefacten geassocieerd met deaminering gebeurtenissen die algemeen in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels kan gedeeltelijk verholpen door het gebruik van uracil DNA glycosylase gedurende extractiestappen. De geoptimaliseerde protocol hier specifiek is voor het detecteren MyD88 mutatie, maar kan als een sjabloon voor elk model te dienenWTB-PCR-bepaling. Eigenschappen WTB-PCR-test op andere gewoonlijk gebruikte bepalingen voor het detecteren van lage frequentie mutaties waaronder allelspecifieke PCR en real-time kwantitatieve PCR onder minder voorkomen van valse positieven, grotere flexibiliteit en gemak van implementatie en het vermogen zowel bekende detecteren en onbekende mutaties.

Een conceptueel overzicht van WTB-PCR gedurende het doortrekken wordt in Figuur 1. Omdat een enkele nucleotide mismatch in de blocker-DNA-hybride aanzienlijk verlaagt de smelttemperatuur (ATm = 20-30 ° C), amplificatie van het WT allel geblokkeerd terwijl mutant template DNA vrij verlengstuk 17 te voltooien. Op deze wijze wordt mutant DNA exponentieel geamplificeerd terwijl WT DNA lineair geamplificeerd. <p class="jove_content" fo:k...

Wild-type blocking PCR gevolgd door directe sequentiebepaling biedt een zeer gevoelige detectiemethode voor somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters.

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters. Deze methodologie kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij somatisch mutatietesten door de detectie van mutaties met een zeer lage frequentie te vergemakkelijken. Hier zullen we zoeken naar mutaties in het myd88-gen in beenmergmonsters.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer nauwkeurige en gevoelige informatie verschaft over de aanwezigheid van somatische mutaties, zelfs bij zeer weinig neoplastische cellen. Deze sequencing-assay, gebaseerd op wild-type-blokkerende PCR, is ontwikkeld om een deel van exon vijf in het myd88-gen te amplificeren, waardoor dekking van de L265-hotspot wordt gegarandeerd. De forward- en reverse-primers zijn ontworpen met een 5'-M13-sequentie om het annealen van complementaire sequencing-primers mogelijk te maken.Ontwerp het blokkerende oligonucleotide met een lengte van ongeveer 10 tot 15 basen, complementair aan het wildtype-template waar verrijking van mutanten gewenst is. Een korter oligo zal de discriminatie van mismatches verbeteren. Om een hoge doelspecificiteit te bereiken is het belangrijk om niet te veel blokkerende nucleotiden te gebruiken, aangezien dit zal leiden tot zeer kleverige oligonucleotiden.Om het blokkerende oligonucleotide te ontwerpen, gaat u eerst naar de website van Oligo Tools. Selecteer de Oligo TM prediction tool. Er wordt een nieuw venster geopend.Plak de sequentie van het wild-type template dat geblokkeerd moet worden in het vak voor de oligo-sequentie. Voeg een plusteken vóór de blokkerende basen toe om deze te markeren. Klik op de berekeningsknop om de geschatte TM van het DNA-blokkerhybride te bepalen.De berekende smelttemperaturen verschijnen in de onderstaande vakken. Ontwerp de blokkerende oligo zodat de smelttemperatuur 10 tot 15 graden Celsius boven de extensietemperatuur tijdens de thermocycling ligt. In dit geval is de extensietemperatuur 72 graden Celsius.Om de smelttemperatuur aan te passen, kunt u blokerende basen toevoegen, verwijderen of vervangen. Vermijd lange reeksen van drie tot vier blokerende C- of G-basen. Ga vervolgens, om de vorming van secundaire structuren of zelf-dimerisatie te voorkomen, terug naar het startscherm van de website van Oligo Tools en selecteer de tool Oligo Optimizer.Er wordt een nieuw venster geopend. Plak de sequentie van het wildtype-sjabloon dat geblokkeerd moet worden in het vak. Voeg een plusteken toe om de blokkerende basen aan te geven.Selecteer alleen de twee vakjes voor secundaire structuur en 'self' en druk op de analyseknop om de scores voor hybridisatie en secundaire structuur te zien. Deze scores zijn zeer ruwe schattingen van respectievelijk de smelttemperaturen van de zelf-dimeren en de secundaire structuren. Lagere scores zijn optimaal en kunnen worden bereikt door de pairing tussen blockers te beperken.Verwijder of verplaats blokkerende nucleotiden om lagere scores te bereiken. Het hier getoonde geoptimaliseerde blokkerende oligonucleotide voor myd88 vormt een balans tussen de smelttemperatuur van het DNA-blokkerhybride en voldoende lage scores voor hybridisatie en secundaire structuur. Het is ontworpen om aminozuren Q262 tot I266 te bestrijken en bevat een 3'-inverted DT om zowel extensie door DNA-polymerase als degradatie door 3'-exonuclease te remmen.Zodra de primers zijn ontworpen, wordt de blokkerende PCR voor het wildtype opgezet en wordt de thermocycling uitgevoerd zoals beschreven in het bijbehorende document. Haal de magnetische beads uit de opslag bij vier graden Celsius en laat ze op kamertemperatuur komen. Breng 10 µL van het PCR-product over naar een nieuwe PCR-plaat.Vortex de magnetische korrels krachtig om de magnetische deeltjes volledig te resuspenderen en voeg vervolgens 18 µL magnetische korrels toe aan elke put van de nieuwe plaat. Pipetteer 10 keer op en neer om te mengen. Incubeer de plaat vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur.Plaats na de incubatie de PCR-plaat gedurende twee minuten op de magnetische plaat met zijranden om de beads van de oplossing te scheiden. Gebruik een multikanalenpipet om het supernatant af te zuigen. Zorg ervoor dat de bead-pellet niet wordt aangeraakt.Dispenseer vervolgens 150 µL 70% ethanol in elke put en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 seconden. Aspireer daarna de ethanol met een meerkanaals pipet en gooi de tips weg. Herhaal deze wasprocedure nogmaals.Zuig met een 20 µL multichannelpipet de resterende ethanol uit elke well en gooi de tips weg. Laat de wells van de plaat ongeveer 10 minuten drogen, haal de plaat vervolgens van de magneet en voeg 40 µL nucleasevrij water toe aan elke well. Pipetteer 15 keer op en neer om te mengen.Incubeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de PCR-plaat na incubatie één minuut terug op de magneetplaat om de beads van de oplossing te scheiden. Breng 35 µL van het gezuiverde product over naar een nieuwe PCR-plaat en voer bidirectionele sequencing uit zoals beschreven in het bijbehorende document.Zodra de bidirectionele sequenering is voltooid, bereid dan voor de zuivering van de sequeneringsproducten een verse oplossing voor van 3 M natriumacetaat bij pH 5,2 in 100% ethanol. Bereid daarnaast een verse oplossing van 70% ethanol. Voeg aan elke put van zowel de forward- als reverse-sequeneringsplaten 30 µL natriumacetaat in 100% ethanol toe en pipetteer dit vijf keer op en neer om te mengen.Sluit de plaat vervolgens opnieuw en incubeer deze 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Nadat er 20 minuten zijn verstreken, centrifugeert u de plaat 15 minuten bij 2.250 ×g. Verwijder na het centrifugeren de plaatafsluiting en keer de plaat één keer om boven een afvalbak.Als de plaat meerdere keren wordt omgedraaid, kunnen de pellets loskomen van de bodem van de putjes. Plaats de omgedraaide plaat op een schoon vel keukenpapier en centrifugeer een minuut lang bij 150 ×g. Voeg vervolgens 150 µL 70% ethanol toe aan elk putje en sluit de plaat opnieuw af.Centrifugeer 5 minuten bij 2.250 ×g. Herhaal vervolgens het proces van het verwijderen van de plaatsealer en het omkeren van de plaat. Als de putjes niet volledig droog zijn, laat ze dan aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.Zorg ervoor dat de monsters worden beschermd tegen licht. Zodra de putjes volledig droog zijn, voegt u 10 µL formamide aan elk putje toe en pipetteert u dit 10 keer op en neer om te mengen. Sluit de plaat opnieuw af.Denatureer met een thermocycler bij 95 °C gedurende drie minuten, gevolgd door 4 °C gedurende vijf minuten. Vervang na denaturatie de plaatsealer door een septum en voer de sequencing uit op een sequencingplatform volgens de instructies van de fabrikant. Visualiseer de traces met behulp van software voor sequentieanalyse en lijn de sequenties uit met de juiste referentiesequenties.Lijn myd88 uit met de NCBI-referentiesequentie NM002468. Genomisch DNA van patiënten met en zonder mutaties werd onderworpen aan zowel conventionele als wild-type blocking PCR, waarna de resulterende PCR-producten werden gesequenced. Zoals hier te zien is, werd het mutante allel verrijkt wanneer wild-type blocking PCR werd uitgevoerd, en werden er geen fout-positieven waargenomen in wild-type DNA.Een karakteristieke afname in signaalintensiteit, zoals hier getoond, wordt vaak waargenomen wanneer een te hoge concentratie blocker wordt gebruikt, of wanneer de zuivering na de PCR er niet in is geslaagd de blocker te verwijderen vóór de bidirectionele sequencing. Dit gebeurt wanneer enzymatische zuivering wordt uitgevoerd in plaats van zuivering met magnetische beads. Elke PCR-gebaseerde assay die mutante allelen verrijkt, zal artefacten met een lage frequentie detecteren.Deze sporen laten een toename zien van CG-sequencing-artefacten ten opzichte van TA-artefacten in FFPE-weefsel wanneer cytosine of gemethyleerd cytosine via formalinefixatie respectievelijk worden gedeamineerd tot uracil of thymine. Uracil-DNA-glycosylase of UDG kan uracil excideren vóór de wild-type blokkerende PCR, wat helpt bij het verminderen van sequencing-artefacten. Echter kan thymine, resulterend uit gedeamineerd 5-methylcytosine dat frequent voorkomt bij CpG-eilanden, niet door UDG worden geëxsideerd.Het verlagen van de concentratie van de blocker die wordt gebruikt bij wild-type blocking PCR kan helpen om het voorkomen van sequentieruis te verminderen die niet door UDG-behandeling wordt verholpen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe somatische mutaties met een hoge mate van nauwkeurigheid en sensitiviteit kunnen worden getest met behulp van de wild-type blocking techniek. Het principe van deze technologie kan worden toegepast op de detectie van mutaties in kleine subpopulaties van cellen.Daarom is het bruikbaar voor het detecteren van minimale residuele ziekte, het monitoren van patiënten en het voorspellen van vroege recidieven bij patiënten met verschillende neoplasieën.

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

This video describes wild-type blocking polymerase chain reaction, or WTB-PCR, which detects somatic mutations. The PCR-based technique uses a locked nucleic acid, or LNA, an oligonucleotide that binds to its complementary wild-type allele and blocks its elongation. The blocking selectively allows the amplification of low-level mutant alleles over their wild-type variants in the sample.

Wild-Type Blocking PCR to Detect Low-Frequency Somatic Mutations

We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

Dit manuscript beschrijft klinische protocollen voor twee next-generation sequencing panelen. Het ene paneel onderzoekt hematologische maligniteiten, terwijl het andere paneel zich richt op genen die vaak gemutaeerd zijn in solide tumoren. Moleculaire classificatie van drivermutaties in humane maligniteiten biedt waardevolle prognostische en voorspellende informatie.

Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren

Het doel van deze video wijzen voor geautomatiseerde DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen en digitale druppeltje PCR (ddPCR) analyse zeldzame mutaties te detecteren in een klinische setting voeren. Detecteren van mutaties in FFPE monsters toont de klinische bruikbaarheid van ddPCR in FFPE monsters.

Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.

Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

Dit artikel introduceert de toepassing van een laagfrequente detectiemethode op basis van Sanger-sequencing bij angioimmunoblastisch lymfoom. Zorg voor een basis voor het toepassen van deze methode op andere ziekten.

Wild-type blokkerende PCR gecombineerd met Sanger-sequencing voor detectie van laagfrequente somatische mutatie

Enkele cel sequencing is een steeds populairder en toegankelijk instrument voor de aanpak van genomische veranderingen op hoge resolutie. Wij bieden een protocol dat enkele cel sequencing gebruikt om het aantal kopieën veranderingen te identificeren in enkele cellen.

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Leer wild-type blocking PCR met directe sequencing voor het detecteren van lage frequentie somatische mutaties in botmergmonsters. Deze methode biedt hoge gevoeligheid voor myd88-genanalyse.

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties (Video) | JoVE Journal

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Meer video's verkennen