Name: Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Leer hoe menselijke pluripotente stamcellen gedifferentieerd worden naar cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen voor myocardreparatie. Deze methode verbetert de engraftment van getransplanteerde cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de US Public Health Service, NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120 en UO1 HL100407-project 4 (aan JZ), een American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) en een Research Voucher Award van het University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (aan WZ).

Alle experimentele procedures worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Universiteit van Alabama in Birmingham. 1. Differentiatie hiPSCs in iPSC-CMs <ol><li> Smeer de putjes van een 6-well plaat met pre-gekoelde groeifactor-gereduceerde geleiachtige eiwitmengsel bij 4 ° C voor de overnachting. Zuig het gelatineuze proteïnemengsel voor gebruik. Zaad de hiPSCs op de vooraf beklede platen en kweken van de cellen (1 x 10 5 cellen per putje) bij 5% CO2 en 37 ° C in mTeSR1 mediumsupplement met 10 pM ROCK inhibitor. </li><li> Vernieuw de medium dagelijks tot de cellen te bereiken 90% samenvloeiing; vervolgens toevoegen groeifactor verminderde gelatineuze eiwitmengsel aan het medium (0,5 mg gelatineuze eiwitmengsel per 6-well plaat, 2 ml medium per putje) en de cellen te kweken voor 5% CO2 en 37 ° C nog twee dagen. <ol><li> Om het medium te vervangen, zachtjes zuigen het medium uit de petrischaal via vacuüm metuit het aanraken van de cellen, en voeg nieuwe medium met behulp van een overdracht pipet. </li></ol></li><li> Initiëren differentiatie door het vervangen van het medium RPMI1640 medium aangevuld met groeifactor-gereduceerde gelatineuze eiwitmengsel, B27 zonder insuline en 100 ng / ml activine A; kweken van de cellen bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Vervang het medium RPMI1640 medium dat is aangevuld met B27 zonder insuline, 10 ng / ml botmorfogeen eiwit 4 (BMP-4) en 10 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF); kweken van de cellen bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 96 uur. </li><li> Vervang het medium RPMI1640 medium aangevuld met B27 en verder kweken van de cellen bij 5% CO2 en 37 ° C; Vernieuw de medium om de 3 dagen. </li><li> Observeer clusters van de aanbesteding van de cellen onder de microscoop ~ 3 dagen na aanvang van differentiatie. Verzamel de clusters ~ 7 dagen na de eerste observeren weeën en was ze in Hanks Balanced Salt Solution. <ol><li> Distantiëren de geclusterde-cellen in de plaat door te incuberen in Hanks buffer bevattende 100 U / ml collagenase IV gedurende 10 min bij 37 ° C onder zacht schudden; Vervolgens, voeg 0,25% trypsine in ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gedurende 5 min. </li><li> Neutraliseer de enzymoplossing met 10% foetaal runderserum aan RPMI / B27 medium en resuspendeer de cellen in RPMI / B27 medium. </li><li> Tel het aantal cellen door hemocytometer. Cultuur van de cellen op 10 cm schalen bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende ten minste 3 uur, waardoor het niet-cardiomyocyt cellen hechten aan het oppervlak van de kweekschaal. </li></ol></li><li> Verzamel de celsuspensie, waarbij het iPSC-CMs bevat en onderhouden van de cellen (ongeveer 1 x 10 6 cellen per 10 cm schaal) door ze te kweken op een gelatine-achtig eiwitmengsel gecoate oppervlak. </li></ol> 2. Differentiatie hiPSCs in iPSC-EC <ol><li> Distantiëren de iPSC populatie in enkele cellen door incubatie them met chelaterende middel met 5% CO2 en 37 ° C gedurende 5 minuten. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml centrifugebuis met vers medium mTeSR1. </li><li> Spin down de cellen bij 200 g gedurende 5 min. Resuspendeer de cellen in mTeSR1 medium aangevuld met 10 pM ROCK inhibitor. Bepaal de celdichtheid met een hemocytometer. </li><li> Voeg 250 ul van 20 NIH eenheden / ml thrombine-oplossing een putje van een 24-wells plaat. </li><li> Voeg 1 x 10 6 hiPSCs tot 250 ui van een 12,5 mg / ml fibrinogeenoplossing. En voeg 250 pl celbevattende fibrinogeenoplossing de trombine-geladen goed. Let op de mengsel stollen tot een iPSC bevattende fibrine scaffold binnen de min te vormen. </li><li> Breng de gestolde, celbevattende scaffolds in de putjes van een 6-wells plaat met het dekglas forceps en initiëren differentiatie door kweken van de steigers 2 ml EBM2 medium aangevuld met 2% B27 zonder insuline, activine-A (50 ng / ml) en BMP-4 (25 ng / ml) gedurende 24 uur bij 5% CO <sub&gt; 2 en 37 ° C. <ol><li> Vervang het medium door voorzichtig te zuigen uit de oude medium via vacuüm, zonder het aanraken van de cellen. Toevoegen EBM2 medium aangevuld met B27 zonder insuline, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF, 50 ng / ml), erythropoïetine (EPO, 100 ng / ml) en transformerende groeifactor β1 (TGFB1, 10 ng / ml) en cultuur steigers bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Vernieuw de medium en de cultuur van de steigers bij 5% CO 2 en 37 ° C voor nog eens 48 uur; Laat dan de cellen van het skelet door toevoeging van 200 U collagenase IV (100 U / ml) aan het medium. </li><li> Spin down de cellen nadat ze zijn vrijgelaten. Vervang het medium met 2 ml EGM2 MV-medium aangevuld met 2% B27, VEGF-A (50 ng / ml) en SB-431.542 (10 uM); Vernieuw de medium om de twee dagen. </li><li> Ongeveer 10 dagen later (dat is op ~ Dag 14 na differentiatie ingeleid), dissociëren de cellen met 100 U / ml collagenase IV, isoleren hiPSC-EC uit de populatie van gedifferentieerde cellen via flow cytometrie analyses voor de expressie van EG-specifieke marker-eiwitten (bijvoorbeeld CD31, CD144) 3. </li><li> Vouw de geïsoleerde iPSC-EC&#39;s via een vooraf vastgesteld protocol 3. </li></ol></li></ol> 3. Differentiatie hiPSCs in iPSC-SMC&#39;s <ol><li> Zaad de hiPSCs op platen die zijn bekleed met gelatineuze proteïnemengsel toegevoegd en de cellen te kweken in mTeSR1 medium bij 5% CO2 en 37 ° C, met dagelijkse mediumveranderingen tot samenvloeiing (~ 2 dagen). </li><li> Initiëren differentiatie in mesodermale-lineage cellen door kweken van de cellen met CHIR99021 (5 uM) en BMP-4 (10 ng / ml) in RPMI1640 medium en 2% B27 plus insuline gedurende 3 dagen. </li><li> Om iPSC-SMC&#39;s te produceren met een overwegend synthetisch fenotype: <ol><li> Cultuur van de cellen met VEGF-A (25 ng / ml), fibroblast groeifactor β (FGFβ, 5 ng / ml) in RPMI1640 me<html> dium en 2% B27 minus insuline bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 4 dagen. </li><li> De cellen te kweken in VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) in RPMI1640 medium en 2% B27 plus insuline bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Cultuur van de cellen in plaatjes afgeleide groeifactor β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFp (3 ng / ml) in RPMI 1640 en 2% B27 plus insuline bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 4 dagen. </li></ol></li><li> Om iPSC-SMC&#39;s te produceren met een overwegend contractiele fenotype: <ol><li> Kweken van de cellen gedurende 4 dagen met VEGF-A (25 ng / ml) en FGFβ (5 ng / ml) in RPMI 1640 en 2% B27 minus insuline. </li><li> Kweken van de cellen gedurende 7 dagen met PDGFβ (5 ng / ml) en TGFp (2,5 ng / ml) in RPMI 1640 en 2% B27 plus insuline. </li></ol></li><li> Zuiver het uiteindelijke iPSC SMC-populaties door het kweken van de cellen in lactaat (4 mM) bevattend RPMI1640 medium voor metabole ~ 6 dagen. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Het creëren van de IGF-bevattende microsferen <ol><li> Verhit olijfolie tot 45 ° C in een waterbad. </li><li> Verhit 5 ml 10% gelatineoplossing tot 50 ° C. </li><li> Voeg de gelatine aan de olijfolie, roer, en vervolgens snel afkoelen tot 5 ° C door het toevoegen van ijs om het waterbad. </li><li> Vijfentwintig minuten later, voeg gekoeld (4 ° C) aceton de olijfolie microsfeervorming induceren. </li><li> Handhaaf de temperatuur op 5 ° C gedurende 1 uur; Verzamel dan de microsferen, wassen 5 maal met voorgekoeld aceton olijfolie verwijderen en laten drogen bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de microsferen in een oplossing van 70% ethanol en 0,25% glutaaraldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C verknoping induceren, en daarna werd het mengsel met 100 mM glycine neutraliseren. </li><li> Laad IGF in de microsferen door 5 mg microsferen met 15 gl gedestilleerd H2O met 5 ug IGF en 0,1% bovine serum albumine gedurende 30 minuten. </li></ol> 5. Het creëren van de Patch over de plaats van het letsel en het injecteren van de Cellen <ol><li> Hang de iPSC-afgeleide cm (2 miljoen), SMC (1 miljoen euro), en EC (1 miljoen) samen in 1 ml Minimum Essential Medium (MEM). </li><li> Suspendeer 5 mg van microsferen in 1 ml fibrinogeenoplossing (25 mg / ml). </li><li> Vul een spuit met het cel bevattende oplossing, een spuit met de fibrinogeen / microsfeer oplossing, en een derde spuit met 1 ml trombine oplossing (80 NIH eenheden / ml, aangevuld met 2 ui 400 mM CaCl2 en 200 mM ε-aminocapronzuur zuur). </li><li> Operatief induceren myocardinfarct bij varkens hart via ligatie van de linker voorste dalende kransslagader zoals eerder beschreven 2. Opmerking: In het kort, vrouwelijke Yorkshire varkens (~ 13 kg, 45 dagen oud) worden verdoofd met een intramusculaire injectie van Telazol / xylazine (4,4 mg / kg), geïntubeerd en onder algehele anesthesie met isofluraan (0,5-5%). Een 4e intercostal thoracotomie wordt uitgevoerd en liet anterieure dalende kransslagader wordt blootgesteld. De kransslagader wordt afgesloten door een ligatuur van 60 min en vervolgens de ligatuur wordt verwijderd. Directe elektrische defibrillatie wordt uitgevoerd bij ventriculaire fibrillatie. </li><li> Plaats een steriele plastic ring (~ 2,5 cm) op het epicard van het infarct gebied van varkens harten, en vervolgens gelijktijdig injecteren de microbolletjes / fibrinogeen en trombine-oplossingen in de ring. </li><li> Laat het mengsel te stollen (~ 30 sec), en steek de naald van de cel met spuit door het gestolde mengsel in het infarct myocardium en injecteer de cellen. Sluit de spier lagen, onderhuids weefsel, en de borstwand met 3-0 of 2-0 Monocryl hechting, afhankelijk van grootte van het dier. Buprenorfine 0,01-0,02 mg / kg intramusculair injectie elke 8 uur worden gebruikt om pijn te controleren voor de eerste 3 dagen na de operatie. </li><li> Evalueer hartfunctie met een cardiale magnetische resonantieimaging (MRI) voor operatie, een week tot vier weken na de operatie 2, 3, 4. Na de laatste MRI studies, offeren het dier en verwerkt voor histologie hun hart en moleculaire analyse 2, 3, 4. </li></ol>

<ol><li>Qiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+proliferation+time+course+of+stem+cells+transplanted+in+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium.</a> Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+a+spatiotemporal+3D+environment+on+endothelial+cell+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced-Pluripotent+Stem+Cells+into+Smooth-Muscle+Cells%3A+Two+Novel+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols.</a> PLoS One. 11 (1), e0147155(2016).</li>
<li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).</li>
<li>Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+bodies%3A+a+novel+culture+method+for+enrichment+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Huber, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+selection+of+cardiomyocytes+during+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation.</a> FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).</li>
<li>Kita-Matsuo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+protocols+for+creation+of+stable+hESC+lines+for+fluorescent+tracking+and+drug+resistance+selection+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes.</a> PLoS One. 4 (4), e5046(2009).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+and+endothelial+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+promotes+hematoendothelial+cell+development+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (1), 122-131 (2008).</li>
<li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li>
<li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+iPSCS+increase+capillary+density+and+improve+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).</li>
<li>Tang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+administration+of+cardiac+progenitor+cells+alleviates+left+ventricular+dysfunction+in+rats+with+a+30-day-old+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction.</a> Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+myocardial+insulin-like+growth+factor+1+%28IGF-1%29+delivery+with+biotinylated+peptide+nanofibers+improves+cell+therapy+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+insulin-like+growth+factor-1+in+mice+protects+from+myocyte+death+after+infarction%2C+attenuating+ventricular+dilation%2C+wall+stress%2C+and+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy.</a> J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).</li>
<li>Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiomyocyte+apoptotic+signaling+by+insulin-like+growth+factor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I.</a> Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).</li>
<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li>
</ol>

Verbeterde Opbrengst / zuiverheid van iPSC-CM Gebruikelijke protocollen voor het differentiëren van menselijke stamcellen in CM&#39;s zijn vaak beperkt door de lage opbrengst en zuiverheid; bijvoorbeeld, slechts 35-66% van de hESC-CM&#39;s verkregen via Percoll scheiding en cardiale vorming lichaam uitgedrukt langzaam myosine zware keten of cTnT 6. De zuiverheid van gedifferentieerde iPSC-CM populatie kan aanzienlijk worden verhoogd door het kiezen voor de expressie van ...

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) behoren tot de meest veelbelovende middelen voor regeneratieve celtherapie omdat ze kunnen worden onderscheiden in een potentieel onbeperkte waaier en de hoeveelheid cellen die niet worden afgewezen door het immuunsysteem van de patiënt. Echter, hun capaciteit voor zelf-replicatie en differentiatie leiden tot tumorvorming en derhalve dient hiPSCs volledig worden onderverdeeld in specifieke celtypen, zoals hartspiercellen (CM), endotheelcellen (ECs) en gladde spiercellen (SMC ), voor toediening. Een van de eenvoudigste en meest voorkomende methoden cel toediening directe intramyocardiale injectie, maar het aantal getransplanteerde cellen die zijn geënt met de natieve myocardiaal weefsel uitzonderlijk laag. Veel van dit verloop kan worden toegeschreven aan de cytotoxische omgeving van het ischemische weefsel; wanneer echter muriene embryonale stamcellen (SER) werden direct geïnjecteerd in het myocardium van niet-beschadigde harten, only ~ 40% van de 5.000.000 cellen geleverd werden behouden gedurende 3-5 uur 1, hetgeen suggereert dat een aanzienlijk deel van de toegediende cellen verlieten de toedieningsplaats, misschien omdat zij uitgeknepen door de naald weg door de hoge drukken die tijdens myocardiale contractie. Hier presenteren we nieuwe en aanzienlijk efficiëntere werkwijzen voor het genereren iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) 2, endotheliale cellen (EC-iPSC) 3 en gladde spiercellen (SMC) 4. Met name deze iPSC SMC-protocol is de eerste die de uiteenlopende morfologische en functionele kenmerken waargenomen in somatische SMC&#39;s 5 door het richten van de cellen naar een overwegend synthetisch of SMC contractiele fenotype nabootsen. Wij ook een werkwijze voor aflevering cel die de engraftment percentage geïnjecteerde cellen verbetert door een cytokine-bevattende fibrine patch op de injectieplaats. De pleister blijkt zowel celretentie verbeteren door het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van het verlaten van het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) gedurende ten minste drie dagen.

<table><tbody><tr><td>Protocol gedeelde 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>Stem cell technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Growth-factor-reduced matrigel</td><td>Corning lifescience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stem cell technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement, serum free</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&amp;D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175079</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Corning Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Protocol gedeelde 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Life Technologies</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV medium</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD Bioscience</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorff Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Protocol gedeelde 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem cell technologies</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Protocol gedeelde 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olive oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R&amp;D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Heating plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>Protocol gedeelde 5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&#949;-aminocaproic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia ventilator</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia ventilator</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>Defibrillator</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T MRI</td><td>General Electric</td><td>Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T MRI</td><td>Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk suture</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 silk suture</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 monofilament suture</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Human geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) moet volledig worden onderscheiden in specifieke celtypen voorafgaand aan toediening, maar de conventionele protocollen voor differentiëren hiPSCs in hartspiercellen (iPSC-CMS), endotheelcellen (iPSC-EC), en gladde spiercellen (SMC) zijn vaak beperkt door de lage opbrengst, zuiverheid, en / of slechte fenotypische stabiliteit. Hier presenteren we nieuwe protocollen voor het genereren iPSC-CM, -ECs en -SMCs die aanzienlijk efficiënter dan conventionele methoden, alsmede een werkwijze voor het combineren celinjectie met cytokine-bevattende pleister gemaakt via toedieningsplaats. De patch verbetert zowel de retentie van de geïnjecteerde cellen bij het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van wordt geperst uit het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) over een langere periode. In een warkensmodel van myocardiale ischemie-reperfusieschade, het percentage enting was meer dan twee keer groter is vancellen werden toegediend met cytokine-bevattende pleister vergelijken met de cellen zonder patch, en behandeling met zowel de cellen en de pleister, maar niet de cellen alleen werd geassocieerd met een significante verbetering in hartfunctie en infarctgrootte.

Karakterisering van gedifferentieerde iPSC-cms, -ECs en -SMCs De differentiële capaciteit van hiPSCs geëvalueerd 2, 3, 4. Flow cytometrie analyse van cardiale troponine T (cTnT) expressie suggereert dat de zuiverheid van het uiteindelijke iPSC-CM populatie 90% (Figuur 1A, 1B, paneel B1) kan overschrijden...

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Het algemene doel van deze video is om een techniek te introduceren voor het differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen tot cardiomyocyten, en om het gebruik van deze cellen aan te tonen voor het bestuderen van myocardiaal herstel na een ischemie-reperfusieschade. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over het engineeren van hartweefsel met menselijke iPS-cel-afgeleide hartcellen voor myocardiaal herstel. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat het wetenschappers in staat stelt om gezuiverde cardiomyocyten, gladdespiercellen en endotheelcellen te verzamelen en hartweefsel met deze progenitorcellen te genereren.Ling Gao is een postdoc in het eigen lab van dokter Zhang aan de UAB en Greg Walcott is een cardioloog in het UAB-ziekenhuis. Trina is een MRI-specialist in het UAB-ziekenhuis. Om pluripotente stamcellen te induceren tot cardiomyocyten, moeten de wells van een six-well plaat eerst worden gecoat met een groeifactor-arm gelatinemengsel dat is gekoeld tot 4 °C.Koel de plaat vervolgens gedurende de nacht af bij 4 °C. Aspireer de volgende dag het gelatinous eiwitmengsel en zaai de platen met 100 miljoen stamcellen per putje. Houd de st

pluripotent-stem-cell-derived-cardiac-cells-for-myocardial-repair

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.

Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken

Intramyocardial cel levering in muriene modellen van cardiovasculaire ziekten, zoals hypertensie of myocardiaal infarct, wordt veel gebruikt om het therapeutisch potentieel van verschillende celtypes in regeneratieve studies testen. Daarom zal een gedetailleerde beschrijving en een duidelijke visualisatie van deze chirurgische procedure helpen om de beperkingen en voordelen van cardiovasculaire cel therapeutische analyses in kleine knaagdieren te definiëren.

Intramyocardiale Cell Levering: Waarnemingen in Muizen Harten

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een experimentele opstelling voor een analyse van de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen van de stam voorafgaand aan de transplantatie van de cel.

Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

Leer hoe menselijke pluripotente stamcellen gedifferentieerd worden naar cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen voor myocardreparatie. Deze methode verbetert de engraftment van getransplanteerde cellen.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Meer video's verkennen