Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters. Deze methodologie kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij somatisch mutatietesten door de detectie van mutaties met een zeer lage frequentie te vergemakkelijken. Hier zullen we zoeken naar mutaties in het myd88-gen in beenmergmonsters.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer nauwkeurige en gevoelige informatie verschaft over de aanwezigheid van somatische mutaties, zelfs bij zeer weinig neoplastische cellen. Deze sequencing-assay, gebaseerd op wild-type-blokkerende PCR, is ontwikkeld om een deel van exon vijf in het myd88-gen te amplificeren, waardoor dekking van de L265-hotspot wordt gegarandeerd. De forward- en reverse-primers zijn ontworpen met een 5'-M13-sequentie om het annealen van complementaire sequencing-primers mogelijk te maken.

Ontwerp het blokkerende oligonucleotide met een lengte van ongeveer 10 tot 15 basen, complementair aan het wildtype-template waar verrijking van mutanten gewenst is. Een korter oligo zal de discriminatie van mismatches verbeteren. Om een hoge doelspecificiteit te bereiken is het belangrijk om niet te veel blokkerende nucleotiden te gebruiken, aangezien dit zal leiden tot zeer kleverige oligonucleotiden.

Om het blokkerende oligonucleotide te ontwerpen, gaat u eerst naar de website van Oligo Tools. Selecteer de Oligo TM prediction tool. Er wordt een nieuw venster geopend.

Plak de sequentie van het wild-type template dat geblokkeerd moet worden in het vak voor de oligo-sequentie. Voeg een plusteken vóór de blokkerende basen toe om deze te markeren. Klik op de berekeningsknop om de geschatte TM van het DNA-blokkerhybride te bepalen.

De berekende smelttemperaturen verschijnen in de onderstaande vakken. Ontwerp de blokkerende oligo zodat de smelttemperatuur 10 tot 15 graden Celsius boven de extensietemperatuur tijdens de thermocycling ligt. In dit geval is de extensietemperatuur 72 graden Celsius.

Om de smelttemperatuur aan te passen, kunt u blokerende basen toevoegen, verwijderen of vervangen. Vermijd lange reeksen van drie tot vier blokerende C- of G-basen. Ga vervolgens, om de vorming van secundaire structuren of zelf-dimerisatie te voorkomen, terug naar het startscherm van de website van Oligo Tools en selecteer de tool Oligo Optimizer.

Er wordt een nieuw venster geopend. Plak de sequentie van het wildtype-sjabloon dat geblokkeerd moet worden in het vak. Voeg een plusteken toe om de blokkerende basen aan te geven.

Selecteer alleen de twee vakjes voor secundaire structuur en 'self' en druk op de analyseknop om de scores voor hybridisatie en secundaire structuur te zien. Deze scores zijn zeer ruwe schattingen van respectievelijk de smelttemperaturen van de zelf-dimeren en de secundaire structuren. Lagere scores zijn optimaal en kunnen worden bereikt door de pairing tussen blockers te beperken.

Verwijder of verplaats blokkerende nucleotiden om lagere scores te bereiken. Het hier getoonde geoptimaliseerde blokkerende oligonucleotide voor myd88 vormt een balans tussen de smelttemperatuur van het DNA-blokkerhybride en voldoende lage scores voor hybridisatie en secundaire structuur. Het is ontworpen om aminozuren Q262 tot I266 te bestrijken en bevat een 3'-inverted DT om zowel extensie door DNA-polymerase als degradatie door 3'-exonuclease te remmen.

Zodra de primers zijn ontworpen, wordt de blokkerende PCR voor het wildtype opgezet en wordt de thermocycling uitgevoerd zoals beschreven in het bijbehorende document. Haal de magnetische beads uit de opslag bij vier graden Celsius en laat ze op kamertemperatuur komen. Breng 10 µL van het PCR-product over naar een nieuwe PCR-plaat.

Vortex de magnetische korrels krachtig om de magnetische deeltjes volledig te resuspenderen en voeg vervolgens 18 µL magnetische korrels toe aan elke put van de nieuwe plaat. Pipetteer 10 keer op en neer om te mengen. Incubeer de plaat vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur.

Plaats na de incubatie de PCR-plaat gedurende twee minuten op de magnetische plaat met zijranden om de beads van de oplossing te scheiden. Gebruik een multikanalenpipet om het supernatant af te zuigen. Zorg ervoor dat de bead-pellet niet wordt aangeraakt.

Dispenseer vervolgens 150 µL 70% ethanol in elke put en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 seconden. Aspireer daarna de ethanol met een meerkanaals pipet en gooi de tips weg. Herhaal deze wasprocedure nogmaals.

Zuig met een 20 µL multichannelpipet de resterende ethanol uit elke well en gooi de tips weg. Laat de wells van de plaat ongeveer 10 minuten drogen, haal de plaat vervolgens van de magneet en voeg 40 µL nucleasevrij water toe aan elke well. Pipetteer 15 keer op en neer om te mengen.

Incubeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de PCR-plaat na incubatie één minuut terug op de magneetplaat om de beads van de oplossing te scheiden. Breng 35 µL van het gezuiverde product over naar een nieuwe PCR-plaat en voer bidirectionele sequencing uit zoals beschreven in het bijbehorende document.

Zodra de bidirectionele sequenering is voltooid, bereid dan voor de zuivering van de sequeneringsproducten een verse oplossing voor van 3 M natriumacetaat bij pH 5,2 in 100% ethanol. Bereid daarnaast een verse oplossing van 70% ethanol. Voeg aan elke put van zowel de forward- als reverse-sequeneringsplaten 30 µL natriumacetaat in 100% ethanol toe en pipetteer dit vijf keer op en neer om te mengen.

Sluit de plaat vervolgens opnieuw en incubeer deze 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Nadat er 20 minuten zijn verstreken, centrifugeert u de plaat 15 minuten bij 2.250 ×g. Verwijder na het centrifugeren de plaatafsluiting en keer de plaat één keer om boven een afvalbak.

Als de plaat meerdere keren wordt omgedraaid, kunnen de pellets loskomen van de bodem van de putjes. Plaats de omgedraaide plaat op een schoon vel keukenpapier en centrifugeer een minuut lang bij 150 ×g. Voeg vervolgens 150 µL 70% ethanol toe aan elk putje en sluit de plaat opnieuw af.

Centrifugeer 5 minuten bij 2.250 ×g. Herhaal vervolgens het proces van het verwijderen van de plaatsealer en het omkeren van de plaat. Als de putjes niet volledig droog zijn, laat ze dan aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.

Zorg ervoor dat de monsters worden beschermd tegen licht. Zodra de putjes volledig droog zijn, voegt u 10 µL formamide aan elk putje toe en pipetteert u dit 10 keer op en neer om te mengen. Sluit de plaat opnieuw af.

Denatureer met een thermocycler bij 95 °C gedurende drie minuten, gevolgd door 4 °C gedurende vijf minuten. Vervang na denaturatie de plaatsealer door een septum en voer de sequencing uit op een sequencingplatform volgens de instructies van de fabrikant. Visualiseer de traces met behulp van software voor sequentieanalyse en lijn de sequenties uit met de juiste referentiesequenties.

Lijn myd88 uit met de NCBI-referentiesequentie NM002468. Genomisch DNA van patiënten met en zonder mutaties werd onderworpen aan zowel conventionele als wild-type blocking PCR, waarna de resulterende PCR-producten werden gesequenced. Zoals hier te zien is, werd het mutante allel verrijkt wanneer wild-type blocking PCR werd uitgevoerd, en werden er geen fout-positieven waargenomen in wild-type DNA.

Een karakteristieke afname in signaalintensiteit, zoals hier getoond, wordt vaak waargenomen wanneer een te hoge concentratie blocker wordt gebruikt, of wanneer de zuivering na de PCR er niet in is geslaagd de blocker te verwijderen vóór de bidirectionele sequencing. Dit gebeurt wanneer enzymatische zuivering wordt uitgevoerd in plaats van zuivering met magnetische beads. Elke PCR-gebaseerde assay die mutante allelen verrijkt, zal artefacten met een lage frequentie detecteren.

Deze sporen laten een toename zien van CG-sequencing-artefacten ten opzichte van TA-artefacten in FFPE-weefsel wanneer cytosine of gemethyleerd cytosine via formalinefixatie respectievelijk worden gedeamineerd tot uracil of thymine. Uracil-DNA-glycosylase of UDG kan uracil excideren vóór de wild-type blokkerende PCR, wat helpt bij het verminderen van sequencing-artefacten. Echter kan thymine, resulterend uit gedeamineerd 5-methylcytosine dat frequent voorkomt bij CpG-eilanden, niet door UDG worden geëxsideerd.

Het verlagen van de concentratie van de blocker die wordt gebruikt bij wild-type blocking PCR kan helpen om het voorkomen van sequentieruis te verminderen die niet door UDG-behandeling wordt verholpen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe somatische mutaties met een hoge mate van nauwkeurigheid en sensitiviteit kunnen worden getest met behulp van de wild-type blocking techniek. Het principe van deze technologie kan worden toegepast op de detectie van mutaties in kleine subpopulaties van cellen.

Daarom is het bruikbaar voor het detecteren van minimale residuele ziekte, het monitoren van patiënten en het voorspellen van vroege recidieven bij patiënten met verschillende neoplasieën.