Name: Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer mitochondriale calciumopname en membraanpotentiaal meten in levende cellen met confocale microscopie. Deze methode vereist geen genetische manipulatie en helpt bij onderzoek naar mitochondriale ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr Kirstin Elgass en Dr Sarah Creed uit Monash Micro Imaging voor technische bijstand, en de Wellcome Trust en de Medical Research Council UK voor financiële steun. MMcK wordt ondersteund de Australian Research Council Future Fellowship Scheme (FT120100459), de William Buckland Foundation, The Australian Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research en Monash University. Dit werk werd ondersteund door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Regeling.

1. Bereiding van Cellen <ol><li> Kweek cellen op 10 cm celcultuurschalen of 75 cm2 kolven in kweekmedium [10 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 5% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1 x penicilline / streptomycine (P / S )] bij 37 ° C / 5% CO2. </li><li> Om cellen te oogsten, verwijder media door aspiratie, daarna wassen met 5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS). Verwijderen 1x PBS door afzuigen, voeg 1,5 ml 0,25% (w / v) Trypsine / 0,25% (w / v) ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 2 min. Tik gerecht of de kolf voorzichtig om cellen te verwijderen, dan resuspendeer in 5 ml kweekmedium. </li><li> Aantal cellen door toevoeging van 12 pi geresuspendeerde cellen op een hemocytometer. </li><li> Plaat cellen in gerechten of chambered dekglaasjes voor confocale beeldvorming. Opmerking: Deze zullen een geschikte kunststof of glazen bodem die is ontworpen voor gebruik met omgekeerde microscopen hebben. </li><li> Plaat cellen, zodat thbij ~ 80% confluentie bereikt op de dag van beeldvorming. Bijvoorbeeld ongeveer 2 x 10 4 143B osteosarcoom cellen kunnen worden uitgeplaat in een putje van een 8-well kamer dia één dag voor de beeldvorming. </li><li> Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C / 5% CO 2, zodat cellen te hechten en te herstellen. </li></ol> 2. Buffers voor TMRM en Fluo-4 Imaging <ol><li> Bereid Record Solution (RS) bevattende 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO4, 1,25 mM KH 2PO 4, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2 en 10 mM HEPES pH 7,35. Store RS in porties bij -20 ºC. </li><li> Bereid Intracellulaire Medium (IM) bevattende 6 mM NaCl, 130 mM KCI, 7,8 mM MgCl2, 1 mM KH 2PO 4, 0,4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malaat, 2 mM glutamaat, 2 mM ADP en 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM voorraadoplossingen van malaat, glutamaat en ADP afzonderlijk worden bereid, in porties verdeeld en bewaard bij -20 ° C. deze stocks kan aan de IM worden toegevoegd vlak voor gebruik. </li><li> Ca 2+ vrije Hank&#39;s gebufferde zoutoplossing (HBSS) worden verkregen vooraf bereid uit commerciële leveranciers. Add ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N &#39;, N&#39;-tetraazijnzuur (EGTA) tot een eindconcentratie van 500 uM. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 10 mM tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM) in 100% methanol. Vanuit deze voorraad, maak een werkvoorraad van 2 micrometer in gedestilleerd H 2 O. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 10 mM verapamil in 100% ethanol. </li><li> Maak een 1 mg / ml (w / v) voorraadoplossing van Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) in dimethylsulfoxide (DMSO). LET OP: Fluo-4, AM is een calcium-indicator die vertoont verhoogde fluorescentie na binding Ca 2+. Fluo-4 is een analoog van fluo-3, met de twee chloorsubstituenten vervangen door fluoratomen. Dit resulteert in verhoogde fluorescentie excitatie bij 488 nm en fluorescentie hogere signaalniveaus. DeAM estergroep resulteert in een ongeladen Fluo-4 molecuul dat celmembranen kunnen doordringen. Eenmaal in de cel, wordt de AM ester gesplitst door niet-specifieke esterasen, resulterend in een geladen vorm van Fluo-4, dat wordt gevangen in de cel. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 1 mM p-carbonyl cyanide trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% ethanol. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 25 mg / ml (w / v) digitonine in gedestilleerd H2O </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 100 uM thapsigargin in DMSO. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 40 mM calciumchloride (CaCl2) in gedestilleerd H2O </li></ol> 3. kleuring van cellen met TMRM en Fluo-4, AM <ol><li> Bereid RS kleuroplossing met 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM en 0,005% surfactant zoals Pluronic F-127 in RS. Let op: dit is een niet-ionische oppervlakteactieve polyol dat het oplossen van Fluo-4, AM vergemakkelijkt. Opmerking: 10 uM verapamil kunnen ook worden toegevoegd aan inhibit TMRM uitvoer over de plasmamembraan multidrug transporter als het wordt uitgedrukt in het celtype geanalyseerd. </li><li> Verwijder kweekmedium uit cellen met een pipet en wassen met 100 ul 1x PBS. </li><li> Verwijderen 1x PBS pipet en incubeer cellen in 250 ul RS kleuroplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. LET OP: Als het Fluo-4, AM komt in de cel, wordt de AM-ester gesplitst door cellulaire esterasen. Incuberen bij kamertemperatuur remt esterase activiteit, waardoor Fluo-4 AM naar de mitochondriën binnengaan. </li><li> Verwijder RS kleuroplossing met een pipet en was cellen in 100 ul Ca 2+ vrije HBSS om overtollig Fluo-4, AM en TMRM verwijderen. </li><li> Bereid IM imaging oplossing met 25 ug / ml (w / v) digitonine, 200 nM en 1 uM TMRM thapsigargin in IM. Opmerking: De concentratie van digitonine moet mogelijk worden aangepast dat permeabilisatie van het mitochondriale binnenmembraan kan worden ver- kregen. Dit kan empirisch worden bepaald door het bepalen van de intensiteitTMRM van het signaal bij verschillende concentraties digitonine. </li><li> Verwijder de Ca2 + vrije HBSS pipet en voeg 300 ul IM imaging oplossing voor de cellen. Laat cellen equilibreren bij kamertemperatuur gedurende 10 min. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming met CaCl2 toevoegingen. </li></ol> 4. Cell Imaging <ol><li> Plaats de schotel of chambered dekglaasje met cellen in IM imaging oplossing op een omgekeerde laser scanning confocale microscoop. </li><li> Gebruik instelling op de microscoop lasers voor de excitatie en emissie spectra van TMRM en Fluo-4. Gebruik bijvoorbeeld 543 nm He-Ne en 473 nm argon laser lijnen respectievelijk prikkelen TMRM en Fluo-4. Gebruik een lage laservermogen van ongeveer 5% aan een foto-schade aan de cellen te minimaliseren. </li><li> Stel microscoop om afbeeldingen te scannen elke 25 sec. Scan cellen voor 10 min naar basislijn metingen vast te stellen voor de TMRM en Fluo-4 signalen. NB: De Fluo-4 signaal kan zwak of niet detecteerbaar bij rustende calcium concent zijnrantsoenen. </li><li> Voeg 3 ul van 40 mM CaCl 2 voorraadoplossing direct naar cellen in 300 ul IM weergaveoplossing (een 1: 100 verdunning) en meng voorzichtig met een pipet. Pauzeer de afbeelding scannen, terwijl het toevoegen en mengen van de CaCl2 indien nodig. OPMERKING: De laatste vrije Ca2 + ionconcentratie [Ca 2,] in de IM beeldvormingsoplossing kan worden berekend met behulp van software zoals Maxchelator WEBMAXC Extended ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) of Chelator 11. Een gedetailleerde beschrijving van hoe de laatste vrije Ca 2+ ion concentratie te berekenen [Ca 2+] is beschreven in hoofdstuk 6 hieronder. </li><li> Doorgaan image scanning ongeveer 4 min, herhaal dan CaCl2 toevoegingen om de 4 min, totdat het gewenste TMRM of Fluo-4 signalen worden bereikt, meestal rond de 8 tot 10 toevoegingen. </li><li> Met behulp van een pipet, voeg een 1: 100 verdunning van 1 mM FCCP (final concentration van 10 uM) direct naar cellen ΔΨ m verdrijven. Afbeeldingscellen nog eens 5 min. Het experiment is nu voltooid. </li></ol> 5. Image Analysis <ol><li> Zodra beeldvorming is voltooid, bepaalt de intensiteit van Fluo-4 en TMRM signalen via beeldanalyse software, bijvoorbeeld ImageJ software met de Bio-indelingen plugin (download &#39;bioformats_package.jar vanaf http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / en opslaan in de &quot;C: Program Files ImageJ plugins &#39;folder). </li><li> Open de imaging-bestand (bijvoorbeeld een .oif-bestand) in ImageJ. Klik op selectie gereedschap en selecteer een regio van belang (ROI) dat mitochondriën bevat. Gebruik de eerste TMRM signaal naar de ROI te selecteren. </li><li> Open &#39;Analyze&gt; Extra&gt; ROI Manager&#39;, klikt u op &#39;Toevoegen&#39; om de geselecteerde ROI voor verschillende meetwaardes bevatten. Meerdere ROI&#39;s kunnen worden geselecteerd op een enkel beeld voor de meting. Herhaal de vorige stappen totdat alle ROIdit is toegevoegd aan de ROI Manager. </li><li> Klik op &#39;Meer&gt; Multi Measure&#39;, zorg ervoor dat de &#39;Meet alle segmenten&#39; is geselecteerd en dat &#39;One Row Per Slice&#39; is uitgeschakeld, klikt u vervolgens op &#39;OK&#39; om een ​​tabel van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de TMRM en Fluo-4 signalen te verkrijgen voor elk ROI op elk tijdstip. </li><li> Gebruik gegevens uit alle ROI op de gemiddelde intensiteiten en de standaardafwijking voor TMRM en Fluo-4 signalen berekenen. </li></ol> 6. Berekening van de laatste vrije Ca 2+ Ion Concentratie [Ca 2+] <ol><li> Het vrije Ca2 + ionconcentratie [Ca 2,] in de IM beeldvormingsoplossing kunnen worden bepaald met behulp van software zoals Maxchelator WEBMAXC Extended ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) of Chelator 11. Stel bijvoorbeeld de variabelen in WEBMAXC UITGEBREID als volgt: Temperatuur = 24 ° C, pH = 7.1, ionensterkte = 0,162, EGTA = 0,002 M, 0,01 M = HEDTA, Ca2 + = 0,0004 M en Mg2 + = 0,0078 M. Dit leidt tot een laatste vrije Ca2 + ionconcentratie [Ca 2,] van 62 nM . Merk op dat deze programma geen rekening kan houden met iedere variabele, zoals reagens zuiverheid, nauwkeurigheid van de metingen en de pH-bepaling. De meest nauwkeurige methode voor het bepalen van de vrije Ca2 + -concentratie is een gekalibreerde Ca2 + elektrode gebruiken. </li></ol>

<ol><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Jacobson, J., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+cellular+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling.</a> Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).</li>
<li>Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+as+a+mediator+of+cell+energy+demand+and+a+trigger+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).</li>
<li>Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis+during+Ca2%2B+influx+and+Ca2%2B+release+in+gastric+myocytes+from+Bufo+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus.</a> J. Physiol. 522, 375-390 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+of+cytosolic+calcium+oscillations+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria.</a> Cell. 82, 415-424 (1995).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22057570">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Pozzan, T., Rudolf, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19100709">Measurements of mitochondrial calcium in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+respond+to+Ca2%2B+already+in+the+submicromolar+range%3A+correlation+with+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state.</a> Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).</li>
<li>Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHELATOR%3A+an+improved+method+for+computing+metal+ion+concentrations+in+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions.</a> BioTechniques. 12, 870-879 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Cellular+Bioenergetics+Causes+Mitochondrial+Calcium+Handling+Defects+in+MT-ND5+Mutant+Cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids.</a> PLoS One. 11, e0154371(2016).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cellular+indicators+are+extruded+by+the+multidrug+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.</a> J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).</li>
<li>Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cyclophilin+D+and+the+mitochondrial+permeability+transition+enhances+beta-cell+survival+and+prevents+diabetes+in+Pdx1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).</li>
<li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Calcium speelt een cruciale rol in vele celprocessen, waaronder spiercontractie, neuronale signalering en celproliferatie 13. Toename in cel calciumconcentraties worden vaak geassocieerd met energievraag, met calcium rechtstreeks kan stimuleren mitochondriale oxidatieve fosforylering ATP generatie 3 verhogen. Het is daarom van essentieel belang dat we de mogelijkheid hebben om effectief toezicht mitochondriale calcium accumulatie en om te kunnen vergelijken hoe deze functi...

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het reguleren van intracellulaire Ca2 + -concentratie door als lokale Ca2 + buffers 1. Ca 2+ komt in de mitochondriën via het Ca 2+ uniporter, een proces gedreven door de elektrochemische gradiënt die over het mitochondriale binnenste membraan (ΔΨ m) 2 bestaat. Eenmaal in de mitochondriale matrix, kunnen Ca2 + oxidatieve fosforylatie activeren door het stimuleren drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus 3. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix. Als de Ca2 + -concentratie in de mitochondriën erg hoog wordt, kan mitochondriale permeabiliteitsovergang worden gestart, waardoor de dissipatie van ΔΨ m, de cessation van oxidatieve fosforylering en de inductie van celdood signaalroutes 4. De belangrijke rol die de mitochondriën spelen in de ruimtelijke buffering van cellulaire calcium maakt de nauwkeurige monitoring van mitochondriale calcium kritisch. Verschillende methoden zijn vastgesteld mitochondriale calcium, waaronder het gebruik van rhodamine gebaseerde kleurstoffen controleren. Een dergelijke kleurstof, Rhod-2, AM, is zeer effectief in verdeling naar de mitochondriën mitochondriale Ca2 + niveaus 5 meten 6. Wel moet erop worden gebruikt als een kleurstof ophopen in andere organellen, zoals liposomen of blijven in de cel cytosol. Niettemin kan stroomafwaarts analyses worden gebruikt om deze signalen te onderscheiden van die van de mitochondriën 7. Een andere techniek om mitochondriale calcium monitoren gebruikt fluorescente reporter constructen 8 </s<html> up&gt;. Het voordeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze specifiek naar de mitochondriën kan worden gericht door endogene N-eindstandige peptiden, bijvoorbeeld de N-terminale targeting signaal menselijke COX subeenheid VIII. Dit systeem is gebruikt om een mitochondriaal aequorine gerichte probe die uiterst nuttig voor het onderzoeken van mitochondriale calcium signaling 9 is gebleken genereren. Het belangrijkste nadeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze moeten in de cellen door tijdelijke expressie worden ingevoerd (die niet haalbaar is voor bepaalde celtypes en kunnen variabele resultaten) of door stabiele expressiesystemen (die tijdrovend). Om de hierboven geschetste problemen te omzeilen, hebben we een nieuw protocol ontwikkeld om mitochondriale Ca 2+ en ΔΨ m gelijktijdig meten. Dit protocol is gebaseerd op een eerder beschreven methode exogeen calcium bijdraagt ​​aan gepermeabiliseerde cellens = &quot;xref&quot;&gt; 10. Ons protocol heeft drie belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden: ten eerste maken we gebruik van Fluo-4, AM en TMRM om mitochondriale Ca 2+ en ΔΨ m, twee kleurstoffen die zeer verschillende spectrale eigenschappen volgen; ten tweede worden de cellen permeabel gemaakt zodat de Fluo-4 signaal alleen detecteert mitochondriale Ca2 + en Ca2 + niet gelokaliseerd op andere organellen en de cel cytosol; en ten derde, het gebruik van Fluo-4 mitochondriale Ca 2+ detecteren maakt een snelle en eenvoudige celkleuring, ontkennen elke cel transfectie of transformatie problemen die bestaan bij gebruik van genetisch gecodeerde probes.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>foetaal bovien serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x penicilline/streptomycine (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsine/0,25% EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8-well kamer met dekglas</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>malaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>glutamaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ vrije Hank's gebufferde zout oplossing (HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylrodamine, methyl ester, perchloraat (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>carbonyl cyanide p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>thapsigargine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10 cm celkweek schaaltjes</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 celkweekkolven</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Naast hun essentiële rol bij het genereren van ATP, mitochondriën ook als lokale calcium (Ca2 +) buffers strak reguleren de intracellulaire Ca2 + -concentratie. Om dit te doen, mitochondriën gebruik maken van de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (ΔΨ m) naar sekwestreren Ca 2+. De instroom van Ca 2+ in de mitochondriën stimuleert drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus, het verhogen van elektronen overdracht via de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) complexen. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix. We beschrijven hier een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Doordringbaar door de cellen, mitochondriale Ca2 + kanworden gemeten met de fluorescerende Ca2 + indicator Fluo-4, AM, met bepaling van de ΔΨ m met de fluorescente kleurstof tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM). Het voordeel van dit systeem is dat er zeer weinig spectrale overlap tussen de fluorescerende kleurstoffen, waardoor accurate meting van mitochondriale Ca2 + en m gelijktijdig ΔΨ. Met de opeenvolgende toevoeging van Ca2 + aliquots, mitochondrial Ca2 + opname kan worden gevolgd, en de concentratie waarbij Ca2 + induceert mitochondriale permeabiliteit transitie en het verlies van ΔΨ m bepaald.

We hebben dit protocol gebruikt om de gevolgen van een MT-ND5 mutatie op het vermogen van mitochondriën 143B verhogingen buffer calcium 12 onderzocht. In het hier getoonde voorbeeld, werden controle 143B cellen opgeladen met TMRM en Fluo-4, AM voor permeabilisatie met digitonine. Na 5 min imaging, acht achtereenvolgende toevoegingen van een 1: 100 verdunning werden van 40 mM CaCl2 exogeen gemaakt met de laatste vrije Ca2 + ionconcent...

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige methode te bieden voor het gelijktijdig meten van de mitochondriale calciumopname en het mitochondriale membraanpotentieel in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het mitochondriale veld, zoals de vraag hoe mitochondriën fungeren als lokale calciumdepots om de intracellulaire calciumconcentratie nauwkeurig te reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel het mitochondriale calcium als het mitochondriale membraanpotentieel specifiek en gelijktijdig in levende cellen gemeten kunnen worden zonder dat genetische manipulatie noodzakelijk is.Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de calciumregulatie bij mitochondriale ziektepathologie, kan deze ook worden gebruikt om andere nieuwere degeneratieve aandoeningen te bestuderen waarbij de regulatie van calcium in de urine cruciaal is. Kweek in deze procedure de cellen op cellenkweekschalen van tien centimeter, of in flessen van 75 vierkante centimeter, in kweekmedium bij 37 °C gedurende 24 uur. Om de cellen te oogsten, wordt het medium door aspiratie verwijderd en worden de cel

simultaneous-measurement-mitochondrial-calcium-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een methode voor real-time meting van mitochondriale calcium fluxen door fluorescerende beeldvorming. De methode maakt gebruik van een circulair gepermuteerd YFP-gebaseerde dual-excitatie ratiometrische calcium sensor (ratiometrische pericam-mt) selectief, uitgedrukt in mitochondriën.

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Wij presenteren een methode om snel (microseconde) calcium gebeurtenissen isoleren van trager stromen in levende cellen met behulp van laser scanning confocale microscopie. De methode meet fluorescentie-intensiteit schommelingen van calcium indicatoren door het opnemen van lijn scans van enkele honderden pixels in een cel. Histogram-analyse laat ons toe om te isoleren van de tijdschalen van de verschillende calcium fluxen.

Het meten van Fast Calcium stromen in cardiomyocyten

Mitochondriale fusie werd gemeten door het bijhouden van de gelijkschakeling van de photoconverted matrix-gerichte GFP over het mitochondriale netwerk in de tijd. Tot dusver kon slechts een cel worden onderworpen aan een uur lang kinetische analyse tegelijk. Wij presenteren een methode die meet gelijktijdig meerdere cellen, waardoor versnelling van het proces van gegevensverzameling.

Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie

This video describes a plate reader-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in isolated mitochondria. The assay analyzes the fluorescence signal of a calcium-sensitive fluorescent dye to study the kinetics of mitochondrial calcium uptake and calcium overload.

Mitochondrial Calcium Uptake Assay: A Plate Reader-Based Method for Measuring Calcium Uptake in Isolated Mitochondria

This video describes a confocal microscopy imaging-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in cultured cells. The assay uses the calcium-sensitive fluorescent dye Rhod-2/AM to measure the mitochondrial calcium in permeabilized cultured cells.

Calcium Influx Assay to Measure Mitochondrial Calcium Uptake in Cultured Cells

The video demonstrates the simultaneous measurement of intracellular calcium levels and changes in membrane potential in endothelial cells of mouse cerebral artery segments. The isolated endothelial tube is loaded with a fluorescent calcium indicator and treated with a drug that induces intracellular calcium release, resulting in a change in membrane potential. The indicator's fluorescence enables the measurement of calcium levels, and a recording electrode is inserted into a cell to measure...

Simultaneous Measurement of Intracellular Calcium and Membrane Potential in a Mouse Cerebral Endothelium

Dit protocol is gericht op het beschrijven van een methode om te onderzoeken of het Ca2 + retentie capaciteit en Ca2 +- geactiveerd mitochondriale zwelling van geïsoleerde mitochondria van SH-SY5Y cellen stapsgewijze.

Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Leer mitochondriale calciumopname en membraanpotentiaal meten in levende cellen met confocale microscopie. Deze methode vereist geen genetische manipulatie en helpt bij onderzoek naar mitochondriale ziekten.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen