Grootschalige Reconstructies en Onafhankelijk, Unbiased Clustering Gebaseerd op morfologische Metrics om neuronen te classificeren in Selective Populaties
15 februari 2017
Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van selectieve neuronale populaties, het label na retrograde infectie met een gemodificeerde rabiësvirus uiten van fluorescerende markers, en onafhankelijke, onpartijdige cluster analyses waarmee uitgebreide karakterisering van morfologische metrics onder verschillende neuronale subklassen.
De doelstellingen van dit protocol zijn het beschrijven van de stappen om de morfologie van virusgelabelde neuronen te reconstrueren en het uitvoeren van onafhankelijke, onbevooroordeelde clusteranalyses op populaties van gelabelde neuronen, om een uitgebreide karakterisering van morfologische metrieken binnen verschillende neuronale subklassen mogelijk te maken. Wij schetsen een nieuwe aanpak voor het verzamelen en analyseren van neuroanatomische gegevens om een meer uitgebreide bemonstering en onbevooroordeelde classificatie van morfologisch unieke neuronale typen binnen een selectieve neuronale populatie te faciliteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het grootschalige analyse van neuronale morfologie mogelijk maakt en gebruikmaakt van onbevooroordeelde methoden om verschillende neuronale subklassen te classificeren.
De meest uitdagende aspecten van morfologische reconstructies zijn het selecteren van goed geïsoleerde neuronen voor reconstructie, het toekennen van de juiste z-diepte en het uitlijnen van dendrietbomen om reconstructies over aangrenzende weefselcoupes voort te zetten. Begin een reconstructie door een objectglas te selecteren met een gekleurde brain tissue section van 50 micron van een primaat dat stereotactisch is geïnjecteerd met een gemodificeerd rabiësvirus dat EGFP tot expressie brengt. Plaats het objectglas in de objectglashouder van de microscoop en focus met een objectief met lage vergroting op een enkele sectie van belang.
Zorg ervoor dat het camerabeeld zichtbaar is in het live-beeld door de camerashutter correct te positioneren. Kies een redelijk geïsoleerd gelabeld neuron binnen de betreffende hersenstructuur om een ondubbelzinnige reconstructie van de dendritische arborisatie mogelijk te maken. Schakel over naar 10x vergroting en stel het gebied scherp.
Kies bij voorkeur neuronen waarvan het cellichaam volledig binnen één enkele sectie ligt, om de oppervlakte en rondheid nauwkeurig te kunnen schatten. Zodra een goed gekleurd en goed geïsoleerd neuron is gekozen, klikt u in de software op de knop voor een nieuwe sectie om de startsectie met het cellichaam aan de sectiemanager toe te voegen. Voer het aantal secties in dat in de reconstructie moet worden opgenomen.
Het wordt aanbevolen om te beginnen met het inbrengen van twee tot drie coupes. Stel een coupesdikte van 50 microns in. Kies het 2x objectief, klik vervolgens op de contourknop in de bovenste werkbalk en selecteer het contourtype uit het vervolgkeuzemenu.
Volg de contour van de doelstructuur door met de muis op punten langs de contour te klikken. Wanneer het volgen van de contour is voltooid, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u 'close contour' in het menu om de contour te sluiten. Klik vervolgens, terwijl de weergave nog op twee x staat, op het gewenste markeersymbool in de linkerwerkbalk.
Klik vervolgens op het centrum van de doelstructuur om de markering te plaatsen. Zodra de contouren voltooid zijn, selecteert u het 40x of 60x objectief om de omtrek van het cellichaam te traceren. Selecteer daarna de knop voor neuron-tracing in de bovenste werkbalk en kies in het vervolgkeuzemenu de te traceren neuronstructuur, in dit geval het cellichaam.
Traceer het cellichaam door op punten rondom de grootste omvang van het cellichaam te klikken, waarbij de z-diepte indien nodig wordt aangepast om het cellichaam in focus te brengen. Klik vervolgens met de rechtermuisknop om de contour van het cellichaam te voltooien. Plaats daarna een markering van een andere stijl in het centrum van de contour van het cellichaam, waarbij u erop let dat de markering wat betreft de z-diepte ongeveer in het midden staat.
Het is essentieel om de juiste z-diepte vast te stellen in het beginsegment, evenals in de aangrenzende segmenten, voordat u met elke tracering begint, zodat de z-aswaarden nauwkeurig zijn. Om te beginnen met het traceren van dendritische bomen, selecteert u 'dendrite' in het bovenste vervolgkeuzemenu.
Volg vervolgens elke dendriet beginnend bij het cellichaam. Wanneer een dendriet vertakt, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u 'bifurcating node' of 'trifurcating node' om een knooppunt bij dit vertakkingspunt te plaatsen. Zorg ervoor dat u de z-diepte gedurende het traceren aanpast om de hoek en richting van de dendriet nauwkeurig vast te leggen.
Klik met de rechtermuisknop aan het uiteinde van de dendriet in dit segment en selecteer 'ending' uit het vervolgkeuzemenu. Wanneer alle dendritische bomen in het startsegment zijn getraceerd, identificeert u de dendritische uiteinden die waarschijnlijk doorlopen in het aangrenzende segment. Breng deze in focus op de juiste z-diepte in het microscopische beeld bij 20x.
Neem belangrijke herkenningspunten in de nabijheid op in de microscopische afbeelding, zoals bloedvaten of gemakkelijk herkenbare dendrietpatronen of -bundels. Maak vervolgens een foto van het live-beeld met een digitale camera die handmatig voor het computerscherm wordt gehouden. Schakel daarna het microscoopobjectief naar 2x en ga naar de aangrenzende sectie op het preparaat.
Lijn vervolgens de contouren van de eerder getraceerde sectie in de softwareweergave uit met de grenzen van de LGN en TRN in de nieuwe sectie. Keer terug naar 20x en voer de uitlijning uit met behulp van herkenningspunten. Verplaats vervolgens de tracering om de dendrieten uit te lijnen met behulp van de foto van de dendrietuiteinden uit de eerder getraceerde sectie, door eerst de pijltool te gebruiken om de reconstructie te selecteren.
Klik vervolgens met de rechtermuisknop, selecteer 'verplaatsen' in het vervolgkeuzemenu en verplaats de tracing dienovereenkomstig. Om de tracing te roteren, klikt u met de rechtermuisknop, selecteert u 'roteren' in het vervolgkeuzemenu en roteert u de tracing dienovereenkomstig. Selecteer alternatief de 'match'-tool uit het vervolgkeuzemenu met tools bovenaan en selecteer het aantal punten dat moet worden gematched.
Klik vervolgens op het uiteinde in de reconstructie en op het overeenkomstige voortgangspunt in het live-beeld om dendritische uiteinden met beginpunten te koppelen. Zodra de tracing van de vorige sectie is uitgelijnd met de dendrieten in de nieuwe sectie, voegt u zoals eerder beschreven een nieuwe sectie toe aan de sectiemanager. Selecteer alternatief simpelweg de aangrenzende sectie die eerder is aangemaakt en pas de z-diepte op dezelfde manier aan.
Zorg ervoor dat de overeenkomstige nieuwe sectie is geselecteerd in de sectiebeheerder door op de huidige sectie te klikken. Verhoog vervolgens de vergroting naar 40x of 60x en selecteer de dendriet met de pijl. Klik met de rechtermuisknop op het uiteinde van de dendriet uit de vorige sectie en selecteer 'add to ending' uit het vervolgkeuzemenu.
Een melding vraagt of de voortzetting zich in een nieuw gedeelte bevindt. Klik op ja. Volg vervolgens de voortzetting van de dendriet door de muis als tekentool te gebruiken.
Maak afbeeldingen van de uiteinden ter voorbereiding op de uitlijning met de volgende sectie. Voeg vervolgens voortzettingen toe aan de dendritische traceringen totdat er voor het neuron ten minste drie secties zijn getraceerd, of totdat de dendrieten niet langer kunnen worden gevolgd of gevonden. Open met een extractieprogramma dat bij het neuronreconstructiesysteem hoort een voltooid reconstructiebestand.
Selecteer 'selecteer alle objecten' uit het bewerkingsdropdownmenu. Selecteer 'branch structure analysis' uit de bovenste analyse-werkbalk, klik vervolgens op elk tabblad en selecteer de gewenste analyseopties in elk tabblad. Extraheer alle gewenste gegevens door op de OK-knop in het analysevenster te klikken en sla deze op in een spreadsheetformaat door met de rechtermuisknop op de uitvoervensters te klikken en 'export to Excel' te selecteren voor verdere analyse.
Deze foto toont een enkele coronale doorsnede door de dorsale LGN van één dier. Cytochroomoxidase-kleuring wordt gebruikt om de LGN-lagen te visualiseren. En GFP-kleuring markeert de injectieplaats van het virus.
De pijl geeft regio's aan van dicht opeengepakte, retrogradement gelabelde neuronen van de nucleus reticularis thalami. De oriëntatie van de doorsnede is volgens het weergegeven dorsaal-ventraal-mediaal-lateraal kompas. De schaalbalk is afgebeeld in de linkerbenedenhoek.
Deze afbeelding toont de contourlijnen van de LGN in het rood en de TRN in het kastanjebruin voor alle coupes die een virusinjectie bevatten, zoals aangegeven door de zwarte contouren. Gele sterren geven de centra van de injectieplaatsen aan. Deze afbeelding toont de 3D-weergave van de contouren en de injectieplaats.
Dit is een kaart van de locaties van gereconstrueerde TRN-neuronen, kleurgecodeerd op basis van clustertoewijzing binnen een enkele geaggregeerde TRN-contour, weergegeven in kastanjebruin. De schaalbalk staat voor 500 microns. Deze afbeelding toont geaggregeerde contouren van de TRN in het zwart en de LGN in het grijs, met vijf gereconstrueerde TRN-neuronen die van warm naar koel zijn gekleurd op basis van hun mediaal-laterale positie binnen de TRN.
De schaalbalk staat voor 500 micron. Deze foto's tonen de details van dezelfde vijf TRN-neuronen met kleurgecodeerde schaalbalken die 100 micron vertegenwoordigen. Deze hiërarchische dendrogramboom illustreert de verbindingsafstanden tussen 160 gereconstrueerde TRN-neuronen op basis van 10 onafhankelijke morfologische metrieken en toont de algemene resultaten van de clusteranalyse.
Drie afzonderlijke clusters van TRN-neuronen zijn in het blauw, groen en rood weergegeven. Zodra deze neurale reconstructietechnieken onder de knie zijn, kan een enkel neuron in één tot twee uur volledig worden gereconstrueerd. Het is belangrijk om de z-diepte constant te bewaken en aan te passen tijdens het reconstrueren van neuronen.
Het hier beschreven protocol is een verbetering van traditionele, meer bevooroordeelde neuroanatomische analysemethoden en stelt onderzoekers in staat om nieuwe subklassen neuronen te verkennen op basis van grootschalige morfologische data. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe neuronen gereconstrueerd kunnen worden via aangrenzende weefselcoupes en hoe morfologische data kunnen worden geëxtraheerd voor verdere analyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het reconstrueren van de morfologie van neuronen die zijn gelabeld via retrograde infectie met een gemodificeerd rabiësvirus. De nadruk ligt op onbevooroordeelde clusteranalyses om verschillende neuronale subklassen te karakteriseren op basis van morfologische metrieken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neuroanatomie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de neuronale morfologie is essentieel voor het classificeren van neuronale typen.
- Traditionele methoden kunnen leiden tot bias in de morfologische analyse.
- Gemodificeerd rabiësvirus kan specifieke neuronale populaties effectief labelen.
- Onbevooroordeelde clusteranalyses verbeteren de karakterisering van neuronale subklassen.
Doel van de studie
- Om de morfologie van virusgelabelde neuronen te reconstrueren.
- Om onbevooroordeelde clusteranalyses uit te voeren op gelabelde neuronpopulaties.
- Om een uitgebreide karakterisering van verschillende neuronale subklassen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Selectie van goed geïsoleerde neuronen voor reconstructie.
- Toewijzing van de juiste z-diepte voor een accurate morfologische weergave.
- Uitlijning van arborescensen over aangrenzende weefselsneden.
- Gebruik van een microscoop om scherp te stellen op gekleurde hersenweefselsneden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle grootschalige analyse van de neuronale morfologie.
- Identificatie van morfologisch unieke neuronale typen.
- Onbevooroordeelde classificatie van verschillende neuronale subklassen.
- Verbeterd begrip van neuroanatomische gegevensverzameling en -analyse.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuust kader voor de reconstructie van de neuronale morfologie.
- Onbevooroordeelde methoden verbeteren de nauwkeurigheid van de classificatie van neuronale subklassen.
- Deze aanpak kan toekomstige neuroanatomische studies vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit protocol maakt grootschalige, onbevooroordeelde morfologische classificatie van neuronale populaties mogelijk, wat doelwitvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen in de neurowetenschappen ondersteunt door mechanistische ambiguïteit bij de identificatie van neuronale subtypen te verminderen. De aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door kwantitatieve, reproduceerbare metrieken te leveren voor het verminderen van risico's bij doelwithypotheses die gekoppeld zijn aan de functie van neuronale circuits. Het positioneert morfologische fenotypering als een schaalbare tool in de ontdekkingsfase voor het prioriteren van doelwitten met een sterke translationele continuïteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van onbevooroordeelde classificatie van neuronale subklassen op basis van morfologische metrieken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door het vaststellen van kwantitatieve criteria voor het onderscheiden van functioneel verschillende neuronale populaties.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targets door morfologische uniciteit te koppelen aan potentiële differentiële drugrespons in selectieve neuronale populaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde neuronale systemen voor op verdere assayontwikkeling door morfologisch onderscheidbare subklassen te definiëren voor consistente cellulaire modellen.
- Operationele waarde: Draagt bij aan de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door het extraheren van kwantitatieve morfologische gegevens die geschikt zijn voor high-content screeningplatforms.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk over verschillende neuronale populaties door een overdraagbare workflow vast te stellen voor grootschalige reconstructie en clustering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt systeemmodellering die relevant is voor ziekten door de classificatie van neuronale typen mogelijk te maken in hersenregio's van primaten die relevant zijn voor targets van neuropsychiatrische stoornissen.
- Preklinische afstemming: Faciliteert beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door morfologische biomarkers te bieden die correleren met de betrokkenheid van pathways specifiek voor neuronale subtypen.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door targetselectiviteit te valideren via uitgebreide morfologische profilering van off-target neuronale populaties.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetests voor targets tot lead-identificatie, waarbij morfologische classificatie de screening van verbindingen in ziekterelevante neuronale systemen ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door ongebiasede identificatie mogelijk te maken van neuronale subklassen die ziekte-relevante circuits differentieel kunnen moduleren.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid door kwantitatieve morfologische outputs te bieden die consistentie garanderen in neuronale modellen die worden gebruikt voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert statistische clusteranalyse en morfologische metrieken die vergelijking van neuronale populaties over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinische validatie via morfologische profilering in neuronale systemen van primaten met relevantie voor menselijke hersendoelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare neuroanatomische profileringscapaciteit die toepasbaar is over meerdere neuronale populaties en hersenregio's voor target-validatie op portfolioniveau.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door het verminderen van mechanistische ambiguïteit bij de classificatie van neuronale subtypes.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de generatie van morfologische gegevens over laboratoria en studies heen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go beslissingen door vroege risicoreductie van targets op basis van de specificiteit van neuronale subklassen, waardoor het risico op biologische mislukkingen in een laat stadium wordt verkleind.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van beslissingen over verdere ontwikkeling door objectieve morfologische classificatie van neuronale populaties in preklinische modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neuroanatomische tracing, confocale microscopie en 3D-reconstructiesoftware voor een nauwkeurige vastlegging van de neuronale morfologie.
- Afhankelijk van microscopie-infrastructuur die in staat is tot z-sectiering en fluorescentie-imaging van dikke weefselcoupes, samen met computationele hulpmiddelen voor morfologische extractie en clusteranalyse.
- Maakt cross-team standaardisatie van tracing-protocollen en definities van morfologische metrieken noodzakelijk om reproduceerbaarheid tussen locaties en operators te waarborgen.
- Vereist overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende neuronale populaties, hersenregio's of species vanwege variaties in morfologie en label-efficiëntie.
- Praktische beperkingen omvatten het tijdrovende karakter van handmatige tracing en de afhankelijkheid van hoogwaardige virale labeling en weefselconservering voor betrouwbare reconstructies.
