Name: Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Ontdek eiwitinteracties tussen bacteriële effectoren en gastheerproteïnen in Malus domestica met behulp van yeast two-hybrid screening. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van Apple Proliferation Disease.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner en Florian Senoner uit de Laimburg Research Centre en Mirelle Borges Dias Schnetzer van Dualsystems Biotech AG voor de technische ondersteuning en Julia Strobl voor proeflezen het manuscript. Dit werk werd uitgevoerd als onderdeel van het APPL2.0 project werd gedeeltelijk gefinancierd door de autonome provincie Bozen / Bolzano, Italië en de Zuid-Tiroolse Apple Consortium.

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

In het Y2H scherm wordt het potentieel effector eiwit co-expressie gebracht met verschillende hypothetische interagerende eiwitten (stap 7). Elke groeiende gist kloon bevat het aas, maar een (potentieel) verschillende interactor. De interagerende eiwitten worden gecodeerd in een cDNA-bibliotheek die is gekloneerd in plasmiden prooi. Het aas en prooi plasmiden elke co-cistronically code voor een gedeelte van een gisttranscriptiefactor. Bij een fysieke interactie tussen het aas (effector) en een prooi plasmide- gecodeerd interactor, worden de twee delen transcriptiefactor (het DNA-bindingsdomein en het activatiedomein) verenigd en de reportergenexpressie geïnduceerd. De gist kan groeien op histidine- en adenine verarmd SD selectieplaten. Het soort prooi cDNA bibliotheek gescreend afhankelijk van de effector en dienovereenkomstig worden gekozen. De prooi en aas vector, evenals de giststam, moet compatibel zijn. In dit scherm, een LexA DNA-bindend domein en het Gal4 activering Domain werden als verenigbaar gisttranscriptiefactor eenheden. De cDNA-bibliotheek kan afzonderlijk worden vervaardigd, maat of commercieel verkregen. De bereiding van het cDNA prooi bibliotheek maakt geen deel uit van dit protocol. In dit protocol, een zelf gebouwd, genormaliseerde cDNA-bibliotheek van het RNA van Malus x domestica bladeren werd gebruikt en gekloond in pGAD-HA-41. De effector (aas) tot expressie brengen giststam werd getransformeerd met de prooi bibliotheek en klonen werden geselecteerd op histidine- en-adenine uitgeputte SD selectie platen. Om plasmide DNA uit de gistkolonies extraheren, wordt een kolom gebaseerde DNA plasmide mini kit voor bacteriën aanbevolen in combinatie met een mechanische verbreking stap gebruikt glasparels gist lysis (stap 8) te verbeteren. In dit plasmide zuivering wordt het aas en prooi vector gelijktijdig worden gezuiverd in relatief lage concentraties. De hoeveelheid plasmide DNA is genoeg om de interactiepartner identificeren door middel sequencing without voorafgaand plasmide vermeerdering (stap 8.4). Als alternatief kan het DNA gezuiverd stap 8,4 wordt getransformeerd in competente E. coli en geselecteerd met prooi-vector gemedieerde antibioticumresistentie (bijvoorbeeld ampicilline het bij pGAD-HA). De gewenste E. coli kolonies bevatten alleen de pGAD-HA-plasmide bibliotheek en high-yield plasmide zuivering kan worden uitgevoerd met deze klonen. De succesvolle transformatie van Plexa-N en pGAD-HA-constructen een aanvulling op de tryptofaan en leucine auxotrofie van NMY51. Een interactie tussen het effector en een eiwit (gecodeerd op pGAD-HA) leidt tot de activering van het reporter systeem NMY51 stammen. In het geval van zelf-activatie, NMY51 getransformeerd met de effector tot expressie Plexa-N in combinatie met de lege bibliotheek vector pGAD-HA groeit op selectieve platen ontbreekt trp-leu-his-ade, vanwege de ongewenste activering van het NMY51 reportersysteem 40. De zelf-activatie kan worden weak en kunnen optreden in de afwezigheid van trp-leu-his of de activering sterke en gekenmerkt door groei op trp-leu-his-ade platen 41 zijn. Self-activering kan een enorme achtergrond van vals-positieve klonen in de feitelijke Y2H scherm veroorzaken. Om dit te vermijden, moet een test zelfactivering met het aas worden uitgevoerd, waarbij de effector-tot expressie vector is mede getransformeerd met de lege vector library. In deze experimentele instelling, moet reportergenexpressie niet worden opgewekt. Als zelf-activatie (dat wil zeggen groei op selectieve platen) zichtbaar in de test, kan het medium worden aangevuld met verschillende concentraties van 3-amino-1,2,4-triazool 45 (3-AT). 3-AT is een remmer van imidazoleglycerol-fosfaat dehydratase (HIS3), een enzym van belang tijdens histidine biosynthese 46. Suppletie met 3-AT kan tijdens Y2H schermen 47 de zwakke effecten van zelfwerkzaamheid te verminderen,48. Verschillende concentraties van 3-AT moeten worden getest. In dit protocol, 1 - werden 40 mM 3-AT gebruikt. De laagste concentratie die leidt tot de onderdrukking van zelf-activatie zou vervolgens worden gebruikt in het Y2H scherm. De selectieve platen van de zelf-activatie assay kan alleen worden beoordeeld indien de SD-trp-leu platen van de co-transformatie zijn in voldoende aantal klonen. Ter indicatie ≥ 500 kolonies per 90 mm (diameter) petrischaal voldoende. Om de exacte transfectie efficiëntie te bepalen, wordt aanbevolen seriële verdunningen van de getransformeerde gist-co bereiden en te verspreiden op SD-trp-leu-platen. Om zelf-activatie te verminderen, kan de effector worden gekloneerd in Plexa-C, aas expressievector die het LexA tag aan de C-terminus van het eiwit zekeringen. De oriëntatie van de Lex-A tag kan zelfwerkzaamheid 24 verzwakken. Het is echter niet mogelijk in alle gevallen te verminderen of opheffen zelf-activatie. De formatie vanrode of roodachtige kolonies duidt op een zwakke of vals-positieve interactie. De ade2 reportergen van NMY51 wordt alleen geactiveerd wanneer het gaat om een eiwit-eiwit interactie, waardoor blokkeert de accumulatie van een rode kleurstof in deze giststam 40. Bij afwezigheid van een interactie, NMY51 roodachtig, terwijl kolonies dragen sterk interactorenen zijn wit. De waarneming van de kolonie kleur op de selectie platen verschaft aldus een verdere belangrijke hint om te beoordelen of de respectievelijke kolonies zijn true-of vals-positieve interactors. Het is uiteindelijk moet passen of bepaalde assay wijzigen met betrekking tot de aard van het aas en interactiekarakteristieken. Inmiddels hebben een aantal verbeteringen en derivaattechnieken conventionele Y2H vastgesteld, teneinde de analyse van nogal moeilijk eiwit interacties in verschillende gastheersystemen. Een overzicht van Stynen et al. 49 adressen eennd beschrijft verschillende aspecten van Y2H, zijn verbeteringen en aanpassingen, en dus biedt nuttige informatie over hoe u de juiste interactie test te kiezen. Y2H schermen en afgeleide technieken zijn geworden op grote schaal gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, waar de identificatie van binaire eiwit interacties is vereist. Zelfs als kritische controles worden uitgevoerd, zoals zelf-activeringstests van het aas en één-op-één re-transformaties van de geïdentificeerde interagerende eiwitten, de Y2H is gevoelig voor verkeerde resultaten 26, 50, 51 te produceren. De gist als een model is geschikt voor alle interactie studies. Gist vormt niet noodzakelijk een mobiele omgeving die de juiste post-translationele modificatie en vouwen voor elk eiwit 24 ondersteunt. Verder in de omgeving Y2H de eiwitten tot overexpressie gebracht en de expressie niet controlonder leiding van hun natuurlijke promotor. De Y2H dwingt de eiwitachtige interactiepartners naar de nucleus, wat niet noodzakelijk hun natuurlijke subcellulaire bestemming. De inheemse cellulaire omstandigheden van de interactie kan dus niet worden weerspiegeld door de gist en kan leiden tot vals-negatieve of vals-positieve resultaten. Y2H meeste zijn gebaseerd op gist auxotrofie complementatie als selectieve principe. Deze voeding selectie wordt gekenmerkt door hoge gevoeligheid, maar ten koste van verminderde selectiviteit ten opzichte van andere (bijvoorbeeld chromogene reporter) assays 49. Als unreducible zelfwerkzaamheid (zie boven) of andere beperkingen optreden voor een bepaalde effector, de Y2H geen geschikte test 25. In tabel 1 en figuur 1, zijn de verwachte resultaten van de zelf-activatie test gegeven. De afwezigheid van echte interacties (dat wil zeggen valse negatieven) kan worden veroorzaakt door proteïne toxiciteit, onjuiste translationele eiwitprocessing, sterische hindering van de interactie, ondervertegenwoordigd interactie partners in de prooi bibliotheek, membraan lokalisatie van het aas, of ontbrekende onderdelen die nodig zijn voor de interactie 24. Het wordt aanbevolen om de novo versterken de full-length gen van de geïdentificeerde interactie eiwit van cDNA, subkloneren van het in pGAD-HA, en het uitvoeren van een een-op-een interactie analyse door het transformeren van de gegenereerde pGAD-HA construct in het aas-expressie NMY51 stam. Dit is nodig omdat de waargenomen interactor in de prooi bibliotheek slechts een fragment van een groter eiwit kan zijn. Echter, de informatie voor de respectieve volledige lengte-gen is alleen toegankelijk als veel van genomics en transcriptomics sequentie gegevens beschikbaar zijn. De transformatie protocol voor de zelf-activatie assay beschreven kunnen worden toegepast voor zulk een één-op-één assay, en de interactie tussen het aas en de interactor moet reproduceerbaar zijn. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interacties geïdentificeerd in een Y2H scherm moet altijd worden bevestigd door andere onafhankelijke techniek. Deze onafhankelijke technieken altijd dichterbij de natuurlijke omgeving van het eigenlijke proteïne-proteïne interactie. Bij de phytoplasmal effector ATP_00189, de interactie met de TCP transcriptiefactoren van Malus domestica geverifieerd in planta met bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) in Nicotiana benthamiana protoplasten 28 (geen onderdeel van dit protocol). De effector eiwit ATP_00189 was afgeleid van de plant pathogeen P. mali. In planta BiFC werd dus gekozen om ATP_00189 interacties met de Malus x domestica transcriptiefactoren controleren eerder geïdentificeerd in de Y2H 28. BiFC is een eiwit-eiwit interactie assay die de subcellulaire translocatie van de interacterende eiwitten naar de kern vereist om het reportersysteem &lt;activerensup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Bovendien is de in planta expressie en modificatie van machines bootst de omgeving van de natuurlijke interactie tussen de plant bacteriële effector in de waardplant. Echter, een wereldwijde scherm met behulp van BiFC is niet haalbaar. Er zijn verschillende stappen in het protocol dat zorgvuldig moet worden aangepakt. Wanneer het amplificeren van het gen van belang (stap 4), is het belangrijk te sluiten dat primers binden aan planten DNA. Zo mag DNA van niet geïnfecteerde planten worden opgenomen als een negatieve controle. De sequentie van het gen van belang niet de EcoRI en Sali restrictieplaatsen die worden gebruikt voor de gerichte klonering van de ingebrachte sequentie. Indien de sequentie bevat wel deze plaatsen moeten verschillende restrictie-enzymen voor klonering gekozen. Gisttransformatie is centraal in deze methode protocol. Transfectie efficiëntie hangt af van de bekwaamheid van de gistcellen, de levensvatbaarheid, groei toestand en de kwaliteit van de transfectie Reagent 53, 54. Voor het voorgestelde protocol, is het sterk aan te raden om gist uit verse platen niet ouder dan twee weken (bewaard bij 4 ° C) te gebruiken bij het uitvoeren van de transformaties. Vaak is de groei van getransformeerde gist vertraagd wanneer selectieve vloeibare culturen worden geënt met kolonies van oude agarplaten. Het is ook nuttig om een ​​vloeibare startercultuur als een inoculum voor de feitelijke experimenten en niet de gist direct gebruik van de plaat. Lage efficiëntie tijdens transfecteren van de prooien in de aas gist tot expressie kan leiden tot de ondervertegenwoordiging van bepaalde prooi eiwitten (potentiële interactors) en kan dus het hele scherm scheef. In dit protocol, een gist transfectie efficiëntie van ~ 150.000 cfu / ug DNA getransfecteerd in de Y2H werkte goed. Het kennen van de gebreken en nadelen van de Y2H techniek en interpretatie van de resultaten op een kritische en passende wijze is onmisbaar voor het tekenen van de correct conclusies. Y2H assays en de derivaten zijn gebruikt voor vele jaren hebben vele verbeteringen en aanpassingen ondergaan ten opzichte van de verschillende aas kenmerken, de subcellulaire lokalisatie van de interactie, de verwachte bindingspartners, en andere factoren die voor de interactie nodig kunnen zijn (zie Y3H 55, 56, 57). Onlangs hebben-array gebaseerde Y2H schermen ontwikkeld die het mogelijk maken voor geautomatiseerde, high-throughput analyse van een groot aantal aas tegen miljoenen prooien 58. De toekomst ligt waarschijnlijk in automatisering en high-throughput benaderingen van deze assay om voor de interpretatie van complexe signaalwegen en interactomen in diverse domeinen.

<html> Gist twee-hybride-screening (Y2H) werd ongeveer 27 jaar geleden 1 ontwikkeld en sindsdien grote schaal gebruikt in verschillende gebieden van specifieke eiwit-eiwit interacties 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 bepalen, 11 . De fysieke interactie van een bacteriële effector met samen doeleiwit is vaak de voorwaarde voor de functionele manipulatie van deze doeleiwit. Analyseren van deze interacties is verhuisd naar de focus van veel verschillende sectoren van infectiebiologie 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Het principe van de Y2H scherm is dat de wisselwerking van twee proteïnen leidt tot het herstel van een functionele transcriptiefactor die de expressie van reportergenen aandrijft. De bekende effector (het&quot; lokaas &quot;) wordt translationeel gefuseerd aan het DNA bindend domein (DBD) van de transcriptiefactor, en de potentiële interactiepartners (de &quot;prooi&quot;) worden gefuseerd aan het activeringsdomein (AD) van de respectievelijke transcriptiefactor. Aangezien de interactie partner is onbekend, een bibliotheek van potentiële interactors wordt gekloneerd in de zogenaamde &quot;prooi-library.&quot; Normaal wordt deze bibliotheek door kloneren cDNA in een geschikte prooi vector expressieplasmide coderend voor het AD die compatibel is met de lokaas-vector gecodeerde DBD is. bij een interactie de gereconstitueerd transcriptiefactoren induceren de expressie van reportergenen, die globaal de groeiselectie gist mogelijk maken. deidentificatie van interactoren wordt verkregen door sequentiebepaling van het prooiplasmide met plasmide-specifieke primers. Bacteriën hebben verschillende strategieën ontwikkeld om manipuleren en exploiteren metabolisme hun gastheer of afweermechanismen onttrekken en scheiden effectormoleculen via verschillende bacteriële secretie systemen 19, 20, 21. Het bepalen van de bindingspartners van deze bacteriële effectoren is dus de eerste stap het identificeren van de gemanipuleerde route in de gastheer. Dit leidt tot een beter begrip van de specifieke mechanismen pathogeniciteit. Y2H schermen worden uitgevoerd bacteriële effector interacties te identificeren tijdens phytoplasmoses en vaak Y2H is een cruciale eerste experiment voor verdere karakterisering van moleculaire mechanismen pathogeniteit phytoplasma onderzoek 22, 23. De ontmoetinghod beschrijving in de meeste publicaties is vrij schaars, en deze technieken zijn vaak uitbesteed aan biotechbedrijven. Om de aandacht te vestigen op de haalbaarheid van deze methode, dit protocol biedt stap-voor-stap informatie om de interactie partners van een bacteriële effectormolecuul te identificeren in zijn natuurlijke gastheer. Ondanks het brede gebruik en de fast forward aanpak van Y2H schermen, moet niet worden vergeten dat bepaalde interacties niet kunnen optreden in de gist systeem. Dit komt door het feit dat de gistcel wordt gebruikt als een soort &quot;in vivo reactievat&quot; met bepaalde biologische beperkingen. Verschillende auteurs hebben de voor- en nadelen van Y2H en zijn derivaten 11, 24, 25, 26, 27 aangepakt. Algemene overwegingen zijn, bijvoorbeeld dat de gistcel niet nuttig zou verschaffengenexpressie, (post-) translationeel of translocational voorwaarden voor de respectievelijke eiwitten worden bestudeerd. Dit kan leiden tot vals-negatieve resultaten in het scherm. Positieve interacties beurt kan artefacten en kunnen niet voorkomen in natuurlijke toestand (dwz bij effectoren in de geschikte gastheer). Het is dus noodzakelijk om de interacties van de heterologe gistexpressiesysteem een ​​onafhankelijke interactie testen bevestigen een verwant biologisch systeem. In deze studie werden de bindende partners van de effector ATP_00189 uit de niet-landbouw plant-pathogeen Candidatus fytoplasma mali (P. mali) geïdentificeerd. De resultaten geven belangrijke inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het symptoom ontwikkeling van apple proliferatie 28, een ziekte die hoge economische verliezen in de getroffen-appel groeiende regio&#39;s zorgt ervoor dat in Europa 29.

<table><tbody><tr><td>Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>voor media en buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>voor media en buffer</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>voor media en buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>ammonium acetate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>Isopropanol (2-Propanol)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamyl 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>Proofreading Polymerase (bijv. iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>voor PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>voor kloneren</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>voor kloneren</td></tr><tr><td>Column-based DNA Purification Kit (bijv. QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>voor kloneren</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>voor microbiologische selectie</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>voor zelfactiveringstest</td></tr><tr><td>L-Arginine Monohydrochloride&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3680</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Isoleucine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3642</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-lysine Monohydrate&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3448</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Methionine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3897</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3464</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Threonine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3946</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Tyrosine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Uracile</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Valine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3406</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Adenine Hemisulfate Salt&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1596</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m Pore Filter</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>voor steriele filtratie</td></tr><tr><td>L-Histidine Monohydrochloride</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Leucine&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3496</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>L-Tryptophane&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3410</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>voor gist- en bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>voor gisttransformatie</td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>voor gisttransformatie</td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td><td>voor gisttransformatie</td></tr><tr><td>Antibody against Lex-A tag (bijv. Anti-LexA DNA binding region)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>voor Western blot</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep kit (bijv. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>voor plasmide-zuivering uit gist en bacteriën</td></tr><tr><td>Acid Washed Glass Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>voor plasmide-zuivering uit gist</td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium Salt</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>voor microbiologische selectie</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>Vacuum concentrator centrifuge (bijv. Concentrator 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>Bait vector (bijv. pLexA-N)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>voor Y2H</td></tr><tr><td>Prey vector (bijv. pGAD-HA)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>voor Y2H</td></tr><tr><td>Control prey vector (bijv. pLexA-p53)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>voor Y2H</td></tr><tr><td>Control bait vector (bijv. pACT-largeT)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>voor Y2H</td></tr><tr><td>Electrocompetent E. coli (bijv. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>voor kloneren</td></tr><tr><td>Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&Delta;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, bijv. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>voor Y2H</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film (bijv. Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>voor gist- en bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Gas permeable sealer (bijv. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>voor gistcultuur</td></tr><tr><td>PCR Cycler (bijv. T100 Thermal Cycler)</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>voor PCR</td></tr><tr><td>quantitative PCR Cycler (bijv. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection

het ontrafelen van de functie van een bacteriële effector uit een niet-landbouw plant pathogeen met behulp van een gist two-hybrid screen

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van de ziekte verschijnselen is belangrijk om pathologieën en symptoomcontrole ontwikkeling in plantaardige wetenschap begrijpen. Bacteriën hebben verschillende strategieën ontwikkeld om hun gastheer stofwisseling te manipuleren voor hun eigen voordeel. Deze bacteriële manipulatie gaat vaak gepaard met ernstige symptoom ontwikkeling of de dood van de aangetaste planten. Vaststellen van de specifieke bacteriën die verantwoordelijk zijn voor de gastheer manipulatie heeft belangrijke veld microbiologisch onderzoek. Na de identificatie van deze bacteriële moleculen, genaamd &quot;effectors&quot; is het belangrijk om de functie te helderen. Een eenvoudige benadering bepalen van de functie van een werkzame middel zijn eiwitachtige bindingspartner identificeren zijn natuurlijke gastheer via een gist twee-hybride (Y2H) scherm. Normaliter de gastheer herbergt talrijke potentiële bindingspartners die onvoldoende kunnen worden voorspeld door een in silico algoritme. Het is dus de beste keuze om perform een ​​scherm met de hypothetische effector tegen een hele bibliotheek van tot expressie gastheer eiwitten. Het is vooral een uitdaging als de verwekker is uncultivable als fytoplasma. Dit protocol biedt stap-voor-stap instructies voor het DNA-zuivering uit een phytoplasma besmet houtige waardplant, de versterking van de potentiële effector, en de daaropvolgende identificatie van moleculaire interactie partner van de plant met een Y2H scherm. Hoewel Y2H schermen vaak worden gebruikt, is er een trend om deze techniek te besteden aan biotechbedrijven de Y2H service tegen een kostprijs. Dit protocol bevat instructies over hoe je een Y2H presteren in elk fatsoenlijk uitgerust laboratorium voor moleculaire biologie met behulp van standaard lab technieken.

Voorafgaand aan de eigenlijke Y2H scherm kan worden uitgevoerd moet het aas worden getest op zelfwerkzaamheid. Dit wordt bereikt door transformatie samen het aas expressievector met de lege vector prooi bibliotheek en controle groei op selectieve platen. Om te analyseren of de phytoplasmal eiwit ATP_00189 is self-activerende, werd de zelf-activatie test uitgevoerd zoals beschreven in hoofdstuk 5. De bait plasmide wordt als aanvulling op de TRP en de prooi plasmide de leu auxotrofie van S. cerevisiae NMY51 40. Een succesvolle co-transformatie wordt dus gekenmerkt door groei op selectieve platen ontbreekt trp en leu. Interactie van het aas en een prooi eiwit leidt tot een complementering van het zijn en ade auxotrofie van NMY51. Als zelfwerkzaamheid door het aas in de afwezigheid van een interactie verschijnt, de gist groeit op selectieve platen ontbreekt zijn en ade. Sterke en zwakke zelf-activatie kan optreden. Sterke zelf-activatie van het aas wordt gekenmerkt door de groei van de gecotransformeerde gist op trp-leu-his-ade uitgeputte selectieplaten. Zwakke zelf-activatie leidt tot groei op trp-leu-his maar niet op trp-leu-his-ade uitgeputte selectieplaten. Proper positieve controles zijn onmisbaar voor de interpretatie van de resultaten van de zelfwerkzaamheid assay. Een samenvatting van de verwachte resultaten van de zelf-activatie assay en de interpretatie daarvan is opgenomen in tabel 1 en weergegeven in figuur 1. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figuur 1: Voorbeeld van Bait Self-activering Tests van een Bait voordat u een Y2H Screen. S. cerevisiae NMY51 werd co-getransformeerd met interactie aas (plex-p53) en prooi (pACT-LARGET) als een positieve controle (linker paneel: ac), een zwak zelfwerkend plus een lege prooi weegschaalry vector (middelste paneel: df) en een niet zelfactiverende aas plus een lege prooi bibliotheek vector (rechter paneel: gi). De gecotransformeerde gist werden gekweekt op SD-platen ontbreekt trp en leu (bovenpaneel: a, d, g), trp, leu en zijn (middenpaneel: b, e, h) en trp, leu, zijn en ade (lagere paneel: c, f, i). Selectie op medium zonder trp en leu is een positieve controle voor een succesvolle co-transformatie, als het aas vector een aanvulling op de TRP auxotrofie en de prooi vector de leu auxotrofie van NMY51 (groei op SD-trp-leu). Bij een interactie tussen aas en prooi of een zelf-activatie van het aas, wordt de reporter expressie van NMY51 ingeschakeld en de aanvulling zijn en ade auxotrofie (groei op SD-trp-leu-his-ade). Een zwakke zelfwerkzaamheid wordt gekenmerkt door groei op een SD-trp-leu-platen zijn (middelste paneel, df). Zwakke zelf-activatie van aas worden verminderd vóór de analyse van de aasin een Y2H scherm, bijvoorbeeld door het toevoegen van 3-AT aan de selectieve media. Aminozuur depleties worden aangegeven met &quot;-&quot; in de respectieve media naam. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Plexa-N-atp00189 </td><td> geen </td><td> kolonies </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td></tr><tr><td> geen </td><td> pGAD-HA </td><td> geen groei </td><td> kolonies </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td></tr><tr><td> Plexa-N </td><td> geen </td><td> kolonies </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td></tr><tr><td> Plexa-N </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonies </td><td> kolonies </td><td&gt; kolonies </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td></tr><tr><td> Plexa-p53 </td><td> pACT-larget </td><td> kolonies </td><td> kolonies </td><td> kolonies </td><td> kolonies </td><td> kolonies </td></tr><tr><td> Plexa-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> kolonies </td><td> kolonies </td><td> kolonies </td><td> geen groei </td><td> geen groei </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Verwachte resultaten in een Bait Self-activering Assay. De transformatie van S. cerevisiae NMY51 oplevert in differentiële groei op selectieve media op basis van de kenmerken van gecotransformeerde lokaas en prooi. Groei op selectieve platen werd geëvalueerd na transformatie vector van verschillende combinaties (af) na 72 uur incubatie bij 30 ° C. Zwakke zelfwerkzaamheid wordt gekenmerkt door gist groei op SD-trp-leu-zijn en een sterke zelfwerkzaamheid door de groei op een SD-trp-leu-zijn-ade selectie plates bij afwezigheid van een interactie partner. De Plexa-N gecodeerde phytoplasmal effector ATP_00189 niet vertoont zelf-activatie, die wordt gekenmerkt door het onvermogen van het aas vector getransformeerde NMY51 te groeien in de afwezigheid van zijn en ade. Afhankelijk van het aas, kan een Y2H scherm tal van gist klonen te krijgen groeien op selectieve platen. Alle klonen worden geanalyseerd en gecontroleerd op mogelijke ontslagen. Zelfs als een genormaliseerde cDNA-bibliotheek is gebruikt, is het zeer waarschijnlijk dat een bindingspartner is vertegenwoordigd in vele verschillende klonen. Afhankelijk van de bibliotheek klonen techniek is het ook mogelijk dat alleen fragmenten van het volledige gen in sommige prooi vectoren ingevoegd. Derhalve is het raadzaam om de novo amplificeren (van cDNA) en subkloneren van het gen van volledige lengte van de Interactor en de interactie te testen in een één-op-één Y2H analyse (figuur 2). <img alt = &quot;Figuur 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2: Voorbeeld van een interactie tussen Bait and Prey in een Y2H Experiment. Een scherm Gist twee-hybride (Y2H) werd uitgevoerd en plasmiden uit positieve interactor klonen werden gezuiverd. De prooi vector werd gesequenced en de Malus x domestica gastheer interactie partners MdTCP24 en MdTCP25 werden geïdentificeerd. Als negatieve controle MdTCP34 (waarvoor geen interactor werd geïdentificeerd in het Y2H bibliotheekscherm) werd gesubkloneerd in parallel. De volledige lengte genen werden geamplificeerd uit appel cDNA gesubkloneerd in de prooi vector (co-cistronically expressie het activeringsdomein AD) en de novo co-getransformeerd met het aas vector die de bacteriële effector ATP_00189 gekoppeld met het DNA-bindingsdomein (bd). Dit cijfer is ontleend aan 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere weergave</a>versie van deze figuur.

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Het algemene doel van deze procedure is om virulentiestrategieën en gastheer-pathogeensystemen te ontrafelen door de interactie van een candidatus phytoplasma malefactor-eiwit met gastheereiwitten van malus domestica te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in diverse biologische onderzoeksvelden en wordt hier in plantonderzoek gebruikt om de moleculaire mechanismen te verduidelijken die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de appelproliferatieziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat één enkel pathogene effector kan worden gescreend tegen duizenden potentiële interactoren, waardoor deze methode een eenvoudig haalbaar startpunt is in infectieonderzoek.Identificeer eerst geïnfecteerde bomen met specifieke symptomen van appelproliferatie en controlebomen die symptoomvrij zijn. Snijd met schone snoeischaars wortelmonsters uit drie verschillende plaatsen van het wortelstelsel met een diameter van 0,5 1 cm en een lengte van ongeveer 5 cm. Plaats de wortelmonsters in adequaat gelabelde plastic zakken.Plaats de monsters vervolgens in een koelbox met gekoelde koelelementen en bewaar ze bij vier graden Celsius tot verdere verwerking. Spoel de wortelmonsters met water om de grond te verwijderen. Breng de monsters daarna over naar een steriele Petrischaal en gebruik een gesteriliseerd scalpel om de wortelepidermis en de cortex te verwijderen.Veeg het scalpel schoon met een pluisvrij doekje. Dip het instrument vervolgens in 70% ethanol en steriliseer het door verhitting boven een open vlam. Gebruik het scalpel om het floëem open te krassen.Snijd het monster in kleine stukjes en verdeel aliquoten van 30-100 milligram van de stukjes over steriele reactiebuisjes van twee milliliter. Bewaar de monsters bij 80 graden Celsius of gebruik ze direct om DNA te isoleren, dat dient als template voor de amplificatie van effector-genen en de daaropvolgende klonering van de effector in de bait-vector. Na het isoleren van polyspecifiek phytoplasma-DNA uit geïnfecteerde bomen, volgt klonering in bait-vectoren en het testen op zelfactivatie en expressie volgens het tekstprotocol.Strijk plex A ATP 00189 effector getransformeerde NMY51 uit op een verse SD-trp plaat en kweek deze bij 30 °C gedurende twee tot drie dagen totdat er rode kolonies verschijnen. Gebruik een rode kolonie van de agarplaat om drie milliliter SD-trp medium in een kleine schudkolf te inoculeren en incubeer de cultuur overnight bij 30 °C met schudden op 120-150 toeren per minuut. Inoculeer de volgende dag 20 milliliter SD-trp in een schudkolf met één milliliter van de overnight cultuur en laat dit acht uur groeien.Gebruik SD-trp medium om de cultuur aan te passen naar een OD600 van 0,2, en ent met tien milliliters van de cultuur twee kolven die elk 100 milliliters SD-trp medium bevatten. Incubeer de culturen gedurende de nacht bij 30 °C onder schudding. Meet vervolgens de OD600 van de cultuur en pellet 120 OD600 eenheden.Als er bijvoorbeeld een OD600 van 1,2 wordt gemeten, centrifugeer dan 100 milliliters monster, gooi het supernatant weg en gebruik 800 milliliters voorverwarmd 2xYPAD om het pellet te resuspenderen in twee schudkolven en incubeer dit bij 30 degrees Celsius. Incubeer de gistcultuur bij 30 degrees Celsius en 120-150 rotations per minute. Meet ongeveer elke 1,5 uur de OD600 volgens het tekstprotocol tot een OD600 van 0,6 is bereikt.Nadat de zalmsperma-DNA, Te Lithium OAc en PEG Lithium OAc volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt 800 milliliter gistcultuur 5 minuten gecentrifugeerd bij 700 x G om de cellen te pelletteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in een totaal van 200 milliliter steriel dubbel gedestilleerd water. Pelletteer de cellen vervolgens opnieuw en gooi het supernatant weg.Resuspendeer het pellet in 16 milliliters Te Lithium OAc-mix en centrifugeer het monster opnieuw. Verwijder daarna het supernatant en gebruik 9,6 milliliters Te Lithium OAc om het pellet te resuspenderen. Bereid in reactievaten van passende grootte twaalf buisjes voor met zeven micrograms peak Add HAC DNA-bibliotheekvector, 100 microliters 2% zalmsperm-DNA en 2,5 milliliters PEG Lithium OAc-mix.Voeg 600 µL van de eerder bereide gistcel-suspensie toe aan elk van de twaalf vials en meng krachtig gedurende één minuut. Incubeer de reacties vervolgens 45 minuten in een waterbad bij 30 °C, waarbij elke 15 minuten wordt gemengd. Voeg daarna 160 µL DMSO toe aan elke vial en meng krachtig.Incubeer de vials vervolgens nog 20 minuten bij 42 °C. Na het pelleteren van de cellen wordt het supernatant weggegooid en worden drie milliliter 2xYPAD gebruikt om elke pellet opnieuw te suspenderen. Voeg de cellen van alle twaalf vials samen in een schudkolf van 100 milliliter en incubeer de gist gedurende 90 minuten bij 30 °C en 120 omwentelingen per minuut.Na de incubatie, nadat de cellen zijn gepellet en het supernatant is weggegooid, gebruikt u een serologische pipette van tien milliliter en 4,5 milliliter steriele 0,9% natriumchloride om het pellet grondig te resuspenderen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Neem 50 µL van de suspensie op en gebruik 0,9% natriumchloride om tienvoudige verdunningen voor te bereiden van 1:10 tot 1:1000. Plaats vervolgens 100 µL van elke verdunning op 90 millimeter Petri-schalen met SD-trp-leu agar.Verdeel de rest van de onverdunde gist-suspensie over 16 Petri-schalen van 150 millimeter diameter met SD-trp-leu-His-ade agar. Incubeer de platen drie dagen bij 30 graden Celsius voor de SD-trp-leu platen en vier dagen voor de SD-trp-leu-his-ade platen. Bepaal de transfectie-efficiëntie door de kolonies van de verschillende seriële verdunningen op de SD-trp-leu selectieplaten te tellen.Transfer elke kloon door met een steriele pipetpunt de kolonie op te pikken en uit te strijken op verse SD-trp-leu-his-ade selectieplaten. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 °C. Herhaal het overzetten van de klonen dagelijks tot een totaal van vijf passages is bereikt.Om klonen te analyseren, bereid onder een steriele zuurkast voor elke kloon één steriele reactiebuis van twee milliliter met één milliliter SD-trp-leu-his-ade. Gebruik een hete naald om een gaatje in elke buis te prikken en gebruik een gasdoorlaatbare sealer om het gaatje af te sluiten. Inoculeer elke vial met vers koloniemateriaal van één kloon en incubeer de vials bij 30 °C en 150 rotaties per minuut gedurende 24 uur.Nadat de cellen zijn gepellet en het supernatant is weggegooid, wordt het pellet resuspendeerd in de geschikte buffer en overgebracht naar een schone reactiebuis van twee milliliter. Voeg 100 µL zuurgewassen glaskraaltjes toe aan de suspensie en meng de buis vijf minuten krachtig. Zuiver tenslotte het plasmide DNA volgens het tekstprotocol.Een samenvatting van de verwachte resultaten van de zelfactivatie-assay en hun interpretatie wordt gegeven in deze tabel en figuur. Zwakke zelfactivatie leidt tot groei op trp-leu-his selectieplaten, maar niet op trp-leu-his-ade uitgeputte selectieplaten. Gist die is getransformeerd met een sterk zelfactiverende bait zou daarentegen groeien op medium zonder trp-leu-his-ade.Een succesvolle cotransformatie van bait en prey wordt gekenmerkt door groei op selectieve platen waarbij trp en leu ontbreken. Interactie tussen het bait- en een prey-eiwit leidt tot complementatie van de his- en ade-oxytrofie van NMY51. Hier wordt een voorbeeld getoond van een interactie tussen bait en prey in een Yeast 2 Hybrid-experiment. De Malus domestica gastheer-interactiepartners, MdTCP24 en MdTCP25, werden geïdentificeerd en de interactie werd bevestigd door denovo cone-transformatie met de effector.Zodra de techniek onder de knie is, kan de gist-twee-hybride assay in één dag worden uitgevoerd, mits alle benodigde apparatuur en materialen, in het bijzonder de gist, vooraf correct zijn voorbereid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het essentieel om contaminatie te vermijden en altijd onder steriele omstandigheden te werken. Na deze procedure moet een andere onafhankelijke methode worden uitgevoerd, zoals bijvoorbeeld bimoleculaire fluorescentiecomplementatie, om de gevonden eiwit-eiwitinteracties te bevestigen.Dit is bijzonder belangrijk, aangezien de gist of hybride op zichzelf relatief gevoelig is voor het genereren van fout-positieve resultaten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in vele verschillende onderzoeksvelden om de moleculaire principes van eiwit-eiwitinteracties beter te begrijpen, in het bijzonder bij gastheer-pathogeeninteracties en in vele andere biologische onderzoeksvelden. Bovendien zult u merken dat het uitvoeren van deze methode eenvoudig haalbaar is in elk redelijk uitgerust moleculair-biologisch laboratorium.Vergeet niet dat het werken met bepaalde chemicaliën, scalpels en open vlammen extreem gevaarlijk kan zijn; houd daarom altijd rekening met bepaalde voorzorgsmaatregelen bij het uitvoeren van deze procedure. Dit betekent dat u persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en een veiligheidsbril moet gebruiken, evenals de algemene laboratoriumveiligheidsapparatuur.

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video, beschrijven we een procedure voor de expressie van bacteriële type III effectoren in gist en het identificeren van effector-geïnduceerde groeiremming fenotypes. Dergelijke fenotypes kan vervolgens worden benut om effectorfuncties en doelstellingen toe te lichten.

Identificatie van groeiremming fenotypes geïnduceerd door expressie van bacteriële type III Effector in gist

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

We hebben gewijzigd de conventionele gist twee-hybride screening, een effectief middel bij het identificeren van genetische eiwit interactie. Deze wijziging verkort aanzienlijk het proces, vermindert de werkdruk, en het belangrijkst, vermindert het aantal false positives. Daarnaast is deze aanpak is reproduceerbaar en betrouwbaar.

Gemodificeerde gist-twee-hybride systeem aan eiwitten Interactie met de groeifactor progranuline identificeren

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Ontdek eiwitinteracties tussen bacteriële effectoren en gastheerproteïnen in Malus domestica met behulp van yeast two-hybrid screening. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van Apple Proliferation Disease.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen (Video) | JoVE Journal

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Meer video's verkennen