Gerichte plasmamembraan Levering van een hydrofobe Cargo ingekapseld in een Liquid Crystal nanodeeltjes Carrier

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een op vloeibaar kristal gebaseerd nanodeeltje te gebruiken als afgifteplatform voor de gecontroleerde afgifte van een hydrofobe lading aan het lipofiele gedeelte van het plasmamembraan van levende zoogdiercellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van geneesmiddelenafgifte, zoals hoe de afgifte en cellulaire opname van slecht wateroplosbare hydrofobe ladingen efficiënt kan worden gefaciliteerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een specifiekere afgifte mogelijk maakt van membraan-gerichte hydrofobe ladingen aan het plasmamembraan, gekoppeld aan een verminderde cytotoxiciteit ervan.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Okhil Nag, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin deze procedure met de bereiding van DiO vloeibaarkristal-nanodeeltjes zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 20 µL vers bereide werkoplossing van NHSS/EDC toe aan 1,0 mL van de DiO vloeibaarkristal-nanodeeltjes in HEPES-buffer.

En roer gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 20 µL van een stamoplossing van cholesterol PEG amine toe aan dit mengsel en roer gedurende twee uur. Centrifugeer na twee uur het reactiemengsel kortstondig gedurende 30 seconden op maximale snelheid met een tabletop minicentrifuge.

Breng vervolgens het supernatant door een PD 10 grootte-uitsluitingschromatografiekolom die is geëquilibreerd met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing. Om de succesvolle covalente conjugatie van PEG-cholesterol aan het oppervlak van de DiO vloeibaar-kristallijne nanodeeltjes via gelelektroforese te bevestigen, wordt een agarosegel bereid zoals beschreven in het tekstprotocol. Zodra de gel is gestold, wordt er voldoende TBE-runbuffer toegevoegd om de gel in de kamer volledig onder te dompelen.

Voeg vervolgens 35 µL van het DiO-vloeibaar-kristal-nanodeeltjesmonster toe aan de putjes van de gel en laat dit 20 minuten lopen bij een voltage van 110 V. Beeld de gel af met een gel-imagingsysteem met een excitatiefilter van 488 nm en emissiefilters van 500 tot 550 nm. Bereid weefselkweekschalen van 35 mm diameter, voorzien van nummer één dekglasinserts van 14 mm, door deze gedurende twee uur bij 37 °C te coaten met bovine fibronectine in DPBS.

Verwijder na twee uur de fibronectine-coatingsoplossing uit de kweekschaal. Oogst HEK 293 T17-cellen uit de T25-fles door de cellaag eerst te wassen met drie milliliters DPBS en vervolgens twee milliliters trypsin EDTA toe te voegen. Incubeer de fles bij 37 °C gedurende ongeveer drie minuten.

Zodra de cellen van de kolf zijn losgemaakt, neutraliseert u de trypsine door vier milliliter compleet medium aan de kolf toe te voegen. Bepaal de celconcentratie in de suspensie door deze te tellen met een celteller. Stel vervolgens de celconcentratie bij tot ongeveer 80.000 cellen per milliliter met groeimedium.

Voeg drie milliliter van de celsuspensie toe aan de schaal en kweek deze gedurende de nacht in de incubator. De volgende dag zouden de cellen een confluentie van ongeveer 70 procent moeten hebben en klaar voor gebruik moeten zijn. Een adequate celdichtheid is essentieel voor een robuuste en efficiënte labeling van een hoog percentage cellen.

Bereid oplossingen van één milliliter DiO, DiO vloeibaarkristal-nanodeeltjes en DiO vloeibaarkristal-nanodeeltjes PEG-cholesterol in transportmedium door de overeenkomstige stockoplossingen te verdunnen. Verwijder het groeimedium uit de kweekschalen met een serologische pipet en was de cellagen twee keer met HEPES DMEM. Voer de wasbeurten uit door met een pipet voorzichtig HEPES DMEM aan de rand van de schalen toe te voegen en dit vervolgens weer te verwijderen.

Voeg 0,2 milliliters van de bereide DiO-vrije of DiO-vloeibaarkristal-nanodeeltjes-afleveringsoplossingen toe aan het midden van de kweekschalen. Plaats de schalen vervolgens voor een passende periode terug in de incubator. Langere incubatietijden leiden tot aspecifieke cellulaire markering van niet-membraneuze gebieden.

Verwijder na de incubatieperiode de leveringsoplossingen met een serologische pipet. Was de cellagen twee keer met DPBS, waarbij twee milliliter per wasbeurt wordt gebruikt. Fixeer de cellagen met vier procent paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de paraformaldehyde-oplossing met een pipet en was de cellen voorzichtig één keer met twee milliliter DPBS. De gefixeerde cellen zijn nu klaar om via confocale laserscanmicroscopie te worden gefotografeerd op de aanwezigheid van een membraanachtig fluorescent signaal. Maak beelden van het levende celmonster met een confocale microscoop op een microscooptafel die is uitgerust met een verwarmde incubatiekamer, om de membraanmarkering te beoordelen.

Als de beeldvorming niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, vervang dan het medium door DPBS met 0,05 procent natriumazide en bewaar de schaaltjes bij vier graden Celsius. In deze methode worden cellen gelabeld met DiO als FRET-donor en DiI als FRET-acceptor. Label de cellen opeenvolgend met DiO vloeibaar kristal nanodeeltje PEG cholesterol en DiI vrij zoals eerder beschreven.

Was na het kleuren de cellen één keer met twee milliliter DPBS met behulp van een serologische pipet en vervang dit door twee milliliter van de levende-cel-beeldgevingsoplossing. Beeld het levende-celmonster af op een microscooptafel die is uitgerust met een verwarmde incubatiekamer, gebruikmakend van een confocale microscoop met FRET-beeldvorming. Configureer het experiment voor intervallen van 30 minuten over een periode van vier uur door de DiO-donor te exciteren bij 488 nanometer en volledige emissiespectra te verzamelen van zowel de DiO-donor als de DiI-acceptor van 490 tot 700 nanometer, met een spectrale detector met 32 kanalen.

Bepaal vervolgens de tijdgevoelige emissie-intensiteit van zowel de DiO-donor als de DiI-acceptor uit cellen die zijn gekleurd met DiO vloeibaar kristal nanodeeltje PEG-cholesterol en DiI. Bereken tot slot de tijdgevoelige acceptor-donor FRET-ratio voor de beelden zoals beschreven in het tekstprotocol. Vrij DiO hoopt zich aspecifiek op in het celinterieur, in plaats van in de plasmamembranen van de cellen die zijn tegengekleurd met een dubbel gelabeld membraanfosfolipide.

Dit kan worden gevisualiseerd met de samengevoegde beelden. Omgekeerd labelt het DiO vloeibaar-kristallijne nanodeeltje PEG-cholesterol specifiek alleen het plasmamembraan van de cel, zoals gevisualiseerd door colokalisatie met het dubbel gelabelde membraanfosfolipide. FRET bevestigt de partitioning van DiO vanuit het vloeibaar-kristallijne nanodeeltje naar de lipide dubbellaag van het membraan door een waargenomen toename in energieoverdracht van de DiO-donor naar de DiI-acceptor.

FRET tussen DiO en DiI, evenals veranderingen in de emissie van DiO en DiI, bevestigen een toename van FRET van DiO naar DiI als functie van de tijd. De DiO vloeibaar-kristallijne nanodeeltjes PEG-cholesterol-nanodeeltjes vertonen minimale cytotoxiciteit met een levensvatbaarheid van 90 procent, vergeleken met een aanzienlijke toxiciteit voor vrij DiO bij een levensvatbaarheid van ongeveer 50 procent. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u vrachtgeladen vloeibaar-kristallijne nanodeeltjes kunt synthetiseren, deze kunt biofunctionaliseren voor cellulaire targeting en de vrachtgeladen cellen kunt imagen om een succesvolle cellulaire aflevering vast te stellen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de specifieke aflevering van DiO vanuit een waterige oplossing naar het plasmamembraan een aanzienlijke uitdaging vormt. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode nadat we het platform van vloeibaar-kristalnanodeeltjes hadden gebruikt voor de cellulaire aflevering van het antikankermiddel doxorubicine, en de mogelijkheid ervan zagen om de kinetiek van de cellulaire opname van het geneesmiddel te moduleren. Volgens deze procedure kan deze aanpak worden geïmplementeerd voor de cellulaire aflevering van een breed scala aan hydrofobe vrachten die een specifieke uitdaging vormen wat betreft hun aflevering aan cellen vanuit waterige media.

Deze benadering kan worden aangewend om een efficiëntere afgifte te bereiken van membraantargeted geneesmiddelen en bioactieve moleculen, zoals spanningsgevoelige kleurstoffen voor hersenbeeldvorming of fotodynamische geneesmiddelen voor fotonisch ondersteunde medicijntherapie.