Name: In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer in utero elektroporatie om de structurele connectiviteit en prikkelbaarheid van corticale neuronen te karakteriseren. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van individuele neuronen mogelijk voor onderzoek naar ontwikkelingsneurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor R. Gutiérrez en A. Morales voor hun uitstekende technische bijstand en naar LA Weiss om te bewerken. CGB wordt gefinancierd door het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van BBVA Foundation en SAF2014-58598-JIN (MINECO) naar M. Navarrete en door een subsidie ​​van de Ramón Areces Foundation en subsidies SAF2014-52119-R en BFU2014-55738-Redt (van MINECO) naar M. Nieto.

<ol><li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li>
<li>Rodriguez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II%2FIII+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+postnatal+electroporation+and+time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+mouse+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2CLateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Woodworth, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip1+Regulates+the+Balance+between+Specification+of+Distinct+Projection+Neuron+Subtypes+in+Deep+Cortical+Layers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers.</a> Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dit protocol beschrijft in detail hoe neuronen van de somatosensorische cortex van C75BL / 6 muizen label om hun connectiviteit en hun prikkelbaarheid analyseren. Bij de bestaande methoden, visualiseren uw onderscheidende aspecten van connectiviteit, zoals het aantal van axonale vertakkingen per neuron, de precieze topografie en de anatomische locatie. Door het veranderen van de positie van de elektroden, is het mogelijk te richten andere neuronenpopulaties, zoals de cingulate cortex (behoud van dezelfde hoek tussen de ...

De ontwikkeling van de dendritische en axonale structuren is een belangrijk facet van het circuit regelgeving in het zenuwstelsel, met inbegrip van in de cerebrale cortex. Het speelt een belangrijke rol tijdens de selectieve bedrading van de verschillende neuronale subpopulaties. Een aantal recente rapporten aangetoond dat, naast verbinding, wordt de moleculaire diversiteit van neuronen gereflecteerd door het verkrijgen van zeer specifieke wijze van bakken. De mechanismen die de exciteerbaarheid en connectiviteit van de afzonderlijke neuronale subtypes tijdens de ontwikkeling, en de mate van coördinatie, zijn nog slecht begrepen 1, 2. In vivo verlies- en gain-of-function analyses oog op het onderzoek naar de relatie tussen de expressie van specifieke genen en hun invloed op de ontwikkeling van de schakeling. In utero elektroporatie (IUE) is een techniek veel gebruikt studerende functie van een gen van belang in specifieke neuronale populaties en de algemene patronen van de verbindingen te bestuderen. Echter, de morfologische kenmerken van axonen en dendrieten in corticale lagen in levende muizen te bepalen, is het essentieel om neuronen dun label. Een Cre recombinatie systeem gecombineerd met IUE kan worden gebruikt om een ​​schaarse populatie van neuronen te markeren op een voldoende lage dichtheid dat uitstekende uitgezonden door individuele cellen van de geïdentificeerde corticale laminas lossen. Deze methode etiketten voldoende aantal neuronen per cortex kwantitatieve gegevens te verkrijgen na de analyse van redelijke hoeveelheden geëlektroporeerd hersenen (figuur 1). Het manuscript geeft een werkwijze voor zulke fijne analyse van connectiviteit. Het bevat ook een soortgelijke strategie te analyseren, in afzonderlijke experimenten, de elektrische eigenschappen van neuronen door het uitvoeren stroom-clamp op groene fluorescentie eiwit (GFP) -geëlektroporeerde cellen acute corticale schijfjes. deze proprotocollen zijn veelzijdig en kan worden toegepast op de studie van de prikkelbaarheid van neuronen en connectiviteit van WT en transgene dieren, alsmede van neuronen waarbij verliezen en winsten functie van aanvullende plasmiden worden geïntroduceerd tijdens IUE. Hoewel dit protocol beschrijft de elektroporatie van muizen op embryonale dag (E) 15,5 Deze techniek kan worden uitgevoerd op elke leeftijd tussen E9.5 en postnatale dag 3 (P) 2 4. Terwijl elektroporatie in een vroeg stadium is gericht op neuronen en voorlopers van de thalamus en de diepe lagen van de cortex, later stadium elektroporatie merken meer oppervlakkige lagen (bv E15.5 IUE targets laag II-III neuronen). Samengevat, de combinatie van IUE met eencellige morfologische analyse en elektrofysiologie is een nuttig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen waardoor enorme structurele en functionele diversiteit van neuronen in het zenuwstelsel helderen.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine</td><td>Meda</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Eye Ointment (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle # 3 - 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blades # 10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Thin curved tips - Style 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mathieu Needle Holder - Serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Applier</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp;APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Sutures - Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>Electric Razor&nbsp;</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gauze (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs (Star Cott)</td><td>Albasa</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Needle 25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Polyclonal Antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Platinum electrodes 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Microscope&nbsp;for Fluorescent Imaging - MZ10F</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>VIP 3000 Isofluorane Vaporizer</td><td>Matrx</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TCS-SP5 Laser Scanning System</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat - CM 1950</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Micropette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier)</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Motorized Micromanipulator + Rotating Base&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Air Table</td><td>Newport</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Miniature Peristaltic Pumps</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en single-cell connectivity studie

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Het zenuwstelsel bestaat uit een breed assortiment van verschillende neuronale types. Deze neuronale subpopulaties worden gekenmerkt door, onder andere functies, hun verschillende dendritische morfologie, hun specifieke patronen van axonale connectiviteit, en hun selectieve stoken reacties. De moleculaire en cellulaire mechanismen die aan deze aspecten van differentiatie tijdens de ontwikkeling nog steeds slecht begrepen. Hier beschrijven we gecombineerde protocollen voor etikettering en karakteriseren van de structurele connectiviteit en prikkelbaarheid van corticale neuronen. Wijziging van de in de baarmoeder elektroporatie (IUE) protocol maakt de etikettering van een geringe bevolkingsdichtheid van neuronen. Dit op zijn beurt maakt de identificatie en het volgen van de dendrieten en axonen van individuele neuronen, de precieze karakterisering van de laminaire locatie van axonale uitsteeksels en morfometrische analyse. IUE kan ook worden gebruikt om veranderingen in de prikkelbaarheid van onderzoekenwild-type (WT) of genetisch gemodificeerde neuronen door het te combineren met whole-cell opname van acute plakjes geëlektroporeerd hersenen. Deze twee technieken bijdragen tot een beter begrip van de koppeling van structurele en functionele connectiviteit en de moleculaire mechanismen die neuronale diversiteit tijdens de ontwikkeling. Deze ontwikkelingsprocessen hebben belangrijke gevolgen voor de axonen bedrading, de functionele diversiteit van neuronen, en de biologie van cognitieve stoornissen.

De morfologische veranderingen van neuronen in detail en in ontwikkeling karakteriseren, is het essentieel om neuronen dun label. A Cre-recombinase verdund systeem maakt de expressie van een gen van belang in een schaarse populatie van neuronen, zodat alleen de neuronen die dit enzym bevatten GFP expressie (Figuur 1A). Met behulp van deze strategie, is laag II-III gerichte en gelabeld door IUE op E15.5. CAG-DsRed2 bij 1 ug / ul, gelijktijdig wordt geëlektroporeerd als co...

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Het algemene doel van deze in utero electroporatie-benadering is om de structurele connectiviteit en prikkelbaarheid van corticale neuronen onder normale en experimentele omstandigheden te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsneurobiologie, zoals het ontleden van de structurele en functionele connectiviteit van de hersenen en de biologie van cognitieve stoornissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de markering van een kleine populatie neuronen mogelijk maakt en het toelaat om de dendrieten te visualiseren en individuele neuronen te benaderen, wat leidt tot een efficiëntere en meer fysiologische kwantitatieve analyse.Bereid vóór de injectie tien µL van het DNA-mengsel per operatie voor, voor zowel enkelcelmarkering als een standaard patchclamp-studie. Manipuleer vervolgens de embryo's voorzichtig met de vingers om het telencephalon te lokaliseren. Plaats daarna een voorbereide borosilicaatcapillair in een mondpipet.Voer de naaldpunt door de baarmoeder, waarbij bloedvaten worden vermeden, totdat deze het zijventrikel bereikt. Injecteer vervolgens langzaam ongeveer 1 µL van de met Fast Green gekleurde DNA-oplossing totdat er een grote blauwe vlek zichtbaar is. Een kritieke stap in deze procedure is de injectie van het DNA.Dit moet zo voorzichtig mogelijk gebeuren. Plaats nu de platina elektroden van zeven millimeter lateraal op de kop van een embryo en breng spanning aan via de platina elektroden. Cryoprotegeer in deze procedure de gefixeerde hersenen in tien milliliter 30% sucrose in PBS bij vier graden Celsius gedurende één tot twee dagen totdat ze naar beneden zakken.Bereid vervolgens aluminiumfolie kubussen van één kubieke centimeter voor en vul de kubussen voor 2/3 met OCT. Plaats daarna de hersenen in de kubussen en vries deze in op droogijs. Bewaar de bevroren hersenen vervolgens bij 80 °C.Om de hersenen in de cryostaat te doorsnijden, plaatst u een druppel OCT op het oppervlak van de specimen-schijf. Verwijder de aluminiumfolie van het histologieblok en positioneer het blok in de gewenste oriëntatie bovenop het vloeibare OCT. Oefen stevige druk uit tot het histologieblok is vastgezet.Plaats vervolgens de specimen-schijf in de specimenkop van de cryostaat en oriënteer het preparaat voor het maken van coupes. Snijd vervolgens coupes van 50-100 micrometer dik en breng de zwevende cryocoupes met een fijn penseel over naar PBS. Blok de coupes vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur met 5% foetaal runderserum in PBS, mengandung 0,5% Triton X-100.Incubeer ze vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius met een primaire antilichaam in een verdunning van 1:500 in blokkeringsoplossing. Was de coupes de volgende dag drie keer met PBS. Voeg een secundair antilichaam in een verdunning van 1:500 in blokkeringsoplossing toe en incubeer de coupes één uur bij kamertemperatuur.Was de coupes vervolgens drie keer in PBS. Kleur de coupes daarna tegen met dapE in PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende tien minuten. Spoel de coupes met PBS en monteer ze met monteermiddel.Om de neuronen te reconstrueren, worden er beelden van de hersendoorsneden vastgelegd met een hoge vergroting en hoge resolutie. Selecteer vervolgens Tile Scan in de acquisitiesoftware om het interessegebied te dekken, inclusief alle dendrieten en axonale processen. Leg een voldoende aantal stacks op de Z-as vast om informatieverlies te voorkomen.Open daarna de afbeelding en selecteer de optie voor gesegmenteerde lijnen uit het menu. Teken een lijn die de structuur van het neuron volgt. Ga vervolgens naar Analyze, Tools, daarna naar ROI manager en klik op Add om de lijn op te slaan.Herhaal dit proces voor elk axon of elke dendriet van het geanalyseerde neuron. Klik in het menu van de ROI Manager op Measure om de lengte te bepalen. Exporteer de metingen naar een tekstbestand of spreadsheet voor analyse.Om een opname te maken van een GFP-expresserende neuron uit een GFP-elektroporeerde muis, plaatst u de hersenen in een gekoelde kweekschaal. Snijd het cerebellum af met een kleine schaar. Pak vervolgens de hersenen op met een spatel en dep ze droog op een papieren handdoek.Plak het ventraal caudale vlak van de hersenen op een Vibratome-houder. Plaats de houder op een Vibratome gevuld met ijskoud ACSF en zorg voor continue carbogenatie van de Vibratome-kamer. Verkrijg vervolgens acute coupes door binnen 15 minuten coronale secties van 300 micrometer te snijden.Incubeer vervolgens de acute coupes minstens 60 minuten bij 25 °C in ACSF, terwijl er carbogen doorheen wordt gebubbeld. Verplaats na 60 minuten een coupe met een Pasteurpipet of een klein penseel naar de opnamekamer. Houd de coupe vast met een harp en perfuseer deze met ACSF met een snelheid van 2 mL per minuut.Om een GFP-positief neuron te patchen, lokaliseert u het gebied van interesse via de microscoop bij 10x. Zoek vervolgens een GFP-positieve cel met het 60x objectief. Vul daarna de registratie-elektrode met intracellulaire oplossing.Plaats vervolgens een glazen pipet in de pipethouder. Plaats daarna de pipetpunt in het bad en stel de focus op de punt in. Zodra de pipet in het bad bevindt, wordt er via het tegendrukregelsysteem positieve druk uitgeoefend.Benader de gewenste cel onder visuele begeleiding terwijl de tegendruk in de pipet wordt gehandhaafd. Zodra er een kleine inkeping op het celoppervlak verschijnt, wordt de druk losgelaten. Op dit punt kan een strakke afsluiting (tight seal) worden gevormd met een weerstand groter dan één giga-ohm.Pas anders een lichte negatieve druk toe om dit te vergemakkelijken. Terwijl de verzegeling wordt gevormd, wordt de holdingspanningsklem naar 60 millivolt gebracht. Zodra de giga-ohm verzegeling is gevormd, wordt een zuigpuls toegepast om het celmembraan te ruptureren en over te gaan naar de whole-cell modus.Zodra de whole-cell modus is bereikt, wordt er overgeschakeld van voltage-clamp naar current-clamp modus en wordt de registratie gestart. Deze afbeeldingen tonen de aflevering van vectoren aan neuronen in laag 2/3 door in utero elektroporatie op embryonale dag 15,5, waarbij de coronale secties zijn geprepareerd op postnatale dag 16. De CAG DsRed2-vector werd als controle gecotransfecteerd.GFP wordt alleen tot expressie gebracht in die neuronen die ook cre hebben geïncorporeerd, waardoor recombinatie van de LoxP-plaatsen in de CALNL GFP-vector mogelijk is. Hier is een confocale afbeelding met hoge vergroting van de dendritische vertakkingen van een ander schaars gelabeld GFP-neuron. Dit is een piramidale neuron geëlectroporeerd met GFP, waargenomen onder bright-field en groene fluorescentiecondities.Hier is een typische, regelmatige spiking-respons van een CAG-GFP ge-electroporeerde controleneuron in laag 2/3. Zodra de techniek onder de knie is, kan dit in 30 minuten worden gedaan voor in utero electroporaties en in een halve dag voor de patchclamp-meting, mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de chirurgie zo snel mogelijk uit te voeren om de stress van de moeder te verminderen en de overlevingskans van de pups te vergroten.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals expressieanalyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de relatie tussen de expressie van specifieke genen en hun invloed op de ontwikkeling van het surrogaat. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de ontwikkelingsneurowetenschappen om de connectiviteit en morfologie van neuronen in muizen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe in utero operaties kunnen worden gebruikt om de structuur en connectiviteit van neuronen op enkelcelniveau en de exciteerbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen te beschrijven.

in-utero-electroporation-approaches-to-study-excitability-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

The video demonstrates a method to study the excitability of neuronal cells expressing fluorescent protein using a whole-cell patch current clamp. In the current-clamp mode, action potentials indicative of neuronal excitability are generated.

Studying the Excitability of Fluorescent Neurons using a Whole-Cell Patch Clamp

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt...

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Leer in utero elektroporatie om de structurele connectiviteit en prikkelbaarheid van corticale neuronen te karakteriseren. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van individuele neuronen mogelijk voor onderzoek naar ontwikkelingsneurobiologie.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Meer video's verkennen