Name: Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer de isolatie van intacte eilandjes van Langerhans uit neonatale muizenalvleesklieren met behulp van collageenasedigestie en handmatige selectie. Deze methode levert 20-80 eilandjes per alvleesklier voor insulinestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van NIDDK (DK065949 voor GG). We danken Dr. Brenda M. Jarvis en Jeff Duryea Jr. voor het lezen van het manuscript.

Dierlijk gebruik volgt de in protocol M procedures / 11/181 van de Vanderbilt Institutional Animal Care en gebruik Comite voor Gu goedgekeurd. CD1 of CBA / Bl6 muizen werden gekocht bij commerciële leveranciers en in de Vanderbilt dier faciliteit gekruist met pasgeboren muizen te verkrijgen. 1. Bereiding van Muizen, Stock Solutions en Equipment <ol><li> Voor de muis kruis: het opzetten van een muis kruis en noteer de inpluggen data om de experimentele planning te helpen. CD1 muizen meestal bevallen rond dag 19 na de paring. Gebruik CD1 of CBA / Bl6 kruist om CD1 of CBA / Bl6 pasgeborenen te verkrijgen, respectievelijk. Kruisingen tussen de twee lijnen te gebruiken CD1 vrouwtjes en CBA / Bl6 mannetjes. </li><li> Voor de collagenase voorraad: weeg 200 mg collagenase type IV met een hoge precisie balans. Over te dragen aan een 50 ml centrifugebuis. Los op in 40 ml HBSS met Ca2 + / Mg2 + (1,26 en 0,5 mM, respectievelijk) een 5 mg / ml voorraadoplossing te maken. <ol><li> Laat collagenase aanontbinden gedurende ~ 30 min met zacht schudden. Aliquot en bewaar de oplossing bevroren -20 ° C als voorraad, die actief blijft gedurende ten minste één jaar. </li></ol></li><li> Autoclaaf meerdere paren pincetten, scharen en P20 tips steriliseren dissectie en eilandje plukken. </li><li> Voor de 1 M glucose voorraad: weeg 9 g glucose in een 50 ml centrifugebuis, voeg 50 ml RPMI 1640 medium met glucose lossen. Laat van 4 ° C tot gebruik, maar niet meer dan 6 maanden. </li></ol> 2. Werken Solutions LET OP: De dag van het eilandje isolatie, de voorbereiding van de volgende reagentia. <ol><li> Voor het type collagenase IV werkende oplossing: dooi en verdun collagenase voorraad op ijs. Verdeel 0,15 ml bouillon in elk 1,7 ml microfugebuis. Voeg 1,35 ml HBSS met Ca 2+ / Mg 2+. Keer de buis 5 keer. Laat op ijs gedurende 15 min. <ol><li> Spin op hoge snelheid gedurende 3 minuten in een microcentrifuge. Transfer supernatant naar een nieuwe buis. Laat op ijs tot gebruik. Gooi de buis met onoplosbare puin. </li></ol></li><li> Voor de volledige RPMI 1640 media: voeg 2,5 ml 1 M glucose, 50 ml hitte-geïnactiveerd FBS en 5 ml 100x Pen-Strep voorraad in 500 ml RPMI 1640 media. Laat op ijs tot gebruik. </li></ol> 3. Pancreas Isolatie en de spijsvertering <ol><li> Euthanaseren pasgeborenen met isofluraan, gevolgd door onthoofding volgens de goedgekeurde protocollen. </li><li> Leg de muis met zijn buik naar boven. Spray met 70% ethanol voor sterilisatie. </li><li> Til het beenvlies met een pincet en snijd de huid en spierlagen lengterichting langs de middellijn met een schaar, uit het genitale gebied de ribbenkast. Dit opent de buikholte om alle interne organen bloot te leggen. </li><li> Transfer alle inwendige organen een 100 cm schotel met een pincet. Zoek de pancreas, hetgeen een verspreide orgel met een dorsale gedeelte dat vast aan de maag en milt en ventrale gedeelte dat vast aan de twaalfvingerige darm 11. </li&gt; <li> Voeg HBSS in de schaal om de organen onder te dompelen. In oplossing, de pancreas weefsels niet meer vast aan de twaalfvingerige darm, maag en milt. Het is gemakkelijk herkenbaar onder een dissectie scope vanwege zijn typische witte kleur. Gebruik een pincet om weg te komen uit de omliggende weefsel en de overdracht schil de pancreas weefsel om een ​​nieuwe 60 mm schotel met HBSS. </li><li> Snijd elke alvleesklier met een schaar in stukken kleiner dan 5 mm tegenover elke dimensies. Verwijzing naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Tot vijf pancreata (jonger dan P7) worden gedigereerd in een buis. Voor P8-P16 muizen, gebruiken één buis per alvleesklier. </li><li> Voeg 0,5-1 ml collagenase werkende oplossing aan elke buis (0,2 ml per P1-P7 pancreas Gebruik 0,5 ml per P8-P16 pancreas.). Laat de buis in een 37 ° C incubator gedurende maximaal 15 minuten. Omkeren van de buis twee keer per min. </li><li> Na ~ 5 min, tikt u op de buis naar de vertering status van de pancreas weefsel te controleren. Ga door het verteringsproces tot het grootste deel van de pancreasweefsel verschijnt als gefragmenteerd cel clusters, met een diameter van &lt;2 mm. Het lysaat wordt troebel, wat te wijten is aan normale acinaire cel autolyse verschijnen. </li></ol> 4. Lysate Wassen <ol><li> Spin het lysaat bij 500 g gedurende 10 s in een microcentrifuge. Verwijder de bovendrijvende laag met een P1,000 Pipetman. De bovenstaande vloeistof moet verschijnen troebel, maar verstoken van de cel clusters. Gebruik geen aspiratie, die snel weg kunnen zuigen het weefsel fragmenten onderaan vanwege de aanwezigheid van enkele kleverige DNA. </li><li> Voeg 1 ml RPMI 1640 compleet medium. Tik op de buis voorzichtig om de gefragmenteerde lysaat mengen. Te keren op en neer 10 keer. Herhaal stap 4.1. </li><li> Herhaal stap 4.2 nog twee keer of totdat de bovenstaande blijkt duidelijk. Resuspendeer gewassen alvleesklier fragmenten in 1 ml compleet RPMI 1640 media. </li></ol> 5. Islet Isolatie Opmerking: Voor kleine aantallen pancreata, directe hand oppakken zoals hieronder (5,1) kan worden gebruikt voor eilandje isolatie. Voor grote aantallen pancreata (&gt; 6), de in 5,2 werkwijze heeft de voorkeur. <ol><li> Direct de hand-picking: <ol><li> Transfer lysaat uit stap 4.3 op een 60 mm schaal. Voeg 5 ml compleet RPMI 1640 media. Breng onder een dissectie microscoop. </li><li> Stel de helderveld verlichting op de microscoop. Pas de lichtintensiteit tot ~ 50% van het maximale vermogen. Onder deze voorwaarde, eilandjes verschijnen als lichtroze clusters, terwijl acinaire cellen zo donker onregelmatig gevormde clusters (Figuur 1A). Een vergroting van ~ 50X (het combineren van de kracht van de doelstelling en het oog stuk) wordt aanbevolen om de beste manier van visualiseren eilandjes en de pipet tip opening gelijktijdig voor het plukken bieden. </li><li> Pick-up eilandjes met een P20 pipet tip terwijl het vermijden van acinar clusters. Verdeel eilandjes-verrijkte fracties in nieuw 60 mm schaal met RPMI compleet medium (Figuur 1B). </li><li> Herhaal de hand picking-proces nog twee keer. Laat pure eilandjes in een nieuw 60mm schotel met 4 ml compleet RPMI media (figuur 1C). </li></ol></li><li> Gradiënt centrifugeren: <ol><li> Bereid een 15 ml centrifugebuis dat is voorgeladen met 2 ml polysucrose en natrium diatrizoaat met een dichtheid van 1,077 g / ml. Laat de buis op ijs tot gebruik. </li><li> Breng de suspensie van stap 4.3 op de bovenkant van de polysucrose en natrium diatrizoaat oplossing met een Pasteur pipet. Niet storen de onderste laag. Weefsels van maximaal 10 pasgeboren of 2 P17 pancreata kan worden geladen in elke 15 ml buis. </li><li> Spin de buis op ~ 600 xg in een swing rotor gedurende 15 min bij 4 ° C. Gebruik rem-off instellingen. </li><li> Na centrifugeren overdracht van de media en de interfase lagen (merk op dat onder ideale bedrijfsomstandigheden, wordt de eilandjes worden in de interfase tussen de polysucrose en kweekmedia na centrifugeren) in een nieuwe 15 ml buis. Voeg 10 ml media, meng grondig, maar voorzichtig. </li><li> Spin down the-eilandje verrijkte fractiebij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het wassen media. Herhaal het wassen nog een keer met een complete RPMI media. Resuspendeer pellets in 4 ml media, die meestal eilandjes en leidingen (figuur 1D) bevat. </li><li> Hand-pick de eilandjes, zoals beschreven in paragraaf 5.1. </li></ol></li></ol> 6. GSIS Testen in geïsoleerde eilandjes <ol><li> Incubeer de eilandjes uit stap 5.1.4 in volledige RPMI media 2 uur in een 37 ° C weefselkweek incubator. </li><li> Gebruik een pipet om RPMI verwijderen onder een dissectie microscoop. Voeg 3 ml KRB oplossing met 2,8 mM glucose op de plaat 3. Swirl 10 keer om de eilandjes te wassen. Verwijder KRB oplossingen. <ol><li> Herhaal het wasproces keer. Incubeer de eilandjes met 3 ml KRB oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator. </li></ol></li><li> Aliquot 1 mL KRB in elk putje van een 12-wells plaat. Pre-warm de KRB voorraad en de plaat tot 37 ° C in een incubator. </li><li> Was de eilandjes tweemaal met voorverwarmd KRB zoals in 6.2. Transfer 10 eilandjes aan elk putje van de voorverwarmde platen. Incubeer in een 37 ° C incubator. </li><li> Na 45 minuten intrekken 50 pl supernatant. Bevat de insulineoplossing afgescheiden onder basale glucose. </li><li> Voeg 32 ul 500 mM glucose. Swirl de plaat 20 keer om de oplossing te mengen. Incubeer in een 37 ° C incubator. Swirl de plaat 5 maal om de 5 min. </li><li> Na 45 min, in te trekken 50 ul supernatant. Dit is de insuline afgescheiden onder hoge glucose. </li><li> Breng alle eilandjes naar een 1,5 ml buis. Bevriezen in -20 ° C gedurende 30 minuten. Ontdooien bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Herhaal het invriezen en ontdooien proces. </li><li> Voeg 0,5 ml 70% ethanol met 20 mM HCl. Laat &#39;s nachts. Dit is de insuline in eilandjes. </li><li> Gebruik conventionele ELISA voor insuline niveaus te testen, eerder 3 beschreven. </li></ol>

<ol><li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+%28Bayl+Univ+Med+Cent%29%22%5BJournal%5D)">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li>
<li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes%3A+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li>
<li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li>
<li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li>
<li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li>
<li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li>
<li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li>
<li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li>
<li>Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445(2015).</li>
<li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+J+%22Source+Book+of+Enzymes%2C+Source+Book+of+Enzymes%22">Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes</a>. , C.R.C. Press. (1997).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben voor het beschreven werk.

Hier geven we een stap-voor-stap protocol eilandje isolatie van pancreata die te klein om conventionele perfusie. Naar verwachting eilandjes klaar voor eilandjes gebaseerde studies zoals beta-cel zuivering genexpressie analyse eilandje beta-cel maturatie, proliferatie, cel-stress responsen, celoverleving, metabolisme en functioneel beheer GSIS, enz verkregen. Dit zal, naar ons beste weten is de eerste gedetailleerde visuele protocol dat nieuwe onderzoekers gidsen voor eilandje isolatie uit te voeren vanaf neona...

Het isoleren van pure pancreaseilandjes is essentieel voor het meten van glucose-gestimulante insulinesecretie (GSIS) van bètacellen en voor eilandjetransplantatie van lijkschoners 1-3. Het is ook noodzakelijk om endocrijn genexpressie in eilandjecellen vast te stellen 4, 5. Voor dit doel zijn gedetailleerde protocollen opgesteld om de isolatie van pancreaseilandjes uit grote alvleesklieren mogelijk te maken (6 en referenties daarin). Deze methoden zijn gebaseerd op enzymatische perfusie om acinar-weefsel los te koppelen van eilandjeweefsel, gekoppeld aan gradiëntscheiding en handmatig plukken. Aldus kan eilandje-isolatie uit grote pancreassen gemakkelijk worden uitgevoerd in de meeste laboratoria. Aan de andere kant bestaat er geen gedetailleerd stapsgewijs protocol om eilandjes te isoleren uit pancreassen die te klein zijn om te perfunderen.
Het bestuderen van genexpressie en functie van neonatale eilandjes is belangrijk. Neonatale eilandjes hebben andere eigenschappen dan volwassenen wat betreft insulinesecretie en proliferatievermogen 7, 8. Echter, het isoleren van eilandjes van pasgeboren dieren, vooral muizen, is een uitdaging vanwege de kleine omvang van de pasgeboren pancreas. De grootte verhindert het gebruikelijke perfusieproces wanneer collagenase wordt geïnjecteerd via de pancreasgang. Inderdaad, verschillende papers hebben studies gepresenteerd langs deze lijnen, met enzym- of niet-enzymgeassisteerde isolatieprocedures 7, 9, 10. Echter, een gedetailleerde beschrijving van het eilandje-isolatieproces met visuele hulp ontbreekt 7, 9, waardoor het voor de meeste onderzoekers een uitdaging is om soortgelijke studies uit te voeren.
We hebben verschillende verschillende omstandigheden onderzocht die hoge kwaliteit eilandjes uit neonatale muizen opleveren. Hier presenteren we een protocol dat onderzoekers zal helpen de belangrijkste details in het eilandje-isolatieproces te leren. Dit protocol is toepasbaar op muizenpancreas tot twee weken oud, waarna perfusie kan worden uitgevoerd voor routinematige eilandje-isolatie. Eilandjes kunnen direct worden gebruikt voor insulinesecretie en genexpressie-assays.

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS met Ca2+/Mg2+</td><td>Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td><td>MT21020CV</td><td>Als HBSS zonder Ca2+/Mg2+ wordt verkregen, kunnen CaCl2 en MgSO4 worden toegevoegd tot respectievelijk 1,26 en 0,5 mM.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 zonder glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>Glucose moet worden toegevoegd tot specifieke niveaus om niet te interfereren met het daaropvolgende eilandgebruik.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polysucrose en natriumdiatrizoaat-oplossing</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Duitsland</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>Leica, Wetzlar, Duitsland</td><td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15-mL centrifugebuizen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-mL centrifugebuizen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Precisiebalans</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>Microfugebuizen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm schaal</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm schaal</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>12-wells platen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>CD1 muizen</td><td>Charles River Laboratories, Wilmington, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory, Farmington, CT&nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>The Jackson Laboratory, Farmington, CT&nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

effectieve isolatie van functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

-Perfusie gebaseerde eilandje-isolatie protocollen van grote zoogdieren pancreata zijn goed ingeburgerd. Dergelijke protocollen worden gemakkelijk uitgevoerd in vele laboratoria vanwege de grote omvang van de ductus pancreaticus die het mogelijk maakt om collagenase injectie en daaropvolgende weefselperfusie. Daarentegen eilandje isolatie van kleine pancreata, zoals die van pasgeboren muizen is uitdaging omdat perfusie is niet gemakkelijk verkrijgbaar in de kleine pancreata. Hier kunt u een gedetailleerde eenvoudige procedure die aanzienlijke aantallen eilandjes van pasgeboren muizen met visuele hulp herstelt beschrijven we. Vers ontleed gehele pancreata werden gedigereerd met 0,5 mg / ml collagenase IV opgelost in Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) bij 37 ° C, in microcentrifugebuizen. Buizen werden regelmatig afgeluisterd om weefsel verspreiding te helpen. Wanneer de meeste van het weefsel werd gedispergeerd kleine clusters ongeveer 1 mm, werden lysaten 3:57 maal met kweekmedium gewassen met 10% foetaal runderserum (FBS). Islet clusters,verstoken van herkenbare acinar weefsels, kan vervolgens worden teruggewonnen onder ontleden stereoscoop. Deze methode herstelt 20-80 kleine tot grote eilandjes per pancreas van pasgeboren muizen. Deze eilandjes zijn geschikt voor de meeste denkbaar downstream assays, waaronder insuline secretie, genexpressie en cultuur. Een voorbeeld van insulinesecretie assay wordt aan de isolatie te valideren. De genetische achtergrond en de mate van vertering de grootste factoren die de opbrengst. Vers gemaakte collagenase oplossing met een hoge activiteit heeft de voorkeur, aangezien het helpt bij endocriene exocriene isolatie. De aanwezigheid van kationen [calcium (Ca2 +) en magnesium (Mg2 +)] in alle oplossingen en foetaal runderserum in de was / picking media nodig zijn voor een goed rendement eilandjes met goede integriteit. Een ontleden scope met een goed contrast en vergroting zal ook helpen.

Onder optimale omstandigheden kan de onderhavige methode verkregen 20-80 eilandjes van elke kleine muis alvleesklier. Dit aantal is afhankelijk van de genetische achtergrond, leeftijd van de muizen, en de grootte van de eilandjes te vorderen. Onder de meest gebruikte, CD1 out-gefokt en C57BL / 6J raszuivere muizen produceren minder eilandjes met een kleinere omvang dan hybriden tussen CD1 en C57BL / 6 of commerciële B6CBAF1 / J muizen doen. Directe hand oppakken algemeen heeft een kleine...

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van intacte eilandjes van Langerhans uit de pancreas van neonatale muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over ontwikkeling en functie, zoals insulinesecretie, genexpressie, celoverleving en functioneel behoud.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat deze eenvoudig en ongecompliceerd is, terwijl het nieuwe onderzoekers toch in staat stelt om een aanzienlijk aantal intacte eilanden te isoleren voor downstream-studies. Begin met het bespuiten van een pasgeborene in rugligging met 70% ethanol. Gebruik vervolgens een pincet om de huid over de buik op te tillen en snijd de huid- en spierlagen longitudinaal langs de middenlijn door, van de genitaliën tot aan de ribbenkast.Breng vervolgens alle interne organen over naar een schaal van 100 centimeter en lokaliseer de pancreas; dit is een wit, verspreid orgaan met een ventraal gedeelte dat aan het duodenum kleeft en een dorsaal gedeelte dat aan de maag en milt kleeft. Voeg HBSS toe aan de schaal om de organen onder te dompelen, zodat de pancreastissues niet langer aan het duodenum, de maag of de milt kleven. Gebruik vervolgens een pincet om de pancreas van het omliggende weefsel los te pellen.Breng de pancreas over naar een nieuwe schaal van 60 millimeter met HBSS en gebruik een schaar om één tot vijf pancreassen in stukjes van vijf millimeter of kleiner te snijden. Wanneer al het weefsel is fijngehakt, worden de stukjes overgebracht naar microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter en worden de collagenase-werkoplossingen aan de monsters toegevoegd. Incubeer vervolgens de weefselfragmenten bij 37 °C, waarbij de buisjes twee keer per minuut worden omgekeerd.Tik na vijf minuten tegen de buis om de status van de digestie van de stukjes te controleren. Zet de digestie nog tien minuten voort, totdat het lysaat troebel is en de meeste pancreata verschijnen als gefragmenteerde celclusters met een diameter van minder dan twee millimeter. Pellet aan het einde van de digestie het lysaat door microcentrifugatie en gebruik een p1000-pipet om voorzichtig het supernatant te verwijderen, dat troebel moet zijn maar vrij van celclusters.Voeg vervolgens één milliliter vers RPMI 16/40 compleet medium toe aan het pellet. Tik daarna voorzichtig tegen de buis om de gefragmenteerde lysaatstukjes opnieuw te suspenderen en keer de buis tien keer om. Na het centrifugeren wordt het resuspendeerde lysaat nog ten minste twee keer omgekeerd, zoals zojuist gedemonstreerd, totdat het supernatant helder is.Resuspendeer vervolgens het uiteindelijke pellet in één milliliter vers compleet medium en voeg twee milliliter polysucrose en natriumdiatrazoaat met een dichtheid van 1,077 g/ml toe aan een conische buis van 15 milliliter op ijs. Gebruik een Pasteur-pipet om het lysaat voorzichtig bovenop de gradiëntoplossing te plaatsen zonder de lagen te mengen en scheid de cellen door centrifugatie. Breng het medium en de interfaselagen die de eilandjes bevatten over in een nieuwe buis van 15 milliliter en meng de eilandjes voorzichtig maar grondig met tien milliliter vers medium voor centrifugatie.Na een tweede wasbeurt en het toevoegen van vers compleet medium, resuspendeert u het pellet met eilandjes en ducten in vier milliliter vers compleet medium. Zaai nu de eilandjes uit op een schaal van 60 millimeter en voeg vijf milliliter compleet medium toe aan de cellen. Plaats de schaal onder een dissectiemicroscoop en schakel de bright-field verlichting in, waarbij u de lichtintensiteit instelt op ongeveer 50% van het maximale vermogen.Bij een 50-voudige vergroting verschijnen de eilandjes als lichtroze clusters en de acinaire cellen als donkere, onregelmatig gevormde clusters. Oogst de individuele eilandjes met een p20 pipetpunt, waarbij u voorzichtig de acinaire clusters vermijdt, en breng de eilandjesverrijkte fracties over naar een nieuwe schaal van 60 millimeter met compleet medium. Wanneer alle eilandjes uit de oorspronkelijke schaal zijn gehaald, oogst u de eilandjes vanuit de opvangschaal in een nieuwe schaal van 60 millimeter met vier milliliters vers compleet medium nog twee keer, totdat er in de uiteindelijke opvangschaal alleen pure eilandjes aanwezig zijn.Een correcte digestie en isolatie leveren eilandjes op met gladde buitenoppervlakken. Onvoldoende digestie met collagenase kan leiden tot grote, gemakkelijk te visualiseren eilandjes die niet volledig van het acinaire weefsel gescheiden kunnen worden, waardoor de totale opbrengst aan eilandjes afneemt, ook al worden er grotere eilandjes geproduceerd. In het geval van overmatige digestie kunnen de acinaire weefsels weliswaar volledig van de eilandjes worden gescheiden, maar is de structuur van de eilandjes vatbaar voor beschadiging, wat resulteert in eilandjes met een ruw oppervlak onder de microscoop.Neonatale eilandjes die met deze methode zijn geïsoleerd, vertonen hoge basale insulinesecretieniveaus met glucose-gestimuleerde insulinesecretieprofielen die typerend zijn voor onrijpe eilandjes-bètacellen, wat suggereert dat deze isolatieprocedure de functionele eigenschappen van neonatale eilandjes grotendeels behoudt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in slechts twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om eraan te denken de collagenase vooraf te centrifugeren om onoplosbare resten te verwijderen, en om een wasbuffer te gebruiken die is aangevuld met calcium en magnesium, evenals een voorbehandelde wasbuffer om de weefseldissociatie snel te stoppen.In deze procedure kan ons experiment, zoals glucose-gestimuleerde insulinesecretie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de dynamiek van de insulinesecretie in neonatale bètacellen. Daarnaast opent deze techniek de weg voor onderzoekers in het veld van de bètacelbiologie om aanvullende assays uit te voeren, zoals genexpressie of andere metabole studies. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intacte eilandjes uit de neonatale muispancreas isoleert voor uw verdere studies.Vergeet niet dat het werken met collagenasepoeder uiterst gevaarlijk is, daarom moeten er altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en een mondmasker, bij het gebruik van dit materiaal.

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Transplantatie van geïsoleerde eilandjes is voorgesteld om een ​​potentiële behandeling voor diabetes type 1 zijn. Hier beschrijven we een methode om de eilandjes van de muis pancreata isoleren en transplantatie ze aan de subcapsulaire ruimte van de nier.

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Het aanbod van type 2 diabetes eilandjes voor onderzoek ontoereikend is. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy. Deze aanpak is een unieke locatie voor het verkrijgen van eilandjes van type 2 diabetes en klinisch afgestemd zonder diabetes in voldoende aantallen voor basis-en klinische studies.

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Een gedetailleerde beschrijving van muis eilandje isolatie wordt beschreven door de techniek van in situ pancreas ductaal infusen en perfusie van een combinatie van gezuiverd collagenase en neutrale protease.

Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Dit protocol demonstreert het isoleren van muizen eiland en zaait op een decellularized steiger. Steigergesteunde eilandjes werden getransplanteerd in het epididymale vetpaneel van streptozotocine (STZ) geïnduceerde diabetische muizen. Islets overleefden op de transplantatieplaats en reverseerde de hyperglycemische conditie.

Steiger-gesteunde transplantatie van eilanden in het epididymale vetpaneel van diabetische muizen

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Alvleesklier islet transplantatie is een manier om normoglycemia bij type 1 diabetes. Dit artikel richt zich op de transplantatie-techniek via de intraportal route om normale glucoseniveaus in diabetesmuizen te handhaven.

Intraportal transplantatie van de alvleesklier eilandjes in Mouse Model

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer de isolatie van intacte eilandjes van Langerhans uit neonatale muizenalvleesklieren met behulp van collageenasedigestie en handmatige selectie. Deze methode levert 20-80 eilandjes per alvleesklier voor insulinestudies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Meer video's verkennen