Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Het algemene doel van deze procedure is om virulentiestrategieën en gastheer-pathogeensystemen te ontrafelen door de interactie van een candidatus phytoplasma malefactor-eiwit met gastheereiwitten van malus domestica te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in diverse biologische onderzoeksvelden en wordt hier in plantonderzoek gebruikt om de moleculaire mechanismen te verduidelijken die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de appelproliferatieziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat één enkel pathogene effector kan worden gescreend tegen duizenden potentiële interactoren, waardoor deze methode een eenvoudig haalbaar startpunt is in infectieonderzoek.

Identificeer eerst geïnfecteerde bomen met specifieke symptomen van appelproliferatie en controlebomen die symptoomvrij zijn. Snijd met schone snoeischaars wortelmonsters uit drie verschillende plaatsen van het wortelstelsel met een diameter van 0,5 1 cm en een lengte van ongeveer 5 cm. Plaats de wortelmonsters in adequaat gelabelde plastic zakken.

Plaats de monsters vervolgens in een koelbox met gekoelde koelelementen en bewaar ze bij vier graden Celsius tot verdere verwerking. Spoel de wortelmonsters met water om de grond te verwijderen. Breng de monsters daarna over naar een steriele Petrischaal en gebruik een gesteriliseerd scalpel om de wortelepidermis en de cortex te verwijderen.

Veeg het scalpel schoon met een pluisvrij doekje. Dip het instrument vervolgens in 70% ethanol en steriliseer het door verhitting boven een open vlam. Gebruik het scalpel om het floëem open te krassen.

Snijd het monster in kleine stukjes en verdeel aliquoten van 30-100 milligram van de stukjes over steriele reactiebuisjes van twee milliliter. Bewaar de monsters bij 80 graden Celsius of gebruik ze direct om DNA te isoleren, dat dient als template voor de amplificatie van effector-genen en de daaropvolgende klonering van de effector in de bait-vector. Na het isoleren van polyspecifiek phytoplasma-DNA uit geïnfecteerde bomen, volgt klonering in bait-vectoren en het testen op zelfactivatie en expressie volgens het tekstprotocol.

Strijk plex A ATP 00189 effector getransformeerde NMY51 uit op een verse SD-trp plaat en kweek deze bij 30 °C gedurende twee tot drie dagen totdat er rode kolonies verschijnen. Gebruik een rode kolonie van de agarplaat om drie milliliter SD-trp medium in een kleine schudkolf te inoculeren en incubeer de cultuur overnight bij 30 °C met schudden op 120-150 toeren per minuut. Inoculeer de volgende dag 20 milliliter SD-trp in een schudkolf met één milliliter van de overnight cultuur en laat dit acht uur groeien.

Gebruik SD-trp medium om de cultuur aan te passen naar een OD600 van 0,2, en ent met tien milliliters van de cultuur twee kolven die elk 100 milliliters SD-trp medium bevatten. Incubeer de culturen gedurende de nacht bij 30 °C onder schudding. Meet vervolgens de OD600 van de cultuur en pellet 120 OD600 eenheden.

Als er bijvoorbeeld een OD600 van 1,2 wordt gemeten, centrifugeer dan 100 milliliters monster, gooi het supernatant weg en gebruik 800 milliliters voorverwarmd 2xYPAD om het pellet te resuspenderen in twee schudkolven en incubeer dit bij 30 degrees Celsius. Incubeer de gistcultuur bij 30 degrees Celsius en 120-150 rotations per minute. Meet ongeveer elke 1,5 uur de OD600 volgens het tekstprotocol tot een OD600 van 0,6 is bereikt.

Nadat de zalmsperma-DNA, Te Lithium OAc en PEG Lithium OAc volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt 800 milliliter gistcultuur 5 minuten gecentrifugeerd bij 700 x G om de cellen te pelletteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in een totaal van 200 milliliter steriel dubbel gedestilleerd water. Pelletteer de cellen vervolgens opnieuw en gooi het supernatant weg.

Resuspendeer het pellet in 16 milliliters Te Lithium OAc-mix en centrifugeer het monster opnieuw. Verwijder daarna het supernatant en gebruik 9,6 milliliters Te Lithium OAc om het pellet te resuspenderen. Bereid in reactievaten van passende grootte twaalf buisjes voor met zeven micrograms peak Add HAC DNA-bibliotheekvector, 100 microliters 2% zalmsperm-DNA en 2,5 milliliters PEG Lithium OAc-mix.

Voeg 600 µL van de eerder bereide gistcel-suspensie toe aan elk van de twaalf vials en meng krachtig gedurende één minuut. Incubeer de reacties vervolgens 45 minuten in een waterbad bij 30 °C, waarbij elke 15 minuten wordt gemengd. Voeg daarna 160 µL DMSO toe aan elke vial en meng krachtig.

Incubeer de vials vervolgens nog 20 minuten bij 42 °C. Na het pelleteren van de cellen wordt het supernatant weggegooid en worden drie milliliter 2xYPAD gebruikt om elke pellet opnieuw te suspenderen. Voeg de cellen van alle twaalf vials samen in een schudkolf van 100 milliliter en incubeer de gist gedurende 90 minuten bij 30 °C en 120 omwentelingen per minuut.

Na de incubatie, nadat de cellen zijn gepellet en het supernatant is weggegooid, gebruikt u een serologische pipette van tien milliliter en 4,5 milliliter steriele 0,9% natriumchloride om het pellet grondig te resuspenderen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Neem 50 µL van de suspensie op en gebruik 0,9% natriumchloride om tienvoudige verdunningen voor te bereiden van 1:10 tot 1:1000. Plaats vervolgens 100 µL van elke verdunning op 90 millimeter Petri-schalen met SD-trp-leu agar.

Verdeel de rest van de onverdunde gist-suspensie over 16 Petri-schalen van 150 millimeter diameter met SD-trp-leu-His-ade agar. Incubeer de platen drie dagen bij 30 graden Celsius voor de SD-trp-leu platen en vier dagen voor de SD-trp-leu-his-ade platen. Bepaal de transfectie-efficiëntie door de kolonies van de verschillende seriële verdunningen op de SD-trp-leu selectieplaten te tellen.

Transfer elke kloon door met een steriele pipetpunt de kolonie op te pikken en uit te strijken op verse SD-trp-leu-his-ade selectieplaten. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 °C. Herhaal het overzetten van de klonen dagelijks tot een totaal van vijf passages is bereikt.

Om klonen te analyseren, bereid onder een steriele zuurkast voor elke kloon één steriele reactiebuis van twee milliliter met één milliliter SD-trp-leu-his-ade. Gebruik een hete naald om een gaatje in elke buis te prikken en gebruik een gasdoorlaatbare sealer om het gaatje af te sluiten. Inoculeer elke vial met vers koloniemateriaal van één kloon en incubeer de vials bij 30 °C en 150 rotaties per minuut gedurende 24 uur.

Nadat de cellen zijn gepellet en het supernatant is weggegooid, wordt het pellet resuspendeerd in de geschikte buffer en overgebracht naar een schone reactiebuis van twee milliliter. Voeg 100 µL zuurgewassen glaskraaltjes toe aan de suspensie en meng de buis vijf minuten krachtig. Zuiver tenslotte het plasmide DNA volgens het tekstprotocol.

Een samenvatting van de verwachte resultaten van de zelfactivatie-assay en hun interpretatie wordt gegeven in deze tabel en figuur. Zwakke zelfactivatie leidt tot groei op trp-leu-his selectieplaten, maar niet op trp-leu-his-ade uitgeputte selectieplaten. Gist die is getransformeerd met een sterk zelfactiverende bait zou daarentegen groeien op medium zonder trp-leu-his-ade.

Een succesvolle cotransformatie van bait en prey wordt gekenmerkt door groei op selectieve platen waarbij trp en leu ontbreken. Interactie tussen het bait- en een prey-eiwit leidt tot complementatie van de his- en ade-oxytrofie van NMY51. Hier wordt een voorbeeld getoond van een interactie tussen bait en prey in een Yeast 2 Hybrid-experiment. De Malus domestica gastheer-interactiepartners, MdTCP24 en MdTCP25, werden geïdentificeerd en de interactie werd bevestigd door denovo cone-transformatie met de effector.

Zodra de techniek onder de knie is, kan de gist-twee-hybride assay in één dag worden uitgevoerd, mits alle benodigde apparatuur en materialen, in het bijzonder de gist, vooraf correct zijn voorbereid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het essentieel om contaminatie te vermijden en altijd onder steriele omstandigheden te werken. Na deze procedure moet een andere onafhankelijke methode worden uitgevoerd, zoals bijvoorbeeld bimoleculaire fluorescentiecomplementatie, om de gevonden eiwit-eiwitinteracties te bevestigen.

Dit is bijzonder belangrijk, aangezien de gist of hybride op zichzelf relatief gevoelig is voor het genereren van fout-positieve resultaten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in vele verschillende onderzoeksvelden om de moleculaire principes van eiwit-eiwitinteracties beter te begrijpen, in het bijzonder bij gastheer-pathogeeninteracties en in vele andere biologische onderzoeksvelden. Bovendien zult u merken dat het uitvoeren van deze methode eenvoudig haalbaar is in elk redelijk uitgerust moleculair-biologisch laboratorium.

Vergeet niet dat het werken met bepaalde chemicaliën, scalpels en open vlammen extreem gevaarlijk kan zijn; houd daarom altijd rekening met bepaalde voorzorgsmaatregelen bij het uitvoeren van deze procedure. Dit betekent dat u persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en een veiligheidsbril moet gebruiken, evenals de algemene laboratoriumveiligheidsapparatuur.