Name: Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer de synthese van 1,2-azaborines en de voorbereiding van eiwitcomplexen met T4 lysozym mutanten voor biomedisch onderzoek. Deze methode biedt een betrouwbare route naar boronhoudende verbindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) en Boston College.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben in dit manuscript.

In het eerste deel van dit protocol beschreven we een gemodificeerde synthese van 1,2-azaborines gebaseerd op eerder beschreven werkwijzen 12, 13. Triallylborane 22 werd gebruikt als een substituut voor de routes met behulp van allyltriphenyl tin of kalium allyltrifluoroborate te bereiden N -allyl- N -TBS- B allyl chloride adduct (1). Deze methode zorgt voor een meer atoom-zuinige en milieuvrien...

Boron stikstof bevattende heterocyclische verbindingen (dat wil zeggen 1,2-azaborines) hebben onlangs getrokken veel aandacht als isosteren van Arenes. Dit isosterism kan leiden tot diversificatie van bestaande structurele motieven op de chemische ruimte 2, 3, 4 uit te breiden. Azaborines hebben potentiële bruikbaarheid voor toepassing in biomedisch onderzoek 5, 6, 7, 8, vooral op het gebied van medicinale chemie waarin chemici uitvoeren synthese van bibliotheken van structureel en functioneel relevante moleculen. Belangrijk is echter, terwijl er talrijke goed ontwikkelde synthetische routes naar beschikbare areen bevattende moleculen, slechts een beperkt aantal werkwijzen voor de synthese van azaborines gerapporteerd 9, 10, </sup&gt; 11, 12, 13. Dit is voornamelijk te wijten aan een beperkt aantal mogelijkheden voor de boor bron en de lucht- en vocht- gevoelige aard van het molecuul in het vroege stadium van synthetische sequentie. In het eerste deel van dit artikel zullen we een multi-gram schaal synthese van N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3) met behulp van standaard lucht-vrije technieken te beschrijven. Deze verbinding dient als een veelzijdig tussenproduct dat verder kan worden gefunctionaliseerd om structureel complexe moleculen 14, 15. Vanaf 3, de synthese en zuivering van N -H- B-ethyl-1,2-azaborine (5) voor gebruik in eiwitbindingsonderzoeken worden beschreven. Vanwege de volatiliteit van 5, zijn efficiënte isolatie vereist een nauwkeurige controle van de reactie temperatuur, tijd, en distgevolgtrekking omstandigheden. In het tweede deel, protocollen voor eiwitexpressie en isolatie van T4 lysozym mutanten (L99A L99A en / M102Q) 17, 18, 19, 20 worden gepresenteerd, gevolgd door kristallisatie eiwit en bereiding van eiwit-ligand complexen kristal. T4 lysozym mutanten L99A en L99A / M102Q werden gekozen als biologische modelsystemen voor de waterstofbruggen vermogen van NH bevatten azaborine moleculen 17 te onderzoeken. Met behulp van een standaard moleculair biologische protocol wordt het eiwit tot expressie gebracht in Escherichia coli RR1 stam en geïnduceerd met isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Eiwitzuivering wordt uitgevoerd met kolomchromatografie ionenuitwisseling. Eiwit kristallisatie wordt uitgevoerd met sterk geconcentreerde gezuiverde eiwitoplossing (&gt; 95% zuiverheid volgens gelelektroforese) met de hangendedruppel dampdiffusie methode. Vanwege de gevoeligheid van liganden van deze studie zuurstof, zijn de proteïne-ligand complexen bereid onder lucht-vrije omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>Tetrahydrofuran (THF), remmervrij, voor HPLC, &ge;99,9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether (Et2O), voor HPLC, &ge;99,9%, remmervrij</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Methyleendichloride&nbsp; (CH2Cl2), (Gestabiliseerd/Gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentaan, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Calciumhydride (CaH2), reagentiakwaliteit, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Pyrofoor</td></tr><tr><td>Palladium op geactiveerde koolstof (Pd/C), 10 wt% Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M boortrichloride-oplossing in hexaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>Zeer giftig/Pyrofoor</td></tr><tr><td>Triethylamine, &ge;99,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st generatie katalysator&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol, watervrij, 99,8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>Ethyllithium-oplossing, 0,5&nbsp;M in benzeen/cyclohexaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td><td>Zeer giftig/ Pyrofoor</td></tr><tr><td>HCl-oplossing, 2,0 M in Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutaan, watervrij, &ge;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani en Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 lysozym WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 lysozym-mutant (S38D L99A M102Q N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline-natriumzout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl-&beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch watervrij</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch watervrij</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Corrosief</td></tr><tr><td>Thermo scientific pierce DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp;Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp;Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxyethyldisulfide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratone&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC Dialysis Membrane Tubing 12.000 tot 14.000 Dalton MWCO&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>cryogene buis gevormd tot een lus</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>cryogene pincet</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>Elektronendichtheidsbeelden worden gegenereerd vanuit de software</td></tr></tbody></table>

synthese van 1,2-azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met t4 lysozym mutanten

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

We beschrijven een algemene synthese van 1,2-azaborinden met behulp van standaard luchtvrije technieken en de bereiding van eiwitcomplexen met T4 lysozym mutanten door middel van dampverspreiding. Zuurstof- en vochtgevoelige verbindingen worden bereid en geïsoleerd onder een inerte atmosfeer (N2) met behulp van een vacuümgas-manifold of een handschoenenkast. Als voorbeeld van azaborind-synthese, demonstreren we de synthese en zuivering van de vluchtige N-H-B-ethyl-1,2-azaborind via een vijf-stapssequentie die destillatie en kolomchromatografie omvat voor de isolatie van producten. T4 lysozym mutanten L99A en L99A/M102Q worden geëxpresseerd met Escherichia coli RR1-stam. Standaardprotocollen voor chemische cellysis gevolgd door zuivering met behulp van een carboxymethyl ionenuitwisselingskolom leveren eiwit van voldoende hoge zuiverheid voor kristallisatie. Eiwitkristallisatie wordt uitgevoerd in verschillende concentraties van precipitant bij verschillende pH-bereiken met behulp van de hangende druppel dampverspreidingsmethode. Complexbereiding met de kleine moleculen wordt uitgevoerd door de dampverspreidingsmethode onder een inerte atmosfeer. Röntgendiffractie-analyse van het kristalcomplex levert ondubbelzinnig structureel bewijs van bindingsinteracties tussen de eiwitbindingsplaats en 1,2-azaborinden.

Het schema syntheseweg voor 1,2-azaborines wordt weergegeven in figuur 1. Dit protocol is van toepassing op de synthese van vijf verschillende boor-stikstof bevattende moleculen. Figuur 2 11 B NMR-spectra gemeten tijdens stap 1,3 om de vorming van het gewenste product (3) te controleren. Eiwitzuivering werd uitgevoerd door het gebruik van lage-druk chromatografie systeem en een representatief chromatogram wordt getoond in <str...

Een protocol voor de synthese van 1,2-azaborines en de bereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym mutanten wordt gepresenteerd.

Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Het algemene doel van dit protocol is om een algemene methode te beschrijven voor de synthese van 1, 2-azaborinen en de potentiële toepassing hiervan in biomedisch onderzoek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zekere synthese biedt van 1, 2-azaborineverbindingen, welke samensmeltende boorhoudende isosteren zijn van het alomtegenwoordige benzeenmotief. De beschreven precursor kan verder worden gefunctionaliseerd tot potentieel complexere moleculen.De bereiding van proteïnecomplexen met 1, 2-azaborine zal inzicht verschaffen in toekomstige toepassingen binnen biomedisch onderzoek. Bereid ter start van deze procedure het ringgesloten product voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 14 gram palladium op koolstof toe aan dit geprepareerde product in tolueen.Verwijder vervolgens de kolf uit de doos. Voorzie de kolf van een in de oven gedroogde 24/40 refluxcondensor die is gespoeld met stikstof en is aangesloten op gekoeld water. Plaats de kolf in een oliebad en verhit de reactie onder roering tot een krachtige reflux bij 135 °C.Houd de reactie 16 uur terug op reflux. Verwijder daarna de kolf uit het oliebad om de reactie af te koelen tot kamertemperatuur. Zodra deze is afgekoeld, vervangt u de refluxcondenseur door het septum op de reactiekolf.Gebruik een spuit uitgerust met een oven-gedroogde Luer Lock-naald om een aliquot van 5 milliliter op te zuigen. Overbreng de aliquot naar een NMR-buis met schroefdop. Analyseer het monster via Boron-11 NMR.Als de reactie onvolledig is, breng dan de reactiekolf over naar een glovebox. Voeg vervolgens drie gram palladium op koolstof extra toe. Haal daarna de kolf uit de glovebox.Voorzie de kolf van een 24/40 refluxcondenseur die is gespoeld met stikstof en is voorzien van gekoeld water. Verhit de reactie met een oliebad onder roering gedurende 24 uur tot een krachtige reflux bij 135 °C. Analyseer een andere aliquot met Boron-11 NMR om te bevestigen dat de reactie volledig is.Plaats daarna de reactiekolf terug in de glovebox. Leid het reactiemengsel door een flash-chromatografiekolom gevuld met papieren tissues. Verzamel vervolgens het filtraat in een ronde kolf van één liter die is uitgerust met een roerstaafje.Was de kolom met 50 milliliters tolueen. Verwijder het vat met filtraat uit de glove box en sluit het aan op een vacuümgasmanifest dat is uitgerust met een stikstoflijn. Plaats een waterbad onder de kolf en een dewarkolf met vloeibare stikstof om het oplosmiddel op te vangen.Open de hogevacuümklep om alle vluchtige stoffen uit het filtraat te verwijderen. Plaats het reactiemengsel vervolgens terug in de glovebox. Breng het mengsel over in een in de oven gedroogde 24/40 250 milliliter rondbodemkolf met een roerstaafje.Spoel het resterende reactiemengsel uit met dichloormethaan en breng dit over in de kolf. Sluit de kolf af met een septum. Verplaats de kolf van de glovebox naar de vacuümm manifold en sluit deze aan.Open de hogevacuümklep om het resterende oplosmiddel te verwijderen. Verwijder vervolgens snel het septum en voeg calciumhydride toe met een scoopula. Sluit de rondbodige kolf aan op de destillatieopstelling zoals beschreven in het tekstprotocol en stel de temperatuur van het oliebad in op 100 °C.Nadat de distillatie is voltooid, verwijdert u de warmtebron en laat u de apparatuur afkoelen tot kamertemperatuur. Zet de afgekoelde apparatuur opnieuw onder druk met stikstof en sluit de plugkraan op de luchtvrije opslagkolf stevig. Nadat het geïsoleerde product vanuit de kolf naar een vial is overgebracht in een glovebox, bewaart u de vial in de vriezer van de glovebox.Breng na het zuiveren van het eiwit de gezuiverde oplossing over in dialysemembraanbuisjes. Plaats de dialysebuisjes in een bak met een vier liter oplossing van 100 millimolair natriumfosfaat, 550 millimolair natriumchloride en 0,2% natriumazide. Roer dit gedurende de nacht bij vier graden celsius.Voeg de volgende dag 2-mercaptoethanol toe aan het gedialyseerde monster, zodanig dat de uiteindelijke concentratie vijf millimolair is. Gebruik vervolgens een centrifugale concentrator om de oplossing te concentreren tot 40 mg/mL. Centrifugeer het monster op 5.000 RPM bij zes graden celsius en verwijder na concentratie eventueel precipitaat.Stel vervolgens in een plaat met 24 wells verschillende condities in met de reservoir-oplossing, zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik vet voor een goede afdichting door dit op de rand van elke well aan te brengen. Meng vijf µL van de geconcentreerde eiwitoplossing met vijf µL reservoir-oplossing op een gesiliconiseerd glazen dekglasje.Plaats het dekglas ondersteboven over de wells die de reservoirvloeistof bevatten. Bewaar de plaat bij 4 degrees celsius voor kristalgroei. Neem de gegroeide kristallen op met een lus van cryogene buisjes en plaats deze in een 6 milliliter microcentrifugebuisje.Voeg 50 µL moederloog toe. Plaats de buis vervolgens in een glovebox. Breng vijf µL van het geprepareerde azaborine-ligand aan aan de binnenzijde van de snap-dop van de buis.Sluit de buis af en bewaar deze gedurende twee tot zeven dagen in een koelkast in de glove box voor equilibratie via dampdiffusie. Plaats daarna een druppel N Paratone op een glazen objectglas. Breng met een micropipet een kristal over naar het objectglas.Gebruik vervolgens een lus van cryogene buisjes om het kristal op te pakken en te verplaatsen van de waterige oplossing naar de N Paratone. Dompel het kristal, beschermd met N Paratone, in een dewarkolf met vloeibare stikstof. Monteer het flash-gefroren kristal met behulp van cryogene tangen op de lus.Analyse vervolgens de verzamelde kristalgegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt een gemodificeerde synthese van 1, 2-azaborinen gepresenteerd op basis van eerder gerapporteerde methoden. Tri-allel borine wordt gebruikt om N-allel NTBSB-allel chloride-adduct voor te bereiden.Een 'one pot' tweestapssequentie wordt toegepast voor de synthese van NTBS BCl 1, 2-azaborine, wat resulteert in een hogere geïsoleerde opbrengst dan bij eerdere methoden. De synthese van N-H-B-ethyl-1, 2-azaborine wordt in twee stappen gerealiseerd, waarbij ethyllithium wordt gebruikt in plaats van het chroomcomplex dat in eerder gerapporteerde methoden werd gebruikt. Het eiwit wordt gezuiverd met behulp van een lagedrukchromatografiesysteem.Een chromatogram uitgevoerd bij 280 nanometer vertoont een piek die consistent is met de T4 Lysozym-mutant, L99am102q. Het eiwit wordt vervolgens gekristalliseerd en gecomplexeerd met liganden. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de synthese van azaborine luchtvrije condities vereist, zoals een glovebox en een vacuümgasmanifold, om decompositie van verbindingen te voorkomen.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor het verkennen van de unieke chemische en fysische eigenschappen van azaborinen in vergelijking met koolstofhoudende aromaten in klassieke biologische pockets voor oppervlakteregeneratie.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker...

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

Een protocol voor het diastereoselectieve een-pot bereiding van cis - N-Ts-iodoaziridines wordt beschreven. Het produceren van diiodomethyllithium, behalve N-Ts aldiminen en cyclisatie van de amino gem-jodide gemiddelde tot iodoaziridines wordt aangetoond. Ook inbegrepen is een protocol om de meest geschikte stationaire fase voor de zuivering snel en kwantitatief beoordelen door chromatografie.

Synthese en zuivering van Iodoaziridines betrekken Kwantitatieve Selectie van de optimale stationaire fase voor chromatografie

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

Bicyclische aziridinium ionen zoals 1-azoniabicyclo [4.1.0] heptaan tosylate werden gegenereerd op basis van 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] aziridine, die werd gebruikt voor de bereiding van gesubstitueerde piperidines en azepanes via regio- en stereospecific ring-expansie met verschillende nucleofielen. Dit zeer efficiënt protocol konden we bereiden gevarieerde azaheterocycles met inbegrip van natuurlijke producten zoals fagomine, analoog febrifugine en balanol.

Voorbereiding op stabiele bicyclische Aziridinium ionen en hun Ring-Opening voor de synthese van Azaheterocycles

3-aroyl-N-hydroxy-5-nitroindoles werden gesynthetiseerd door cycloadditie van 4-nitronitrosobenzeen met een geconjugeerde Terminal alkynon in een één-stap thermische procedure. De bereiding van nitrosoareen en van de alkynonen werd adequaat gerapporteerd en respectievelijk via oxidatie procedures op het overeenkomstige aniline en op de alkynol.

Een directe, regioselectieve en Atoom-economische synthese van 3-Aroyl-N-hydroxy-5-nitroindoles door cycloadditie van 4-Nitronitrosobenzeen met Alkynonen

In deze studie bereiden we zowel enantiomeren van aziridine-2-carboxylaat, die worden gebruikt in de asymmetrische synthese van alkaloïden, waaronder biemamide B en D, als (-)-epiallo-isomuscarine.

Bereiding van enantiopure niet-geactiveerde aziridines en synthese van biemamide B, D en epiallo-isomuscarine

Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.

Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn

Aaneengesloten bisaziridines die niet-geactiveerde en geactiveerde aziridines bevatten, werden gesynthetiseerd door asymmetrische organokatalytische aziridinaties en vervolgens onderworpen aan chemoselectieve ringopeningsreacties onder zure of basische omstandigheden. De niet-geactiveerde aziridinering opent met minder reactieve nucleofielen onder zure omstandigheden, terwijl de geactiveerde aziridinering opent met meer reactieve nucleofielen onder basische omstandigheden.

Bereiding van aaneengesloten bisaziridines voor regioselectieve ringopeningsreacties

Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren en evalueren van de antimicrobiële activiteit en cytotoxiciteit van het kationische peptide Mel4 en het peptide-nabootser RK758. Door chemische synthese, recombinante expressie en gestandaardiseerde functionele assays te integreren, biedt het een gestroomlijnde workflow voor de productie en het testen van peptiden en kleinmolecuul-imitaties.

Productie en testen van antimicrobiële peptiden en hun nabootsers

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Leer de synthese van 1,2-azaborines en de voorbereiding van eiwitcomplexen met T4 lysozym mutanten voor biomedisch onderzoek. Deze methode biedt een betrouwbare route naar boronhoudende verbindingen.

Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten

Meer video's verkennen