Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie
24 januari 2017
Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige methode te bieden voor het gelijktijdig meten van mitochondriale calciumopname en mitochondriaal membraanpotentiaal in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het mitochondriale veld te beantwoorden, zoals hoe mitochondriën fungeren als lokale calciumopslagplaatsen om de intracellulaire calciumconcentratie strak te reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel mitochondriale calcium als mitochondriaal membraanpotentiaal specifiek gelijktijdig in levende cellen kunnen worden gemeten zonder dat genetische manipulatie nodig is.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in calciumregulatie in mitochondriale ziektepathologie, kan deze ook worden gebruikt om andere nieuwere degeneratieve aandoeningen te bestuderen, wanneer urinale calciumregulatie cruciaal is. In deze procedure laat u de cellen groeien op cellencultuurschotels van tien centimeter of 75 vierkante centimeter kolven, in kweekmedium bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Om de cellen te oogsten, verwijdert u het medium door aspiratie en spoelt u de cellen met vijf milliliter PBS.
Verwijder daarna PBS door aspiratie. Voeg vervolgens 1,5 milliliter Trypsin EDTA toe en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 2 minuten. Tik vervolgens zachtjes op de schotel om de cellen te verwijderen.
Resuspendeer ze in vijf milliliter kweekmedium. Tel daarna de cellen met een hemocytometer. Plaat de cellen de dag voor confocale beeldvorming bij 60 tot 70 procent confluency in schotels of kamerdeksels met kamers.
Incubeer de cellen vervolgens een nacht bij 37 graden Celsius om de cellen te laten hechten en herstellen. Bereid in deze procedure de opnamekleuringsoplossing met TMRM, Fluo 4 AM en oppervlakte-actieve stof. Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen met 100 microliter PBS.
Verwijder vervolgens PBS en incubeer de cellen in 100 microliter opnamekleuringsoplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder daarna de opnamekleuringsoplossing en spoel de cellen in 100 microliter calciumvrij HBSS om overtollig Fluo 4 AM en TMRM te verwijderen. Bereid vervolgens de intracellulaire beeldvormingsoplossing met digitonine, TMRM en thapsigargine.
Verwijder vervolgens het calciumvrije HPSS en voeg 300 microliter IM-beeldvormingsoplossing toe aan de cellen. Laat de cellen gedurende tien minuten bij kamertemperatuur gelijkwaardig worden voordat u met de calciumchloridetoevoegingen gaat beeldvormen. Gebruik een lage laservermogen van ongeveer 5 procent om eventuele fotoschade aan de cellen te minimaliseren.
Gebruik de instellingen op de microscooplasers voor de excitatie- en emissiespectra van TMRM en Fluo 4 AM. Gebruik een lage laservermogen van ongeveer vijf procent met hoge versterking om schade door foto's van de cellen te minimaliseren. Stel vervolgens de microscoop in om afbeeldingen elke vijfentwintig seconden te scannen. Scan de cellen gedurende tien minuten om de basislijnmetingen voor TMRM- en Fluo 4-signalen vast te stellen.
Pauzeer vervolgens het afbeeldingsscannen en voeg 3 microliter van 40 millimolair calciumchloride-stockoplossing rechtstreeks toe aan de cellen in 300 microliter IM-beeldvormingsoplossing. Meng voorzichtig met een pipet. Wees voorzichtig bij het toevoegen van calciumoplossing aan de cellen om de schotel op de microscoopstandaard niet te verplaatsen.
Ga door met afbeeldingsscannen gedurende ongeveer vier minuten. Herhaal vervolgens calciumchloridetoevoegingen om de vier minuten totdat de gewenste TMRM- of Fluo 4-signalen zijn bereikt, meestal ongeveer acht tot tien toevoegingen. Voeg vervolgens een 1 op 100 verdunning van één millimolair FCCP direct toe aan de cellen om het inwendige membraanpotentiaal te verstoren.
Beeld de cellen vervolgens nog vijf minuten af voordat het experiment is voltooid. Zodra de beeldvorming is voltooid, bepaalt u de intensiteit van de Fluo 4- en TMRM-signalen met behulp van de beeldanalysesoftware. Om dit te doen, opent u de afbeelding, klikt u op het selectiegereedschap en selecteert u een interessegebied dat mitochondriën bevat.
Meerdere interessegebieden kunnen worden geselecteerd voor meting door Analyse, Gereedschappen, ROI-beheer te openen. Klik op Toevoegen om het geselecteerde ROI op te nemen voor intensiteitsmeting. Herhaal de vorige stappen totdat alle ROI's zijn toegevoegd aan de ROI-beheerder.
Meet de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de TMRM- en Fluo 4-signalen voor elk interessegebied door de meer multi meetfunctie te selecteren. Zorg ervoor dat Alles meten is geselecteerd en dat Eén rij per plak is gedeselecteerd. Klik vervolgens op OK om een tabel te verkrijgen van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de TMRM- en Fluo 4-signalen voor elk ROI bij elk tijdstip.
Combineer vervolgens de gegevens om de gemiddelde intensiteit en standaardafwijking voor de TMRM- en Fluo 4-signalen te berekenen. In dit experiment werden 143B-cellen vooraf geladen met Fluo 4 AM en TMRM voordat ze werden gepermeabiliseerd met digitonine. Na elke toevoeging van calciumchloride neemt het TMRM-signaal af naarmate de instroom van calciumionen in de mitochondriën het mitochondriale membraanpotentiaal verstrooit.
Hier getoond zijn de afbeeldingen van gelijktijdige metingen van membraanpotentiaal in mitochondriaal calcium. Het rode signaal geeft TMRM aan en het groene signaal geeft Fluo 4 aan. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer twee uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mitochondriale calciumniveaus en mitochondriaal membraanpotentiaal gelijktijdig kan meten op confocale microscopie met behulp van de toevoeging van exogeen calcium aan de gepermeabiliseerde cellen. Vergeet niet dat het werken met FCCP en digitonine uiterst gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van PVE moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het meten van de mitochondriale calciumopname en het membraanpotentiaal in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om te onderzoeken hoe mitochondriën intracellulaire calciumconcentraties reguleren zonder genetische manipulatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Mitochondriaal onderzoek
Achtergrond
- Mitochondriën spelen een cruciale rol bij calciumsignalering.
- Het begrijpen van de mitochondriale functie is belangrijk voor het bestuderen van diverse ziekten.
- Calciumregulatie is essentieel voor de cellulaire gezondheid.
- Huidige methoden vereisen vaak genetische manipulatie, wat hun toepasbaarheid beperkt.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het meten van mitochondriale functies.
- Om de rol van mitochondria als lokale calciumdepots te onderzoeken.
- Om onderzoek naar mitochondriale ziekten en andere degeneratieve aandoeningen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Cellen worden gekweekt in geschikte media bij 37 °C.
- Cellen worden geoogst en gewassen met PBS.
- Fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om de calciumopname en het membraanpotentiaal te meten.
- Confocale microscopie wordt ingezet voor simultane metingen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt real-time monitoring van mitochondriale calciumdynamiek mogelijk.
- Simultane meting van calcium en membraanpotentiaal wordt gerealiseerd.
- De techniek kan inzichten verschaffen in de pathologie van mitochondriale ziekten.
- Het kan worden toegepast om andere aandoeningen gerelateerd aan calciumregulatie te bestuderen.
Conclusies
- Deze methode vergroot het inzicht in mitochondriale functies in levende cellen.
- Het biedt een instrument voor het onderzoeken van de rol van mitochondriën bij gezondheid en ziekte.
- De aanpak is veelzijdig inzetbaar voor diverse onderzoekstoepassingen in de celbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt directe meting van mitochondriale calciumdynamiek en membraanpotentiaal in levende cellen mogelijk, wat cruciale gegevens levert voor targetvalidatie in pathways van mitochondriale dysfunctie. Door calcium-geïnduceerde permeabiliteitstransitie en het verlies van membraanpotentiaal te kwantificeren, ondersteunt het de mechanistische de-risking van therapeutische hypothesen met betrekking tot bio-energetisch falen. De simultane uitlezing verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid in vroege discovery door calciumflux te koppelen aan de mitochondriale gezondheid zonder genetische manipulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over mitochondriale calciumhuishouding als regulator van de cellulaire calciumhomeostase.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van mitochondriale targets in levende cellen mogelijk met behulp van fluorescente read-outs.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het identificeren van verbindingen die calcium-geïnduceerde permeabiliteitsovergang moduleren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaar voor assay: Bereidt permeabiliseerde cellen voor met Fluo-4 AM en TMRM voor kwantitatieve, simultane detectie van calciumopname en membraanpotentiaal.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van sequentiële toevoegingen van calciumchloride om dosis-responscurves te genereren voor de bepaling van de drempelwaarde voor permeabiliteitstransitie.
- Schaalbaarheid: Compatibel met confocale microscopieplatformen voor aanpassing naar multi-well platen en intensiteitsanalyse op basis van ROI.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert mitochondriale calciumoverbelasting die relevant is voor neurodegeneratie en ischemische schade.
- Translationele continuïteit: Verbindt acute calciumfluxmetingen met chronische dysfunctie in preklinische modellen van mitochondriale ziekten.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen op basis van de calciumretentiecapaciteit en de stabiliteit van het membraanpotentiaal.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-engagement tot functionele validatie, in het bijzonder voor signaalpaden die betrokken zijn bij mitochondriale calciumregulatie en oxidatieve stress.
- Discovery Biology: Test hoe verstoringen de mitochondriale calciumbuffering en de koppeling van het membraanpotentiaal beïnvloeden.
- Screening: Levert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen die vergelijking van compound-effecten op calcium-geïnduceerde depolarisatie mogelijk maken.
- Analytics: Biedt gegevens over de gemiddelde intensiteit en standaarddeviatie voor Fluo-4- en TMRM-signalen over verschillende tijdspunten en ROI's.
- Translationeel onderzoek: Verbindt acute permeabiliteitstransitie-gebeurtenissen met aanhoudend bio-energetisch falen in ziektemodellen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar assayplatform voor mitochondriale veiligheidsfarmacologie en target de-risking.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door calciuminstroom direct te correleren aan de dissipatie van het membraanpotentiaal.
- Operationele waarde: Standaardiseert de meting door ratiometrische kleurstofkoppeling en sequentiële calciumuitdaging.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door mitochondriale risico's in een vroeg stadium van lead-optimalisatie te identificeren.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van calciumretentiecapaciteit en gevoeligheid voor permeabiliteitstransitie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging, het laden van kleurstoffen en permeabilisatieprotocollen.
- Afhankelijk van confocale microscopie met passende laserinstellingen voor TMRM- en Fluo-4-excitatie/emissie.
- Vereist standaardisatie van de bereiding van calciumvrij HBSS en intracellulaire imaging-oplossingen tussen teams.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende celtypen en mitochondriale dichtheden.
- Bevat praktische beperkingen, zoals het risico op fototoxiciteit door laserblootstelling en het lekken van kleurstoffen na permeabilisatie.
