Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties
29 maart 2017
Wild-type blocking PCR gevolgd door directe sequentiebepaling biedt een zeer gevoelige detectiemethode voor somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters.
Het algemene doel van deze procedure is om lage frequentie somatische mutaties in verschillende monstersoorten te detecteren. Deze methodologie kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in somatische mutatietests door het vergemakkelijken van de detectie van zeer lage frequentie mutaties. Hier zullen we op zoek gaan naar mutaties in het myd88-gen in beenmergmonsters.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer nauwkeurige en gevoelige informatie geeft over de aanwezigheid van somatische mutaties, zelfs met zeer weinig neoplastische cellen. Deze op wild type blokkerende PCR gebaseerde sequencing test is ontwikkeld om een deel van exon vijf in het myd88-gen te versterken, waardoor dekking van de L265 hotspot wordt gegarandeerd. De voorwaartse en achterwaartse primers zijn ontworpen met een vijf prime M13 sequentie om een knielen van complementaire sequencing primers mogelijk te maken.
Ontwerp het blokkerende oligonucleotid zodat het ongeveer 10 tot 15 basen lang is en complementair is aan de wild type sjabloon waar mutant verrijking gewenst is. Een kortere oligo zal mismatch discriminatie verbeteren. Om hoge doelspecificiteit te bereiken is het belangrijk om niet te veel van de blokkerende nucleotiden te gebruiken, aangezien dit resulteert in zeer kleverige oligonucleotiden.
Om het blokkerende oligonucleotid te ontwerpen begint u door naar de Oligo Tools website te navigeren. Selecteer de Oligo TM voorspelling tool. Er zal een nieuw venster openen.
Plakken de sequentie van de wild type sjabloon die geblokkeerd moet worden in het oligo sequentie vak. Voeg een plusteken toe voor de blokkerbasen om ze te markeren. Klik op de bereken knop om de geschatte TM van de DNA blokker hybride te bepalen.
De berekende smelttemperaturen zullen in de onderstaande vakken verschijnen. Ontwerp het blokkerende oligo zodat het een smelttemperatuur heeft van 10 tot 15 graden Celsius boven de extensietemperatuur tijdens thermocycling. Hier is de extensietemperatuur 72 graden Celsius.
Om de smelttemperatuur aan te passen, voeg toe, verwijder of vervang blokkerbasen. Vermijd lange reeksen van drie tot vier blokkerende C of G basen. Ga vervolgens terug naar de startpagina van de Oligo Tools website en selecteer de Oligo Optimizer tool.
Er zal een nieuw venster openen. Plakken de sequentie van de wild type sjabloon die geblokkeerd moet worden in het vak. Voeg een plusteken toe om blokkerbasen aan te geven.
Selecteer de twee vakken voor secundaire structuur en zelf alleen en druk op de analyseer knop om de scores voor hybridisatie en secundaire structuur te zien. Deze scores vertegenwoordigen zeer ruwe schattingen van de smelttemperaturen van de zelf dimers en secundaire structuren respectievelijk. Lagere scores zijn optimaal en kunnen worden bereikt door beperking van blocker blocker paring.
Verwijder of herpositioneer blokkerende nucleotiden om lagere scores te bereiken. Het geoptimaliseerde blokkerende oligonucleotid voor myd88 dat hier wordt getoond, slaagt erin een balans te vinden tussen de smelttemperatuur van de DNA blokker hybride en voldoende lage hybridisatie en secundaire structuur scores. Het is ontworpen om aminozuren Q262 tot I266 te bedekken, en bevat een drie prime omgekeerde DT om zowel extensie door DNA polymerase als degradatie door drie prime exonuclease te remmen.
Zodra de primers zijn ontworpen, zet de wild type blokkerende PCR op en voer thermocycling uit zoals beschreven in het bijbehorende document. Verwijder magnetische korrels uit de opslag bij vier graden Celsius en breng ze naar kamertemperatuur. Breng 10 microliter van het PCR-product over naar een nieuwe PCR-plaat.
Vortex de magnetische korrels krachtig om de magnetische deeltjes volledig te hersuspenderen en voeg vervolgens 18 microliter van de magnetische korrels toe aan elke put op de nieuwe plaat. Pipetteer 10 keer op en neer om te mengen. Bewaar vervolgens de plaat gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Na de incubatie plaats de PCR-plaat gedurende twee minuten op de zijkant van de magneetplaat om de korrels van de oplossing te scheiden. Gebruik een meerkanaals pipet om het supernatant te aspireren. Zorg ervoor dat u de korrels neerlaat.
Gebruik vervolgens een 20 microliter meerkanaals pipet om het resterende ethanol uit elke put te aspireren en gooi de tips weg. Na ongeveer 10 minuten te hebben laten drogen verwijdert u de plaat van de magneet en voegt u 40 microliter nuclease vrij water toe aan elke put. Pipetteer 15 keer op en neer om te mengen.
Bewaar vervolgens gedurende twee minuten op kamertemperatuur. Na de incubatie plaatst u de PCR-plaat weer gedurende een minuut op de magneetplaat om de korrels van de oplossing te scheiden. Breng 35 microliter van het gezuiverde product over naar een nieuwe PCR-plaat en voer bidirectioneel sequencing uit zoals beschreven in het bijbehorende document.
Nadat bidirectioneel sequencing is uitgevoerd om de sequencing producten te zuiveren, bereidt u een verse een in 25 oplossing van drie molair natriumacetaat bij PH 5.2 en 100%ethanol voor. Bereid ook een verse oplossing van 70%ethanol voor. Voeg voor elke put van zowel de voorwaartse als achterwaartse sequencing platen 30 microliter natriumacetaat toe in 100%ethanol en pipetteer 5 keer op en neer om te mengen.
Verzegeld vervolgens de plaat en bewaar deze 20 minuten in het donker op kamertemperatuur. Nadat de 20 minuten zijn verstreken, centrifugeert u de plaat bij 2.250 keer G gedurende 15 minuten. Na het draaien verwijdert u de plaatverzegeling en draait u de plaat eenmaal om over een afvalcontainer.
Als de plaat meerdere keren wordt omgedraaid, kunnen de pellets loskomen van de putbodems. Plaats de omgekeerde plaat op een schone papieren handdoek en centrifugeert u gedurende een minuut bij 150 keer G. Voeg vervolgens 150 microliter 70%ethanol toe aan elke put en verzegel de plaat opnieuw.
Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 2.250 keer G. Herhaal vervolgens het proces van het verwijderen van de plaatverzegeling en omdraaien van de plaat. Als de putten niet volledig droog zijn, laat ze dan op kamertemperatuur drogen.
Z
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt een methode voor het detecteren van somatische mutaties met een lage frequentie middels wild-type blokkerende PCR gevolgd door directe sequencing. De techniek is bijzonder effectief voor het analyseren van beenmergmonsters op mutaties in het myd88-gen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Genetica
- Oncologie
- Moleculaire Biologie
Achtergrond
- Somatische mutaties kunnen met lage frequenties voorkomen in diverse weefsels.
- Het detecteren van deze mutaties is cruciaal voor het begrijpen van de cancerbiologie.
- Traditionele methoden missen mogelijk de gevoeligheid die nodig is voor detectie bij een lage frequentie.
- Wild-type blocking PCR biedt een nieuwe benadering om de detectiecapaciteiten te verbeteren.
Doel van de studie
- Om de detectie van somatische mutaties met een lage frequentie te verbeteren.
- Om specifiek mutaties in het myd88-gen te targeten.
- Om de effectiviteit van de wild-type blocking PCR-methode te valideren.
Gebruikte methoden
- Wild-type blocking PCR werd gebruikt om specifieke genregio's te amplificeren.
- Directe sequencing werd uitgevoerd om mutaties te identificeren.
- Beenmergmonsters werden geanalyseerd op de aanwezigheid van mutaties.
- Primers werden ontworpen om dekking van de L265 hotspot in exon vijf te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- De methode detecteerde met succes mutaties met een lage frequentie in beenmergmonsters.
- Er werd een hoge sensitiviteit en nauwkeurigheid bereikt bij het identificeren van somatische mutaties.
- De resultaten bevestigden de aanwezigheid van mutaties in het myd88-gen.
- De techniek toonde potentieel aan voor bredere toepassingen bij mutatietests.
Conclusies
- Wild-type blocking PCR is een waardevolle tool voor het detecteren van somatische mutaties met een lage frequentie.
- Deze methode kan ons begrip van genetische veranderingen bij kanker vergroten.
- Verder onderzoek kan het gebruik ervan in klinische omgevingen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het detecteren van somatische mutaties met een lage frequentie is cruciaal voor het monitoren van minimale residuele ziekte, het identificeren van opkomende resistentie en het sturen van therapeutische beslissingen bij de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen. De wild-type blocking PCR-methode verhoogt de sensitiviteit tot ongeveer 1 mutant allel per 1.000 wild-type allelen, wat bijdraagt aan de vroege detectie van tumorevolutie. Deze mogelijkheid verbetert het voorspellende vertrouwen in preklinische en translationele studies door een betrouwbare beoordeling van genetische heterogeniteit mogelijk te maken bij beperkte monsterhoeveelheden, zoals circulerende tumorcellen of beenmergaspiraten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het detecteren van mutantallelen met een lage abundantie in heterogene monsters.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door middel van nauwkeurige kwantificering van de mutatielast in preklinische modellen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in studies naar targetmodulatie door het verminderen van het aantal fout-negatieven bij mutatiedetectie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve sequencing-outputs die echte mutaties met een lage frequentie onderscheiden van achtergrondruis.
- Operationele waarde: Produceert gestandaardiseerde, reproduceerbare mutante-verrijkte amplicons die geschikt zijn voor downstream sequencing-workflows.
- Platformnut: Faciliteert de schaalbaarheid en het hergebruik van de assay over meerdere gen-targets via een aanpasbaar ontwerp van blokkerende oligonucleotiden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft translationele continuïteit door mutaties te detecteren in ziekterelevante systemen, zoals beenmergmonsters.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van de frequentie van mutante allelen mogelijk om de therapeutische respons en het ontstaan van resistentie te beoordelen.
- Risicobeperking: Ondersteunt preklinische go/no-go-beslissingen door meetbare drempelwaarden voor clonale evolutie te bieden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm vanaf de vroege targetvalidatie via lead-optimalisatie tot preklinische efficiëntietests, in het bijzonder wanneer het monitoren van genetische alteraties de selectie van verbindingen stuurt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door detectie van somatische mutaties in relevante genpaden mogelijk te maken.
- Screening: Levert gezuiverde, assay-klare PCR-producten met verminderde wild-type interferentie voor betrouwbare variant calling.
- Analytics: Biedt bidirectionele sequencing-readouts die allel-specifieke visualisatie en kwantificering mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met biomarker-afstemming via mutatietracking in klinisch relevante monstertypes.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een modulair detectieplatform dat toepasbaar is op meerdere oncogenen buiten MYD88.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellend vertrouwen bij mutatiedetectie en vermindert mechanistische ambiguïteit in resistentiestudies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door bead-gebaseerde zuivering en gecontroleerd ontwerp van blocker-oligonucleotiden.
- Strategische waarde: Informeert betere go/no-go-beslissingen door vroegtijdige detectie van resistentie-verlenende mutaties mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door laagfrequente resistente klonen te identificeren vóór expansie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in oligonucleotide-ontwerp en optimalisatie van de smelttemperatuur voor effectieve blokkering van het wildtype.
- Afhankelijk van toegang tot thermocyclers, magnetische kraal-zuiveringssystemen en bidirectionele sequencingsplatforms.
- Vereist standaardisatie van de concentratie van het blokkerende oligonucleotide om sequencing-artefacten te minimaliseren.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillendest soorten monsters, zoals FFPE-weefsel of vloeibare biopsieën.
- Houdt rekening met praktische beperkingen, waaronder potentiële residuele sequencing-artefacten door deaminering-gebeurtenissen die niet volledig zijn opgelost door uracil-DNA-glycosylase.
