Name: Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer de forskoline-geïnduceerde zwellingstest om CFTR-functie te evalueren in darmorganoiden van cystische fibrose-patiënten. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde behandeling door medicijnrespons te testen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de HIT-CF-programma van de Nederlandse CF Stichting (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), het Wilhelmina Kinderziekenhuis Research Fund en CZ en Zilverenkruis / Achmea. We willen graag bedanken S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, en G. Berkers (Department of Pediatric Longziekten, Wilhelmina Kinderziekenhuis, UMC Utrecht), en RHJ Houwen (Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children&#39;s Hospital, UMC Utrecht) voor het naderen van de patiënten en het krijgen van de biopsieën voor het genereren van een CF Biobank.

<ol><li>De Boeck, K., Amaral, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+therapies+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in therapies for cystic fibrosis.</a> Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).</li>
<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+genetics%3A+from+molecular+understanding+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+disease+liability+of+variants+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene.</a> Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).</li>
<li>Zielenski, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10773783">Genotype and phenotype in cystic fibrosis.</a> Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).</li>
<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+CF+airway+epithelial+cell+function+in+vitro+by+a+CFTR+potentiator%2C+VX-770%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).</li>
<li>Van Goor, F., Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li>
<li>Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>Ramsey, B. W., Davies, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>De Boeck, K., Munck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li>
<li>Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+corrector+%28lumacaftor%29+and+a+CFTR+potentiator+%28ivacaftor%29+for+treatment+of+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+a+phe508del+CFTR+mutation%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).</li>
<li>Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1569199313001136">Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function.</a> J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).</li>
<li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li>
<li>Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).</li>
<li>Sato, T., Vries, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Stange, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1 (1), e27112(2014).</li>
<li>Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+forceps+biopsy+procedure+in+cystic+fibrosis%3A+technical+aspects+and+patients+perspective+for+clinical+trials+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility.</a> BMC gastroenterology. 13, 91(2013).</li>
<li>Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+synergy+in+rectal+organoids+carrying+S1251N%2C+G551D%2C+or+F508del+CFTR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations.</a> J Cyst Fibros. , (2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84(2016).</li>
<li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).</li>
<li>Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+a+model+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium.</a> Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).</li>
<li>Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+agonists+activate+CFTR+in+organoids+and+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis.</a> Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).</li>
<li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li>
<li>Graeber, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Current+Measurements+Detect+Activation+of+Mutant+CFTR+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+with+the+G551D+Mutation+Treated+with+Ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor.</a> Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).</li>
<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivacaftor+potentiation+of+multiple+CFTR+channels+with+gating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%3A+Official+Journal+of+the+Eur+Cyst+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).</li>
</ol>

Hans Clevers is een uitvinder op patenten voor organoïdcultuur en de Forskolin-geïnduceerde zwellingstest. Jeffrey M Beekman is een uitvinder op een patent voor de Forskolin-geïnduceerde zwellingstest. Sylvia F Boj en Robert Vries zijn in dienst bij de Stichting Hubrecht Organoid Technology (HUB), die de exclusieve licentie heeft voor de Organoid-technologie. Verder hebben de auteurs niets te onthullen.

Hier bieden we een compleet protocol voor de opwekking, expansie, invriezen en ontdooien van menselijke colorectale organoids. Terwijl we de menselijke organoïde culturen enige tijd geleden 17 hebben vastgesteld, is het soms moeilijk gebleken om de technologie in andere labs te vestigen zonder hands-on training. We verwachten dat deze protocollen een dergelijke opleiding zal vervangen. -Wnt-3A geconditioneerd medium is een van de meest cruciale reagentia om te slagen ...

CF wordt veroorzaakt door mutaties in het cystische fibrose transmembraan conductantie regulator (CFTR) gen dat een epitheliale anion kanaal codeert. CF treft ongeveer 85.000 mensen wereldwijd 1. Meer dan 2.000 CFTR mutaties geïdentificeerd ( <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ). Deze verscheidenheid verklaart deels een breed spectrum van de ziekte waargenomen fenotypes ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 2, 3. Zes klassen van CFTR mutaties worden gedefinieerd op basis van hun effect op CFTR proteïne expressie en functie: (I) geen synthese, (II) verminderde handel, (III) defect kanaal gating, (IV) veranderde geleidbaarheid, (V) verlaagde gewoonlijk functionerend CFTR en (VI) verminderde celoppervlak stabiliteit 4. Hoewel het gemeenschappelijk CFTR mutaties goed bestudeerd, CFTR-functie en de relatie met de klinische status blijven poorly onderzocht op het niveau van het individu, met name voor de grote groep van zeldzame &quot;orphan&quot; mutaties ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 1, 3. Recent zijn medicijnen ontwikkeld die het CFTR-eiwit een mutatie-specifieke wijze te richten. Twee klassen van CFTR-eiwit gericht geneesmiddelen zijn klinisch gebruikt en hebben verschillende werkingsmechanismen. Potentiatoren, zoals VX-770, verbetering van de open waarschijnlijkheid van apicaal-gelokaliseerde mutant CFTR en direct werken op hun toevoeging aan cellen 5. Correctors, zoals VX-809, het herstel van de handel in endoplasmatisch reticulum-gelokaliseerde misfolded CFTR en vereisen pre-incubatie met cellen voor de effecten worden waargenomen 6. Het CFTR potentiator, VX-770, is geregistreerd bij patiënten met de G551D mutatie 7, 8, en acht andereCFTR gating mutaties, waaronder S1251N 9; samen worden deze mutaties gedragen door 5% van alle CF patiënten. Andere klinische studies hebben aangetoond dat VX-770, in combinatie met de corrector VX-809, nog aanzienlijk beperkte longfunctie en veroorzaakt een verlaging van exacerbaties bij personen die homozygoot zijn voor de mutatie F508del met 45-50% van de patiënten 10 uitgevoerd, 11. Conventioneel klinisch onderzoek naar geneesmiddelen reagerende patiënten binnen de resterende 50% van CF-patiënten te identificeren zijn kostbaar en tijdrovend en niet haalbaar voor individuen met zeer zeldzame CFTR genotypen. Novel, kosteneffectieve, gepersonaliseerde methoden zijn van cruciaal belang voor het toenemende aantal CFTR modulators om individuen die elk type CFTR mutatie passen. Tot nu toe heeft het proces opnemen van patiëntengroepen dragen specifieke CFTR mutaties leiden door studies met behulp van mutante CFTR-gen transfectie in heterologous celsystemen, gevolgd door elektrofysiologische studies in Ussing kamers 5, 6, 12. Vanwege een gebrek aan adequate CF diermodellen geneesmiddelefficiëntie studies lucht-vloeistof-interface gedifferentieerde bronchiale epitheelcellen afkomstig van CF long explantaat materialen gebruikt voor de ontwikkeling van geneesmiddelen 13, 14, 15. Echter, de beperkte beschikbaarheid van long- explantaat weefsels en de invasieve procedures om bronchiale cellen van patiënten zonder end-stadium van de ziekte te verkrijgen belemmeren de analyse van de minder voorkomende CFTR mutaties en het voorkomen van drugstests op een persoonlijke manier. Om deze beperkingen, &quot;easy access&quot; weefsels, zoals colorectale organoids, nasale luchtwegen cellen en luchtwegen cellen afkomstig van geïnduceerde pluripotente stamcellen te overwinnen, worden momenteel onderzocht voor gepersonaliseerde behandelingen met geneesmiddelen. 16, 17. Voor het colon / rectum, omvatten de kweekomstandigheden gedefinieerde groeifactoren (Epithelial Growth Factor (EGF), gastrine, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) en Noggin) in combinatie met kleine moleculen (nicotinamide, A83-01, en SB202190) in een basaal membraan matrix. Onder deze omstandigheden enkele stamcellen of kleine weefselfragmenten uitgroeien tot gesloten, blaas, 3D structuren gevormd door hoog-gepolariseerde epitheel met basale zijde naar buiten gericht. Alle celtypen verschijnen meestal in hun normale verhoudingen en posities. Organoids kan worden uitgebreid over lange periodes door middel van wekelijkse mechanische ontwrichting en re-plating. Zij genetisch en fenotypisch stabiel en kunnen worden opgeslagen, zodat langdurige expansie en biobanking 17. Ze zijn vatbaar vooralle standaard celbiologische / genetische manipulaties en analytische technieken ontwikkeld voor 2D-cellijnen 18. We hebben onlangs aangetoond dat CFTR-functie gemakkelijk kan worden gemeten colorectale organoids in een forskoline-geïnduceerde zwelling (FIS) assay 19, 20. Bij blootstelling aan forskoline (FSK) of, subsidiair, choleratoxine, organoids snel toenemen hun cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) niveaus, wat weer resulteert in de opening van het CFTR kanaal 19. Organoids van gezonde individuen of van patiënten met CFTR mutaties geassocieerd met restfunctie, zullen vervolgens opzwellen als gevolg van ionen en water transport naar de organoïde lumen, de in vitro equivalent van secretorische diarree. FIS reactie van colorectale organoids bleek eerder CFTR volledig afhankelijk te zijn, zoals aangegeven door organoids afgeleid van CFTR-null individuen eennd door het gebruik van specifieke farmacologische remmers CFTR 19. Grote vakspecifieke datasets kunnen worden afgeleid binnen enkele weken na het nemen van een biopsie. Voor de FIS-test hier in detail beschreven, organoids gekweekt uit rectale biopsies die kan worden verkregen op elke leeftijd en met slechts beperkte hinder 21. Organoids worden gepasseerd wekelijks door mechanische verbreking in enkele crypten die gemakkelijk opnieuw te verzegelen en vormen nieuwe organoids. Voor het uitvoeren van de assay FIS, ~ 30-80 van deze verstoorde kleine organoids uitgeplaat in elk putje van een 96-wells plaat 19. Op de dag van de assay worden de organoids gekleurd met calceïne groene, een fluorescerende cel-permeabel kleurstof die wordt vastgehouden binnen levende cellen, vergemakkelijkt levende imaging. Vervolgens, FSK, die intracellulaire cAMP verhoogt en daardoor activeert CFTR, wordt toegevoegd om organoïde zwelling stimuleren. Versterkers die inwerken op apicale CFTR gelijktijdig toegevoegd wet de forskoline, terwijl correctoren dat CFTR mensenhandel te herstellen worden toegevoegd 24 uur vóór de toevoeging van FSK. De organoïde zwelling wordt gekwantificeerd door een geautomatiseerde beeldanalyse dat de relatieve toename van het totale oppervlak van alle fluorescerende objecten voor elk tijdstip na forskoline toevoeging berekent. 3D organoïde zwelling biedt voor- en nadelen ten opzichte van bestaande elektrofysiologische CFTR uitlezingen in 2D cellen gekweekt luchtwegen in Ussing kamers. Een belangrijk voordeel is de doorvoer van de zwelling assay. Cellen worden gekweekt en onderzocht met behulp van een enkel type kweekmedium, en een ervaren technicus kan cultuur tot 25 organoïde monsters op een wekelijkse basis met de kwantificering ongeveer 1200 datapunten per week in 12 patiëntenmonsters. We conventioneel typt u een enkele experimentele conditie door twee- of drievoud metingen per plaat en herhaal dergelijke metingen bij drie onafhankelijke incubatietijd punten. In totaal zijn ongeveer 300-500 single organoïde structuren worden dan gemeten per experimentele conditie, waardoor zeer precieze metingen van CFTR-functie met beperkte technische variabiliteit. Dit precisie laat ons toe om duidelijke verschillen in de resterende functie en de reactie op CFTR modulators definiëren en stelt ons in staat om gemakkelijk te halen genetische achtergrond-effecten tussen patiënten dragen identieke CFTR mutaties 19, 22, 23, 24, 25. kwaliteit gegevens kunnen eenvoudig worden beoordeeld vanuit microscoop beelden. Terwijl FIS volledig CFTR-afhankelijke, is een indirecte maat resultaat voor CFTR functie, zijn uitgelezen door de koppeling van ionentransport om vloeistoftransport. Dit in tegenstelling tot directe CFTR-functie metingen in Ussing kabinet, transepitheliaal ion stromingen 26 te meten. Ussing Chambers kan de select stimulatie van apicale of basolaterale compartments (die de organoïde assay niet mogelijk); door permeabilisatie basolaterale membranen, kan de apicale CFTR-afhankelijke anion secretie selectief worden gemeten 27.

<table><tbody><tr><td>Advanced Dulbecco&rsquo;s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#12634</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#35050</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>96 well culture plate</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plate</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>6 well culture plate</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#14190-094</td><td>bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagles Medium&nbsp; (DMEM) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>Voor Wnt-3A Conditioned Medium Productie. Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS LOT#11113</td><td>Voor Wnt-3A Conditioned Medium Productie. Opgeslagen bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>L Wnt3A cell line</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>Voor Wnt-3A Conditioend Medium Productie.</td></tr><tr><td>TOP/FOP plasmids</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>#17-285</td><td>Voor het meten van Wnt-activiteit</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E2241</td><td>Voor het meten van Wnt-activiteit</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td>Voor het meten van Wnt-activiteit</td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E1910</td><td>Voor het meten van Wnt-activiteit</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#R250-01</td><td>Voor Wnt-3A Cellijn selectie</td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>N-Acetylcysteïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Human Epithelial Growth Factor (hEGF)</td><td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Gastrine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)</td><td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Human R-spondin 3 (hRspo-3)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Vancomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#861987- 250mg</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#15710-049</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>bewaard bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>TryplE Express&nbsp;</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12605-010</td><td>voor het trypsiniseren van organoïden voor bevriezing</td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12648010</td><td>voor bevriezing</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Forskoline</td><td>R&amp;D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>bewaard bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>bewaard bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>bewaard bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Naam van Reagens/Materiaal</td><td>Solvent</td><td>Stockconcentratie</td><td>Eindconcentratie</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td></td><td>10K U/ml 10K &micro;g/ml</td><td>100 U/ml 100 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml&nbsp;</td><td>125 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-Acetylcysteïne</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Human Epithelial Growth Factor (hEGF)</td><td>DPBS 0.1% BSA</td><td>0.5 mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Gastrine</td><td>DPBS</td><td>100 &micro;M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)&nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)

forskoline-geïnduceerde zwelling in intestinal organoids: an<em&gt; in vitro</em&gt; assay voor het beoordelen van de drug response in patiënten met cystische fibrose

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recent ontwikkelde geneesmiddelen die de CFTR-transmembraanconductantieregulator (CFTR) moduleren, corrigeren de oppervlakte-expressie en/of functie van het mutante CFTR-kanaal bij personen met cystische fibrose (CF). Identificatie van personen die kunnen profiteren van deze geneesmiddelen is een uitdaging vanwege de uitgebreide heterogeniteit van CFTR-mutaties, evenals andere onbekende factoren die bijdragen aan de individuele geneesmiddelwerkzaamheid. Hier beschrijven we een eenvoudige en relatief snelle test voor het meten van individuele CFTR-functie en respons op CFTR-modulatoren in vitro. Driedimensionale (3D) epitheliale organoïden worden gekweekt uit rectale biopten in standaard organoïde medium. Eenmaal gevestigd, kunnen de organoïden worden gebiobankt voor toekomstige analyse. Voor de test worden 30-80 organoïden gezaaid in 96-well platen in basement membraanmatrix en vervolgens blootgesteld aan geneesmiddelen. Een dag later worden de organoïden gekleurd met calcein groen, en forskoline-geïnduceerde zwelling wordt gemonitord door confocale live cel microscopie bij 37 °C. Forskoline-geïnduceerde zwelling is volledig CFTR-afhankelijk en is voldoende gevoelig en nauwkeurig om onderscheid mogelijk te maken tussen de geneesmiddelresponsen van individuen met verschillende en zelfs identieke CFTR mutaties. In vitro zwelresponsen correleren met de klinische respons op therapie. Deze test biedt een kosteneffectieve aanpak voor de identificatie van geneesmiddelresponsieve individuen, onafhankelijk van hun CFTR-mutaties. Het kan ook instrumenteel zijn in de ontwikkeling van toekomstige CFTR-modulatoren.

Figuur 1A toont een representatief verse isolatie van crypten ingesloten op BMM. De crypten zijn afkomstig uit een colorectale biopsie van een CF onderwerp. Gewoonlijk wordt een organoïde gegenereerd uit elke crypt (Figuur 1 A - C). Door het disfunctioneren van het CFTR meeste colon CF organoids niet blaas, maar zijn compact en met uitsteeksels en oculaties (Figuur 2A - 2B). Echter, sommige CF organoïde ...

Dit protocol beschrijft een assay voor het meten van CFTR-functie en CFTR-modulatorreacties in gekweekt weefsel van personen met cystische fibrose (CF). Biopsie-afgeleide intestinale organoïden zwellen op een cAMP-gestuurde manier, een reactie die defect (of sterk verminderd) is in CF-organoïden en kan worden hersteld door blootstelling aan CFTR-modulatoren.

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Het algemene doel van deze procedure is om de individuele CFTR-functie te beoordelen en de effectiviteit van CFTR-modulerende behandelingen te bepalen met behulp van een forskoline-geïnduceerde zwelling, of FIS-assay, in intestinale organoïden die zijn gegenereerd van patiënten met Cystische Fibrose. Deze methode beantwoordt kernvragen binnen het vakgebied van Cystische Fibrose. In het bijzonder helpt het bij de identificatie van patiënten die op lange termijn baat kunnen hebben bij bestaande of experimentele geneesmiddelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat gemakkelijk toegankelijk weefsel kan worden gebruikt om organoïden te genereren van elke CF-patiënt, ongeacht de leeftijd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de orthotherapie van Cystische Fibrose en voorzien in een dringende huidige behoefte om de effectiviteit van geneesmiddelen op een kosteneffectieve en individuele manier te testen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Marvin Statia van Hubrecht Organoid Technology en Annelot Vonk van de Jeffrey Beekman-groep.Voor het verkrijgen van optimale gegevens uit de forskoline-geïnduceerde zwellingstest is het essentieel om te werken met e

forskolin-induced-swelling-intestinal-organoids-an-vitro-assay-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

Hier beschrijven we een methode voor het genereren van driedimensionale sferoïde culturen van menselijke nasale epitheliale cellen. Spheroïden worden dan gestimuleerd naar station Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR)-afhankelijk van de ion en vloeistof secretie, kwantificeren van de verandering in de sferoïde luminal grootte als een proxy voor CFTR-functie.

Generatie van menselijke nasale epitheliale cel spheroïden voor geïndividualiseerde Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator studie

Een gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd om een in vitro organoïde model van menselijke neusepitheelcellen te beschrijven. Het protocol heeft opties voor metingen die standaard laboratoriumapparatuur vereisen, met extra mogelijkheden voor gespecialiseerde apparatuur en software.

Cultuur en beeldvorming van menselijke nasale epitheliale organoïden

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

Hier presenteren we een protocol dat de cultuur van canine intestinale organoïden beschrijft in een tweekamerig, permeabel ondersteuningssysteem. Organoïde zaaien in de doorlatende steunen, het onderhoud van de monolaag en de daaropvolgende experimenten met de permeabiliteit van geneesmiddelen worden beschreven.

Canine intestinale organoïden in een tweekamer permeabel ondersteuningssysteem

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

Dit protocol beschrijft rectale organoïde morfologie analyse (ROMA), een nieuwe diagnostische test voor cystic fibrosis (CF). Morfologische kenmerken, namelijk de rondheid (circulariteitsindex, CI) en de aanwezigheid van een lumen (intensiteitsverhouding, IR), zijn een maat voor de CFTR-functie. Analyse van 189 proefpersonen toonde perfecte discriminatie tussen CF en niet-CF.

Rectale organoïde morfologie analyse (ROMA): een diagnostische test bij cystische fibrose

Organoïde-fibroblast co-culturen bieden een model om de in vivo stamcelniche te bestuderen. Hier wordt een protocol voor slokdarmorganoïde-fibroblast co-culturen beschreven. Bovendien wordt beeldvorming van de hele montage gebruikt om de fibroblast-organoïde interactie te visualiseren.

Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Hier presenteren we een protocol om darmorganoïden van ratten te genereren en deze te gebruiken in verschillende stroomafwaartse toepassingen. Ratten zijn vaak een geprefereerd preklinisch model, en het robuuste intestinale organoïdesysteem voorziet in de behoefte aan een in vitro systeem om in vivo studies te begeleiden.

Generatie en manipulatie van darmorganoïden van ratten

Dit protocol heeft tot doel biofunctionele zelfassemblerende peptiden te evalueren voor celadhesie, organoïde morfologie en genexpressie door immunokleuring. We zullen een colorectale kankercellijn gebruiken om een kosteneffectieve manier te bieden om organoïden te verkrijgen voor intensieve tests.

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Deze studie schetst een protocol voor het genereren van 2D-monolagen van varkensorganoïden afkomstig van de dunne en dikke darm. De groei van deze monolagen wordt gekenmerkt door toenemende TEER-waarden, wat wijst op een robuuste epitheliale integriteit. Bovendien vertonen deze monolagen fysiologische secretoire reacties in Ussing-kamerexperimenten na de toepassing van forskolin.

Tweedimensionale darmorganoïden van varkens die de fysiologische eigenschappen van de inheemse darm weerspiegelen

Leer de forskoline-geïnduceerde zwellingstest om CFTR-functie te evalueren in darmorganoiden van cystische fibrose-patiënten. Deze methode ondersteunt gepersonaliseerde behandeling door medicijnrespons te testen.

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose (Video) | JoVE Journal

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An

Meer video's verkennen