Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie
27 maart 2017
Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.
Het algemene doel van dit experiment is om kwantitatief ruimtelijk en temporeel bewijs te verkrijgen van de colocalisatie van de Angiotensine type one receptor met lysosomen na behandeling met Angiotensine twee. Deze methode is ontwikkeld om verschillen te detecteren in de subcellulaire verwerking van Y-type receptoren versus mutante receptoren tijdens het internalisatieproces dat optreedt als reactie op ligandstimulatie. De voordelen van deze techniek zijn dat live-cell imaging artefacten uit gefixeerde en met detergent gepermeabiliseerde cellen elimineert en dat dynamische veranderingen in de receptorlokalisatie in real-time kunnen worden beoordeeld.
Begin met het selecteren van een geschikt objectief met een numerieke apertuur van 1,4 en centreer het objectief boven de microscopietafel. Voeg een druppel immersieolie met een hoge viscositeit en lage autofluorescentie toe aan het objectief en plaats de kamer met de getransfecteerde cellen op de microscopietafel. Verplaats het objectief voorzichtig omhoog tot de olie net de onderkant van het eerste preparaat raakt en lokaliseer de zwak oplichtende cellen.
Wanneer een gezonde cel van belang zich in het centrum van het gezichtsveld bevindt, schakelt u over naar de confocale modus en bevestigt u dat de cel goed is uitgespreid, met de ventrale zijde nauw aansluitend tegen het dekglas. Open het dialoogvenster Z Stack, klik op Live, stel scherp op de bovenkant van de cel en klik vervolgens op Begin. Stel daarna scherp op de onderkant van de cell, voer een Z-stapgrootte van 1,00 micrometer in en klik vervolgens op End.
Select vervolgens de XYZT-modus onder de acquisitie-instellingen bovenaan. Stel tot slot het tijdsinterval voor de scan en de scantijd in om de targeting van de GFP-gelabelde Angiotensine Type 1A Receptor naar de lysosomen waar te nemen. Voeg vervolgens, om te beginnen met de ligandstimulatie, drie microliters van een 100 X voorraadoplossing van het ligand toe aan de well die wordt afgebeeld en klik op Start om de respons in 3D vast te leggen voor de gewenste periode en frequentie.
Om de beelden van de levende cellen te analyseren, opent u de geschikte software voor 3D-beeldkwantificering. In dit protocol is dat Velocity. Klik met de rechtermuisknop in het beeldveld en selecteer Eigenschappen.
Voer de juiste XY- en Z-afbeeldingspixelkenmerken in voor het maken van een meetreeks om de GFP-getagde receptorvesikels en de intensiteiten van de gehele cel te analyseren als reactie op ligandbehandeling. Selecteer onder het 2D-menu de extended-focusmodus om de cel te observeren. Gebruik vervolgens de freestyle-regiotool om een regio van belang rond de cel te tekenen en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding om 'Bijsnijden naar Selectie' te selecteren.
Er wordt een nieuw afbeeldingsitem gegenereerd. Klik op de naam van de afbeelding om de uitgesneden celafbeelding te selecteren en het tabblad voor metingen te openen. Om de GFP-expressie van de geïnternaliseerde blaasjes te meten, sleept u Find Objects van Finding naar het volggevolgvak hierboven.
Stel het kanaal voor het zoeken naar objecten in op GFP en open het instellingen-icoon om de drempelwaarde in te stellen op standaarddeviatie en de ondergrens op zes, om objecten met de hoogste GFP-intensiteiten te selecteren. Stel de minimale objectgrootte in op 0 µm³. Klik vervolgens op meten en selecteer de kanalen en de soorten metingen.
Sleep een tweede Find Objects-venster naar binnen om de drempelwaarden en filters te definiëren voor het identificeren van de gehele cel en om de totale GFP-intensiteit te meten. Stel vervolgens het Find Objects-kanaal in op GFP en zet de standaarddeviatie op nul, om objecten met elke GFP-intensiteit te selecteren, en stel de minimale objectgrootte in op 2 µm³. Sleep Filter Population naar het Population-venster van de tweede Find Objects-stap en selecteer een volume van > 100 µm³ om de gehele cel te selecteren en alle kleinere objecten te elimineren.
Select vervolgens metingen en het item Meting maken om op alle tijdspunten metingen uit te voeren. Om de gemeten GFP-expressie in blaasjes en in de gehele cel in de loop van de tijd te analyseren, klikt u op de bestandsnaam van het metingsitem onder de naam van de afbeelding. Om de gegevens voor GFP en blaasjes uit de totale gegevens te extraheren, opent u het tabblad 'raw' en selecteert u populatie één.
Open vervolgens het tabblad 'analyzed', klik met de rechtermuisknop op de gegevens, selecteer 'analysis' en kies daarna 'restricting analysis' om populatie één te selecteren. Om de hoeveelheid GFP in de hele cel te meten, wijzigt u beide naar populatie twee. Selecteer onder 'Analyze These Data' en 'Summarized By' de opties 'sum GFP color channel' en 'sum'.
Select vervolgens onder Organize the data by, en row, het tijdstip. Om de gegevens voor de hoeveelheid GFP in lysosomen te extraheren, stelt u in Find Objects voor populatie één het find objects-kanaal in op het rode kanaal. Stel in het wiel-icoon binnen het dialoogvenster de drempelwaarde in via standard deviation, de ondergrens op zes, om de rode objecten met de hoogste intensiteiten te selecteren, en de minimale objectgrootte op 0,017 µm³.
Selecteer metingen en maak een meetitem aan om metingen op alle tijdspunten uit te voeren. Om de gemeten GFP-expressie in lysosomen te analyseren, klikt u op de bestandsnaam van het meetitem onder de naam van de afbeelding. Selecteer populatie één onder het tabblad 'raw', en selecteer vervolgens populatie één, het GFP-kleurkanaal en 'sum' onder het tabblad 'analyze'; klik met de rechtermuisknop zoals voorheen om de hoeveelheid GFP in de rode blaasjes te meten.
Vóór ligandstimulatie zijn GFP-gelabelde Angiotensine Type 1A-receptoren hoofdzakelijk gelokaliseerd in het plasmamembraan. Binnen 2,5 minuten na de toevoeging van Angiotensine twee worden deze receptoren echter geïnternaliseerd, waarbij heldere vesikels ontstaan die later clusteren tot grote paranucleaire vesikels. De door Angiotensine twee geïnduceerde ruffling bemoeilijkt de kwantificering van de totale GFP-intensiteit van de vesikels, zoals blijkt uit deze representatieve GFP-expressiemetingen.
Groottefiltratie maakt geen onderscheid tussen de grotere plooien en geclusterde blaasjes, maar laat wel zien dat GFP in kleinere objecten sneller toeneemt dan GFP in grotere objecten. In dit representatieve tijdverloop van GFP-expressie zonder autofocus werd het geïnternaliseerde GFP gemeten als percentage van het totale cellulaire GFP. Analyse van het totale GFP binnen de cel onthulde dat deze cel in de loop van de tijd niet noemenswaardig fotobleekte.
Kwantificering van het GFP in de lysosomen van getransfecteerde cellen geeft ook aan dat de intensiteit van de Angiotensine Type 1A-receptor aanwezig in de lysosomen niet varieert tot 24 minuten na toediening van Angiotensine twee. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de vitaliteit van de cellen vóór en tijdens de beeldvorming te bewaken; aangezien de procedure tijdrovend is, moet het experiment worden afgebroken als de celculturen op enige wijze abnormaal zijn. Na deze procedure kunnen immunokleuring en FRET of FLIM worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van de receptoren te detecteren en te bevestigen.
Western blots kunnen worden uitgevoerd om de identiteit en veranderingen in signaleringsmoleculen te bepalen die betrokken zijn bij het receptorvervoer. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u live-cell imaging en analyse uitvoert om de door ligand geïnduceerde targeting van transmembraanreceptoren naar lysosomen en andere subcellulaire compartimenten te meten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beelden van cellen die angiotensin type 1a-receptoren met een groen fluorescent eiwit-label tot expressie brengen tijdens endocytose geïnitieerd door behandeling met angiotensin II. De methode maakt real-time analyse van de co-lokalisatie van receptoren en lysosomen mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Angiotensine type 1-receptoren spelen een cruciale rol in de cellulaire signalering.
- Inzicht in receptor-endocytose is belangrijk voor het verduidelijken van cellulaire responsen op liganden.
- Real-time imaging-technieken kunnen inzicht bieden in dynamische cellulaire processen.
- Eerdere methoden kunnen artefacten introduceren die het werkelijke cellulaire gedrag maskeren.
Doel van de studie
- Om kwantitatief ruimtelijk en temporeel bewijs te verkrijgen voor de colokalisatie van receptor en lysosoom.
- Om de internalisatieprocessen van wildtype- en mutante receptoren te vergelijken.
- Om het begrip van receptordynamiek in levende cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Live-cell imaging met gebruik van een objectief met een hoge numerieke apertuur.
- Toepassing van immersie-olie voor verbeterde beeldvorming.
- Fluorescente markering van lysosomen om de receptorlokalisatie te volgen.
- Softwareanalyse voor de beoordeling van driedimensionale co-lokalisatie.
Belangrijkste resultaten
- Real-time imaging legt receptordynamiek effectief vast.
- Verschillen in internalisatie tussen wild-type en gemuteerde receptoren werden waargenomen.
- Colokalisatie van receptoren en lysosomen werd succesvol gekwantificeerd.
- De techniek minimaliseert artefacten die geassocieerd worden met gefixeerde cellen.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuuste methode voor het bestuderen van receptor-endocytose.
- Real-time imaging kan cruciale inzichten verschaffen in cellulaire signaleringsmechanismen.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrip van de receptorfunctie in diverse biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Live-cell imaging van receptortransport maakt een realtime, kwantitatieve beoordeling van ligand-geïnduceerde subcellulaire dynamiek mogelijk, waardoor artefacten door fixatie worden verminderd en mechanistische risicoanalyse bij vroege targetvalidatie wordt ondersteund. Deze aanpak biedt voorspellend vertrouwen in het gedrag van receptoren, wat bijdraagt aan go/no-go beslissingen bij lead-identificatie en de selectie van preklinische modellen. Door ruimtelijke en temporele colocalisatiedata vast te leggen, wordt de translationele continuïteit van discovery tot preklinische validatie versterkt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoek therapeutische hypothesen door real-time receptorinternalisatie en lysosomale trafficking te visualiseren als reactie op ligandstimulatie.
- Operationele waarde: Elimineer fixatie-artefacten die de lokalisatie van membraanreceptoren beïnvloeden, waardoor de betrouwbaarheid van de gegevens voor targetvalidatie wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Kwantificeer de colokalisatie van receptor-lysosomen in de tijd om de trafficking-kinetiek te beoordelen en fenotypische screening van receptorvarianten te ondersteunen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereid gevalideerde HEK-293-celsystemen voor die EGFP-getagde receptoren tot expressie brengen voor gestandaardiseerde, reproduceerbare workflows voor live-cell imaging.
- Kwantitatieve output: Genereer 3D-voxelgebaseerde metingen van de receptorintensiteit in blaasjes en lysosomen over de tijd, waardoor de effecten van verbindingen kunnen worden beoordeeld.
- Schaalbaarheid: Ondersteun high-content imaging-platforms via gedefinieerde acquisitieparameters (Z-stap, tijdsinterval, voxelgrootte) en geautomatiseerde segmentatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleer het transport van angiotensinereceptoren in een menselijk cellsysteem om strategieën voor cardiovasculaire targetmodulatie te informeren.
- Translationele biomarker: Koppel de lysosomale accumulatie van receptoren aan downstream signaleringsuitkomsten ter ondersteuning van biomarker-gealigneerde preklinische modellen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Gebruik transportkinetiek om receptorvarianten of liganden met gunstige subcellulaire verwerkingsprofielen te prioriteren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot leadidentificatie, en levert dynamische, kwantitatieve gegevens die bijdragen aan de vroege preklinische beoordeling van de receptorfunctie.
- Discovery Biology: Ondersteuning van hypothesetesten van receptor-traffickingmechanismen en verduidelijking van signaalpaden via real-time visualisatie van Ang II-geïnduceerde internalisatie.
- Screening: Realiseren van assay-gereedheid door gestandaardiseerde transfectie-, kleurings- en imagingparameters die reproduceerbare detectie van blaasjes en lysosomen waarborgen.
- Analytics: Leveren van kwantitatieve read-outs van de GFP-intensiteit in receptorblaasjes en lysosomen, genormaliseerd naar de totale cellulaire GFP, om condities over verschillende tijdspunten te vergelijken.
- Translational Research: Verbinding van live-cell imagingdata aan preklinische continuïteit door receptorlokalisatie te koppelen aan functionele uitkomsten in ziekte-relevante systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigen van een herbruikbaar imagingplatform voor GPCR-traffickingstudies over meerdere targets en cellijnen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoog het voorspellende vertrouwen in receptorgedrag door fixatie-artefacten te minimaliseren en dynamische trafficking-gebeurtenissen vast te leggen.
- Operationele waarde: Standaardiseer imaging- en analyseprotocollen tussen teams om de reproduceerbaarheid van gegevens over subcellulaire lokalisatie te verbeteren.
- Strategische waarde: Maak datagestuurde go/no-go-beslissingen bij lead-optimalisatie mogelijk door verschillen in receptorverwerking tussen wild-type en mutante varianten bloot te leggen.
- Impact op portfolio: Ondersteun risico-gecorrigeerde prioritering van receptor-gerichte kandidaten op basis van gevalideerde trafficking-kinetiek en lysosomale betrokkenheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, fluorescent eiwit-tagging en protocollen voor live-cell imaging.
- Afhankelijk van objectieven met een hoge numerieke apertuur, immersieolie en laser-scanning confocale systemen voor optimale signaaldetectie.
- Noodzaak tot cross-team standaardisatie van beeldparameters (Z-stap, tijdsinterval, voxelgrootte) en analysedrempels voor consistente resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende receptortags, fluorescerende kleurstoffen en celtypen buiten HEK-293.
- Inclusief praktische beperkingen zoals het risico op fotobleking bij hoge beeldsnelheden en afwegingen tussen temporele resolutie en fotoncollectie.
