Name: Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer live-cell imaging en 3D-analyse van angiotensine receptor type 1a-trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen. Deze methode kwantificeert receptor-lysosoom co-lokalisatie in realtime.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek dat in dit manuscript werd ondersteund door subsidie ​​R01 HL121456-01A1 aan Kathryn Sandberg. Dit werk werd ondersteund in aanvulling op de beschikbaarheid van een Leica SP8 AOB in de Microscopie en Imaging Shared Resource (MISR) aan Georgetown University Medical Center, die deels wordt gefinancierd door P30-CA051008 van de National Institutes of Health van de Verenigde Staten van Amerika. Wij dankbaar erkennen Leica SP8 imaging bijstand van Peter Johnson, en het gebruik van de Zeiss LSM880 in het laboratorium van Thomas Coate, Departement Biologie aan de Georgetown University met imaging bijstand van Alma Arnold van Carl Zeiss Microscopy LLC. De inhoud van dit manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

<ol><li>Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+angiotensin+II+type+1A+receptor+intracellular+retention%2C+degradation%2C+and+recycling+by+Rab5%2C+Rab7%2C+and+Rab11+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases.</a> J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).</li>
<li>Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+angiotensin+II+and+its+AT1+and+AT2+receptors%3A+evidence+for+selective+sorting+of+receptor+and+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand.</a> Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).</li>
<li>Hunyady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+PI+3-kinase+dependence+of+early+and+late+phases+of+recycling+of+the+internalized+AT1+angiotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).</li>
<li>Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+angiotensin+II+in+rat+myometrial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells.</a> Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).</li>
<li>Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4+and+Rab11+coordinately+regulate+the+recycling+of+angiotensin+II+type+I+receptor+as+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton-dependent+Rab+GTPase-regulated+angiotensin+type+I+receptor+lysosomal+degradation+studied+by+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+prevents+maturation+of+autophagic+vacuoles+by+inhibiting+fusion+between+autophagosomes+and+lysosomes+in+rat+hepatoma+cell+line%2C+H-4-II-E+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells.</a> Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).</li>
<li>Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+angiotensin+II+activates+rat+myometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular angiotensin II activates rat myometrium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).</li>
<li>Fortian, A., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+reveals+high+stoichiometry+of+Grb2+binding+to+the+EGF+receptor+sustained+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).</li>
<li>Aymerich, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+G-protein-coupled+receptor+imaging+to+understand+and+quantify+receptor+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics.</a> ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).</li>
<li>Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Detection+of+Diversity+and+Bias+in+GPCR+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).</li>
<li>Inuzuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ligand-induced+activation+of+angiotensin+II+type+1+receptor+signaling+by+the+type+2+receptor+via+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase.</a> C. Sci Rep. 6, 21613(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+angiotensin+receptor+signaling+through+Erk1%2F2+pathway+by+a+novel+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Mueller, S. C., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+asialoglycoproteins+by+rat+hepatocytes%3A+receptor-positive+and+receptor-negative+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes.</a> J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670(2015).</li>
<li>Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+Lysotracker+Red+to+a+green+fluorescent+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule.</a> Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).</li>
<li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1%2C+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H%28%2B%29-ATPase%2C+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Voorlopige experimenten hier gepresenteerde illustreren dat over een vrij korte tijdsverloop van 24 min, geen merkbare verandering in de levering van AT 1a R-GFP aan de lysosomen plaatsgevonden. In het algemeen kan afgifte van geïnternaliseerd receptoren lysosomen al 15-20 min optreden. Dit experiment is consistent met de hypothese dat het merendeel van de geïnternaliseerde AT 1a R is gericht op grote perinucleaire endosomen. Bewijs dat althans een aantal op 1a R komt in lysosomen werd a...

Het algemene doel is om kwantitatieve gegevens in tijd en ruimte van de receptor colocalization met specifieke subcellulaire organellen krijgen na behandeling met een receptor agonist. Aldus onmiddellijke doel is hier om time-lapse confocale beelden van lysosomen en een transmembraan spanning receptor in humane embryonale niercellen (HEK) na transfectie en vervolgens verzamelen en analyseren van de beeldgegevens in 3D kwantitatief meten van de afgifte van receptor vastleggen lysosomen. Onderzoeken van de gelijktijdige handel in een transmembraan receptor met lysosomen of andere organellen tijdens endocytose wanneer geactiveerd door receptor ligand kan helpen bepalen hoe de transmembraan receptor wordt gereguleerd onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. AT 1a R wordt geacht te zijn afgebroken in lysosomen na behandeling met Ang II model celsystemen, vooral HEK293 1 hoewel de meerderheid van receptors zijn voornamelijk gelokaliseerd in multivesiculaire recycling endosomen voor latere overdracht naar de plasmamembraan terwijl het grootste deel van de ligand, Ang II, afgebroken in het lysosoom 2, 3, 4, 5. Meer recent, Li et al. aangetoond met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) technieken die op 1a R colocalizes (op ~ 10 nm schaal) LAMP1, een lysosomale membraaneiwit suggereren dat ten minste enkele van de receptor is gericht op en afgebroken door lysosomen 6. Deze auteurs opgemerkt dat de lysosomale remmer chloroquine geblokkeerde AT 1a R-LAMP1 vereniging die is in overeenstemming met eerdere rapporten suggereren dat een effect van chloroquine is om fusie van de late endosomen of autofagosomen met lysosomen te blokkeren. Andere indirecte methoden om te bepalen op 1a R localization in lysosomen hebben gebruikt bafilomycine, een lysosomale remmers afgeleid op 1a R aanwezig in lysosomen 3, 4, 5, 6, 7, 8. Live-cell imaging vermijdt mogelijke gevolgen van fixatie op celvolume en verlies / dimmen / herverdeling van GFP-chimere receptor. Eerdere studies hebben ingeroepen gefixeerde cellen aan colocalization of samen voorkomen van de receptor met lysosomen of met levende cellen gemerkt met receptorbinding surrogaten bepalen zoals β-arrestine 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-cell imaging van andere GPCR&#39;s met behulp van draaiende schijf confocale laser of point scanning confokale microscopen uitgerust met de Gaasp of hyd detectoren ingeschakeld onderzoekers aan de internalisering van en handel in receptoren in individuele cellen afgebeeld in z-stacks op 30 s intervallen 9, 10 observeren. Maar zelfs als levende cellen z-stacks snel worden verzameld, kan de analyse pas na selectie van een enkel vlak binnen elke stapel, dwz in 2D 10. Hoewel dit voldoende kan zijn voor het bestuderen van geïnternaliseerde GPCR of tyrosine kinase receptor in kwestie, de AT 1a Rs ophoopt in blaasjes die grootte en de positie in de tijd en zijn derhalve inherent moeilijk voldoende monster met een representatief snee op elk tijdstip. Om de route van het gemerkte AT 1a R door de cel en elke subpopulatie van vesicles die verschillen in grootte en positie detecteren grondig te bepalen, hebben wij een methode ontwikkeld voor 3D beeldvorming en 3D analyse om deze veranderingen te volgen en te<html> in combinatie met kenmerken van verschillende intracellulaire compartimenten zoals lysosomen. Onderzoekers kunnen dit protocol live-cell imaging om de beweging van AT 1a R direct zichtbaar in de cel en het naar subcellulaire compartimenten na Ang II stimulatie. Subcellulaire compartimenten zijn gelabeld met fluorescerend eiwit chimaera&#39;s of andere fluorescente merkers. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een eerste benadering van receptoren in subcellulaire organellen met een minimale resolutie van 200 nm lokaliseren ter vergelijk gemuteerd versus wild-type receptoren of aan veranderingen na farmacologische behandelingen detecteren. De techniek is bereikbaar omdat het op elke confocale microscoop uitgerust voor levende cellen beeldvorming kan worden uitgevoerd. Het relatieve gemak van deze benadering contrasteert met verhoogde deskundigheid en apparatuur die nodig FRET / FLIM / BRET technieken welke moleculaire interacties detecteren 6 uit te voeren,&quot;xref&quot;&gt; 11. Deze metingen definiëren eiwit-eiwit interacties met hoge resolutie (~ 10 nm) en lokalisatie binnen subcellulaire organellen is afgeleid. Deze meer geavanceerde technieken worden gebruikt om te volgen en verder te definiëren moleculaire interacties plaats, in plaats van de doorgang van receptoren, subcellulaire compartimenten en zij rechtstreeks eiwit-eiwit interacties op bepaalde tijdstippen en plaatsen aantonen binnen de cel 11. FLIM, een FRET techniek onafhankelijk van de acceptor concentratie, wordt meestal uitgevoerd op vaste monsters sinds beeldacquisitie is langzamer. Daarentegen verhouding FRET biedt snelle beeldvorming en hoge resolutie colokalisatie van interagerende eiwitten. Het nadeel van verhouding FRET is dat beeldvorming gebruikt groothoek epi-fluorescentie imaging snelheid te winnen en de gehele cel, wat resulteert in gereduceerde resolutie en contrast van organellen 12 omvatten. Bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) is een andergeavanceerde techniek die is toegepast op GPCR&#39;s aan de overname van de moleculaire nabijheid te meten in de tijd 11. In deze techniek een eiwit fluorofoor moleculair verdeeld en elke helft gekoppeld aan één van twee eiwitten betrokken. Wanneer de twee eiwitten van belang binden elkaar, het delen van het chimere tag opnieuw assembleren fluorescentie en de verhoogde fluorescentie gekwantificeerd tijd krijgen. Hier presenteren we een eenvoudige techniek voor live cell imaging in combinatie met image kwantificering tot smokkel van AT 1a R studeren in de cel na Ang II stimulatie en de mogelijke verandering in de levering van geïnternaliseerde AT 1a R om lysosomen na Ang II stimulatie. Het uiteindelijke gebruik van deze techniek is om verschillen in membraantransport vergelijken wildtype en gemuteerde receptoren te karakteriseren. Deze verschillen zullen helpen om het mechanisme (s) die van invloed zijn fysiologische activiteiten van AT 1a R leadi identificerenng tot regulering van de bloeddruk.

<table><tbody><tr><td>Angiotensin II (Ang II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>11960-044</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>25030-081</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cellen</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)&nbsp;</td><td>CRL-1573</td><td>Passage nummer 5 - 12</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium</td><td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>PBS 10x&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)&nbsp;</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>31053-028</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>molecular probes -ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td>Bewaar aliquots in het donker bij -20 &deg;C .&nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software</td><td>PerkinElmer</td><td>Visualization and Quantitation Modules</td><td>Voor 3D beeldanalyse van beeldastacks</td></tr><tr><td>Leica SP8 AOBS</td><td>Leica Microsystems</td><td>laser scanning confocal microscope</td><td>Voor beeldacquisitie</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Carl Zeiss</td><td>laser scanning confocal microscope</td><td>Voor beeldacquisitie</td></tr></tbody></table>

live-cell imaging en 3d analyse van angiotensine receptor type 1a trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Levende cellen beeldvorming wordt gebruikt om gelijktijdig vastleggen time-lapse beelden type 1a angiotensine receptoren (AT 1a R) en intracellulaire compartimenten in getransfecteerde humane embryonale nier-293 (HEK) cellen na stimulatie met angiotensine II (Ang II). HEK cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmide DNA dat op 1a R tag versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP). Lysosomen worden geïdentificeerd met een rode fluorescerende kleurstof. Levende cellen beelden worden vastgelegd op een laser scanning confocale microscoop na Ang II stimulatie en software geanalyseerd in drie dimensies (3D voxels) tijd. Live-cell imaging maakt onderzoek naar receptoren handel en vermijdt verwart geassocieerd met fixatie, en met name het verlies of artefact verplaatsing van EGFP-gelabelde membraanreceptoren. Dus, zoals afzonderlijke cellen worden gevolgd in de tijd, de subcellulaire lokalisatie van receptoren kunnen worden afgebeeld en gemeten. Afbeeldingen moeten worden verworven sufficiently snel tot een snelle blaasje beweging vast te leggen. Maar bij hogere belichtingssnelheden, het aantal fotonen verzameld verminderd. Compromissen moeten worden gemaakt in de keuze van beeldvormende parameters zoals voxel om beeldvorming snelheid te winnen. Significante toepassingen van levende cellen beeldvorming om eiwittransport, migratie, proliferatie, celcyclus, apoptose, autofagie en eiwit-eiwit interactie en dynamiek bestuderen om maar enkele te noemen.

In deze representatieve reeks experimenten werden HEK cellen getransfecteerd met type 1a angiotensine receptor (AT 1a R-GFP) construct (E1,2,3-AT 1a R) gekloneerd in het plasmide pEGFP-N2 13. Time-lapse beelden van HEK werden verworven en speelde als een film (zie live cell imaging 1 en live cell imaging 2 films). De films en foto blijkt dat na ligand stimulatie, AT 1a R-EGFPs zijn voornamelijk gel...

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Het algemene doel van dit experiment is om kwantitatief ruimtelijk en temporeel bewijs te verkrijgen van de colocalisatie van de Angiotensine type one receptor met lysosomen na behandeling met Angiotensine twee. Deze methode is ontwikkeld om verschillen te detecteren in de subcellulaire verwerking van Y-type receptoren versus mutante receptoren tijdens het internalisatieproces dat optreedt als reactie op ligandstimulatie. De voordelen van deze techniek zijn dat live-cell imaging artefacten uit gefixeerde en met detergent gepermeabiliseerde cellen elimineert en dat dynamische veranderingen in de receptorlokalisatie in real-time kunnen worden beoordeeld.Begin met het selecteren van een geschikt objectief met een numerieke apertuur van 1,4 en centreer het objectief boven de microscopietafel. Voeg een druppel immersieolie met een hoge viscositeit en lage autofluorescentie toe aan het objectief en plaats de kamer met de getransfecteerde cellen op de microscopietafel. Verplaats het objectief voorzichtig omhoog tot de olie net de onderkant van het eerste preparaat raakt en lokaliseer de zwak oplichtende cellen.Wanneer een gezonde cel van belang zich in het centrum van het gezichtsveld bevindt, schakelt u over naar de confocale modus en bevestigt u dat de cel goed is uitgespreid, met de ventrale zijde nauw aansluitend tegen het dekglas. Open het dialoogvenster Z Stack, klik op Live, stel scherp op de bovenkant van de cel en klik vervolgens op Begin. Stel daarna scherp op de onderkant van de cell, voer een Z-stapgrootte van 1,00 micrometer in en klik vervolgens op End.Select vervolgens de XYZT-modus onder de acquisitie-instellingen bovenaan. Stel tot slot het tijdsinterval voor de scan en de scantijd in om de targeting van de GFP-gelabelde Angiotensine Type 1A Receptor naar de lysosomen waar te nemen. Voeg vervolgens, om te beginnen met de ligandstimulatie, drie microliters van een 100 X voorraadoplossing van het ligand toe aan de well die wordt afgebeeld en klik op Start om de respons in 3D vast te leggen voor de gewenste periode en frequentie.Om de beelden van de levende cellen te analyseren, opent u de geschikte software voor 3D-beeldkwantificering. In dit protocol is dat Velocity. Klik met de rechtermuisknop in het beeldveld en selecteer Eigenschappen.Voer de juiste XY- en Z-afbeeldingspixelkenmerken in voor het maken van een meetreeks om de GFP-getagde receptorvesikels en de intensiteiten van de gehele cel te analyseren als reactie op ligandbehandeling. Selecteer onder het 2D-menu de extended-focusmodus om de cel te observeren. Gebruik vervolgens de freestyle-regiotool om een regio van belang rond de cel te tekenen en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding om 'Bijsnijden naar Selectie' te selecteren.Er wordt een nieuw afbeeldingsitem gegenereerd. Klik op de naam van de afbeelding om de uitgesneden celafbeelding te selecteren en het tabblad voor metingen te openen. Om de GFP-expressie van de geïnternaliseerde blaasjes te meten, sleept u Find Objects van Finding naar het volggevolgvak hierboven.Stel het kanaal voor het zoeken naar objecten in op GFP en open het instellingen-icoon om de drempelwaarde in te stellen op standaarddeviatie en de ondergrens op zes, om objecten met de hoogste GFP-intensiteiten te selecteren. Stel de minimale objectgrootte in op 0 µm³. Klik vervolgens op meten en selecteer de kanalen en de soorten metingen.Sleep een tweede Find Objects-venster naar binnen om de drempelwaarden en filters te definiëren voor het identificeren van de gehele cel en om de totale GFP-intensiteit te meten. Stel vervolgens het Find Objects-kanaal in op GFP en zet de standaarddeviatie op nul, om objecten met elke GFP-intensiteit te selecteren, en stel de minimale objectgrootte in op 2 µm³. Sleep Filter Population naar het Population-venster van de tweede Find Objects-stap en selecteer een volume van > 100 µm³ om de gehele cel te selecteren en alle kleinere objecten te elimineren.Select vervolgens metingen en het item Meting maken om op alle tijdspunten metingen uit te voeren. Om de gemeten GFP-expressie in blaasjes en in de gehele cel in de loop van de tijd te analyseren, klikt u op de bestandsnaam van het metingsitem onder de naam van de afbeelding. Om de gegevens voor GFP en blaasjes uit de totale gegevens te extraheren, opent u het tabblad 'raw' en selecteert u populatie één.Open vervolgens het tabblad 'analyzed', klik met de rechtermuisknop op de gegevens, selecteer 'analysis' en kies daarna 'restricting analysis' om populatie één te selecteren. Om de hoeveelheid GFP in de hele cel te meten, wijzigt u beide naar populatie twee. Selecteer onder 'Analyze These Data' en 'Summarized By' de opties 'sum GFP color channel' en 'sum'.Select vervolgens onder Organize the data by, en row, het tijdstip. Om de gegevens voor de hoeveelheid GFP in lysosomen te extraheren, stelt u in Find Objects voor populatie één het find objects-kanaal in op het rode kanaal. Stel in het wiel-icoon binnen het dialoogvenster de drempelwaarde in via standard deviation, de ondergrens op zes, om de rode objecten met de hoogste intensiteiten te selecteren, en de minimale objectgrootte op 0,017 µm³.Selecteer metingen en maak een meetitem aan om metingen op alle tijdspunten uit te voeren. Om de gemeten GFP-expressie in lysosomen te analyseren, klikt u op de bestandsnaam van het meetitem onder de naam van de afbeelding. Selecteer populatie één onder het tabblad 'raw', en selecteer vervolgens populatie één, het GFP-kleurkanaal en 'sum' onder het tabblad 'analyze'; klik met de rechtermuisknop zoals voorheen om de hoeveelheid GFP in de rode blaasjes te meten.Vóór ligandstimulatie zijn GFP-gelabelde Angiotensine Type 1A-receptoren hoofdzakelijk gelokaliseerd in het plasmamembraan. Binnen 2,5 minuten na de toevoeging van Angiotensine twee worden deze receptoren echter geïnternaliseerd, waarbij heldere vesikels ontstaan die later clusteren tot grote paranucleaire vesikels. De door Angiotensine twee geïnduceerde ruffling bemoeilijkt de kwantificering van de totale GFP-intensiteit van de vesikels, zoals blijkt uit deze representatieve GFP-expressiemetingen.Groottefiltratie maakt geen onderscheid tussen de grotere plooien en geclusterde blaasjes, maar laat wel zien dat GFP in kleinere objecten sneller toeneemt dan GFP in grotere objecten. In dit representatieve tijdverloop van GFP-expressie zonder autofocus werd het geïnternaliseerde GFP gemeten als percentage van het totale cellulaire GFP. Analyse van het totale GFP binnen de cel onthulde dat deze cel in de loop van de tijd niet noemenswaardig fotobleekte.Kwantificering van het GFP in de lysosomen van getransfecteerde cellen geeft ook aan dat de intensiteit van de Angiotensine Type 1A-receptor aanwezig in de lysosomen niet varieert tot 24 minuten na toediening van Angiotensine twee. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de vitaliteit van de cellen vóór en tijdens de beeldvorming te bewaken; aangezien de procedure tijdrovend is, moet het experiment worden afgebroken als de celculturen op enige wijze abnormaal zijn. Na deze procedure kunnen immunokleuring en FRET of FLIM worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van de receptoren te detecteren en te bevestigen.Western blots kunnen worden uitgevoerd om de identiteit en veranderingen in signaleringsmoleculen te bepalen die betrokken zijn bij het receptorvervoer. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u live-cell imaging en analyse uitvoert om de door ligand geïnduceerde targeting van transmembraanreceptoren naar lysosomen en andere subcellulaire compartimenten te meten.

live-cell-imaging-3d-analysis-angiotensin-receptor-type-1a

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Dit document beschrijft de methodologie om de chemotactische respons van leukocyten aan specifieke liganden bepalen en interacties tussen de receptoren op het celoppervlak en cytosolische eiwitten met behulp van live-cell imaging technieken.

Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Imaging embryonaal weefsel in real-time is een uitdaging gedurende een lange periode van tijd. Hier presenteren we een test voor het toezicht cellulaire en sub-cellulaire veranderingen in de chick ruggenmerg gedurende lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze techniek kan worden aangepast voor andere gebieden van het zenuwstelsel en zich ontwikkelende embryo.

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Dit protocol beschrijft een methode voor live celbeeldvorming met behulp van primaire neonatale rattencardiomyocyten na lentivirale en adenovirale transductie met behulp van confocale spinning disk microscopie. Dit maakt gedetailleerde observaties van cellulaire processen in levende cardiomyocyten mogelijk.

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Dit artikel bevat gedetailleerde methodologie voor het identificeren en kwantificeren van functionele T-lymfocyten subsets in muizen nieren, aorta en de lymfeklieren aanwezig door intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie werd gekozen uitleggen, stap voor stap, de procedures en de grondbeginselen van flowcytometrie en intracellulaire kleuring.

Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension

Dit manuscript beschrijft het gebruik van transgene reporter muizen en andere beheerprogramma routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II-geïnduceerde hypertensie met behulp van intravital videomicroscopie van bloedvaten te evalueren van de activering van immune cellen en hun mogelijkheid te rollen en zich houden aan het endotheel.

Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

Leer live-cell imaging en 3D-analyse van angiotensine receptor type 1a-trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen. Deze methode kwantificeert receptor-lysosoom co-lokalisatie in realtime.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie (Video) | JoVE Journal

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Meer video's verkennen