Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-kopienummerveranderingen op megabase-schaal in enkele cellen te identificeren. Om genomische heterogeniteit in celpopulaties te categoriseren, is het noodzakelijk om genomische veranderingen met een resolutie van één cel te identificeren. Traditioneel werd dit bereikt met behulp van cytologische benaderingen, maar deze methoden waren beperkt in hun gevoeligheid en specificiteit.

Single-cell sequencing kan een verscheidenheid aan genomische veranderingen detecteren, met verbeterde gevoeligheid en specificiteit ten opzichte van eerdere benaderingen, maar alleen wanneer zorgvuldig uitgevoerd. Hier beschrijven we hoe single-cell sequencing kan worden gebruikt om op betrouwbare wijze kopienummerveranderingen op megabase-schaal in enkele cellen te detecteren. Om de micro-aspirator te assembleren, begint u door de heldere plastic kop van de aspiratorbuisassemblage te verwijderen en de smalle kop in te brengen in een van de uiteinden van een PVC-buis van één voet lang met een binnendiameter van 3/16e inch.

Plaats de uitlaat van een 0,2 micrometer spuitfilter in het andere uiteinde van de één voet lange PVC-buis met een binnendiameter van 3/16e inch. Plaats vervolgens de inlaat van het 0,2 micrometer spuitfilter in een van de uiteinden van een zes inch lange PVC-buis met een binnendiameter van 5/16e inch. Breek een vijf milliliter plastic serologische pipet op de één milliliter afmeting en breng het gebroken uiteinde in de open kant van de PVC-buis met de binnendiameter van 5/16e inch.

Plaats vervolgens de uitlaat van de vijf milliliter plastic serologische pipet in de flexibele kant van een aspiratorbuisassemblage en bedek vervolgens de rode mondstuk van de buisassemblage met een steriele plastic buis voor opslag. Trek een glas capillaire buis uit tot een binnendiameter van 10-30 micrometer door het midden van de buis in de buurt van een vlam te plaatsen en spanning op beide uiteinden van de buis toe te passen. Breek de getrokken buis in twee helften om twee mogelijke aspiratornaalden te maken.

Herhaal deze stap met verschillende buizen om er zeker van te zijn dat er voldoende naalden worden voorbereid met een geschikte binnendiameter voor het plukken van enkele cellen. Om adhesiecellen, zoals humane fibroblastcellijnen, voor te bereiden, oogst u de cellen door trypsinisatie en brengt u de cellen over in een conische buis met het juiste medium. Zet een kap op voor gehele genoomversterking door 10%bleach te gebruiken om het oppervlak van de kap, pipettentipsdozen en pipettentips te besproeien.

Gebruik vervolgens een papieren handdoek om ze allemaal af te vegen voordat u de was met 70%ethanol herhaalt. Voeg acht microliter water toe van de Whole Genome Amplification, of WGA, kit aan individuele putjes op een 96-wells PCR-plaat. Bedek vervolgens de 96-wells PCR-plaat met een deksel van een 96-wells weefselkweekplaat en plaats de plaat op ijs.

Voeg vervolgens 1.000 cellen toe aan 10 milliliter medium of PBS in een 15 centimeter petrischaal en plaats de schaal op ijs om te voorkomen dat de cellen aan de schaal hechten. Breng vervolgens, terwijl u nog steeds op ijs bent, de cellen in de petrischaal en de 96-wells PCR-plaat over naar een lichtmicroscoop met een 10X objectief. Vergroot de opening van de aspiratornaald door zachtjes op het uitgetrokken uiteinde van de naald op een hard oppervlak te tikken, zodat de punt afbreekt.

Plaats vervolgens het brede uiteinde van de naald in de heldere kant van de micro-aspirator. Plaats vervolgens de petrischaal met cellen op de microscooptafel. Plaats de rode mondstuk van de aspirator in de mond.

Gebruik vervolgens de ene hand om de aspiratornaald te bewegen en de andere hand om de petrischaal te verplaatsen, identificeer enkele cellen om te sequencen. Gebruik mondzuiging om een enkele cel in de aspiratornaald te trekken samen met ongeveer één tot twee microliter medium of PBS. Breng de cel over in de acht microliter water in een enkele put op de 96-wells PCR-plaat.

De kwaliteit en bruikbaarheid van single-cell sequencing-gegevens is afhankelijk van de toestand van elke cel en zijn genoom, neem daarom zorg tijdens celvoorbereiding en micro-aspiratie om levensvatbare en niet-apoptotische cellen te isoleren. Markeer de put die een cel heeft ontvangen na het aspireren van elke cel en het overbrengen naar een put op de PCR-plaat. Herhaal dit voor het gewenste aantal cellen.

Ondertussen ontdooi 10X Single Cell Lysis Fragmentation Buffer uit de Whole Genome Amplification kit. Om besmetting tijdens gehele genoomversterking te voorkomen, voegt u alle reagentia toe in een weefselkweekkap. Gebruik pipettentips met filters en verwissel de pipettentip tussen de putten.

Voor elke set tot 32 cellen, combineer 32 microliter 10X Single Cell Lysis and Fragmentation Buffer en twee microliter Proteinase K-oplossing in een microcentrifugebuisje, en wervel de buis om de inhoud te mengen. Voeg een microliter van de oplossing toe aan elke put en pipet op en neer om te mengen. Bedek de plaat en verzegel alle putten met plastic film.

Centrifugeer vervolgens de plaat kort in een miniplaat-spinner. Voer vervolgens de plaat door de thermocycler met het volgende programma. Koel vervolgens de plaat op ijs en centrifugeer deze kort.

Om een werkoplossing voor bereiding van de bibliotheek voor te bereiden uit de Whole Genome Amplification kit, combineer voor elke cel twee microliter 1X Single Cell Library Preparation Buffer en één microliter Library Stabilization Solution. Voldoende cellysis en volledige genoomfragmentatie is cruciaal om vooringenomenheid tijdens gehele genoomversterking te minimaliseren en de bereiding van hoogwaardige sequencingbibliotheken te garanderen. Voer daarom deze stappen exact zoals beschreven uit.

Verwijder de plastic film van de schaal en voeg drie microliter van de oplossing toe aan elke put. Pipet de inhoud van de put op en neer om te mengen, vervang vervolgens de plastic film. Na een korte centrifugatie van de plaat, incubeer de cellen gedurende twee minuten op 95 graden Celsius, koel vervolgens de plaat op ijs en centrifugeer de plaat kort.

Verwijder nu de plastic film, voeg één microliter Library Preparation Enzyme toe aan elke put en pipet de inhoud van de put op