Name: Een Ex Vivo Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Leer een ex vivo methode voor time-lapse imaging van rattenmesenterium om microvasculaire netwerkremodellering en endotheelcelinteracties te bestuderen. Deze techniek maakt real-time observatie van intacte bloedvaten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 aan WLM en het Tulane Center for Aging. We willen Matthew Nice bedanken voor zijn hulp bij het bewerken van de protocoltekst.

Alle dierproeven en procedures werden goedgekeurd door de Tulane University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Chirurgische Procedure Setup <ol><li> Autoclaaf instrumenten, chirurgische benodigdheden, en cultuur levert voorafgaand aan de operatie. Chirurgische benodigdheden voor elke rat omvatten: 1 laken, 1 laken met voorgesneden gaten (0,5 in x 1,5 in) in het midden, gaasjes, en 1 absorberende onderlegger. Chirurgische instrumenten omvatten: 1 scalpel met een aantal 10 mes 2 paar pincetten en een paar fijne schaar. Cultuur leveringen omvatten: 1 laken, 1 pincet en bereid 6-wells plaat inzetstukken met polycarbonaat filters. </li><li> Steriliseren een plexiglas-platform, een chirurgische podium en een chirurgische benchtop ruimte met 70% ethanol. Houd de chirurgische fase in een steriele kom tot gebruik. <ol><li> Een chirurgische fase door het boren van een ongeveer 2 door 1 in het gat in het midden van een 100 mm kweekschaal. Vervolgens gebruikt schuurpapier te gladscherpe randen en voeg een laag siliconen lijm randen het gat om een ​​verhoogd oppervlak van het weefsel creëren. </li><li> Alternatief ontwerp van de chirurgische fase CAD software en maak met 3-D afdrukken (figuur 1). </li></ol></li><li> Plaats een steriele absorberende onderlegger beneden en leggen een plexiglas platform op de top van het. Leg het laken, zonder pre-cut gat, over een verwarmde pad naast het absorberende onderlegger. </li><li> Voorverwarmen steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), media en zoutoplossing tot 37 ° C. Plaats media en PBS in aparte cultuur gerechten boven op de verwarming pad en plaats zoutoplossing in een 50 ml conische buis naast de chirurgische setup. </li><li> Controleer alle pakketten voorafgaand aan het begin van de operatie geopende steriele afhandeling van alle materialen garanderen. Een volledige lijst van de gemeenschappelijke instrumenten die in deze procedure zijn opgenomen in de Tabel van specifieke chirurgische materialen en gereedschappen. </li></ol> 2. Mesentery Tissue Oogsten <ol><li> mannelijke Wistar ratten gebruikt volwassene (350 ± 25 g; 6-8 weken oud). Andere stammen en leeftijden ratten kan worden vervangen. </li><li> Verdoven de rat via een intramusculaire injectie van ketamine (80 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (8 mg / kg lichaamsgewicht). Bevestig de rat onder verdoving door knijpen tussen de tenen om te controleren of een reflex reactie; moet er niet zijn. Preventieve analgesie voor deze terminal procedure is niet noodzakelijk. </li><li> Scheer de buikstreek en verwijder de resterende haar met behulp van ontharingscrème. Veeg buikhuid tweemaal met 70% isopropylalcohol, gevolgd door povidonjood. Voor de doekjes moet de chirurg vanaf het midden van de operatieplaats en naar de buitenkant van de geprepareerde zone in een cirkelvormige wijze dat geen gebieden die eerder geschrobd met hetzelfde stuk steriel gaas of steriel wattenstaafje overlappen. Vervolgens transfer dier naar een steriele chirurgische opstart en plaats boven het plexiglas platformulier. </li><li> Met behulp van een scalpel, maken in 0,75 - 1,25 in incisie in de darm vanaf 1 hieronder het borstbeen. Zorg ervoor dat u de darm of mesenterium (1 laag van de huid, 1 laag van bindweefsel, en 1 laag van de spier) doorprikken. </li><li> Plaats een laken met een voorgesneden gat over de incisie en plaats een steriele chirurgische fase boven het doek. Zorg ervoor dat de opening is uitgelijnd met de incisie. Gebruik steriele wattenstaafje applicators te vinden en trek de dunne darm door de chirurgische fase opening. </li><li> Trek 6-8 mesenteriale ramen door middel van het podium met behulp van wattenstaafje applicators, en wees voorzichtig niet om de ramen (figuur 1) te raken. Weefsels worden typisch geoogst uit het ileum gebied van de dunne darm te beginnen bij de blindedarm. Houd blootgestelde weefsels vochtig opgewarmd steriele zoutoplossing behoefte behulp van een steriele injectiespuit aan de oplossing druppelen. </li><li> Euthanaseren de rat via intracardiale injectie van pentobarbital natrium (0,2 ml per rat). Voordat u mijsenteric ramen, zorgen voor de rat wordt gedood door palpatie van het hart; Er mag geen puls. </li><li> Verwijder gewenste mesenterium weefsels met behulp van een pincet om het vet pad en fijne schaar om het venster te snijden te grijpen. Reactie rand vet (2 mm) rondom het venster. Was weefsels eenmaal in verwarmde steriele PBS en een keer in de media. </li><li> Terug geëxterioriseerde ileum naar de buikholte en afvoeren van dieren volgens de institutionele richtlijnen. </li></ol> 3. Mesenterium Tissue Culture voor Time-Lapse Studies <ol><li> Transfer geautoclaveerd cultuur supplies (zie paragraaf 1.1) en weefsels in een steriele laminaire stroming kap. </li><li> Gebruik een pincet om elk weefsel over te dragen bovenop een polycarbonaat filter membraan. Grab weefsels door het vet pad om te voorkomen dat schade aan de bloedvaten. </li><li> Verspreidde zich snel het weefsel met behulp van het vet pad, zorg dat het raam niet aan te raken. Inverteer het inzetstuk met het weefsel in de bodem van een 6-wells plaat en dek af met 3 ml medium (figuur 1 </strong&gt;). Typische media gebruikt voor deze procedure omvat Minimum Essential Media (MEM) met 1% penicilline streptomycine (Penstrep) en 10% foetaal runderserum (FBS). Media kunnen worden aangevuld met andere serums en / of groeifactoren angiogenese stimuleren. </li><li> Herhaal stap 3,2-3,3 voor elk weefsel en kweek incubator in standaard condities (5% CO2, 37 ° C) gedurende 5 dagen. </li></ol> 4. Time-lapse beeldvorming van Mesenterium Tissue <ol><li> Op de dag van imaging vult deze media in elk putje met geconjugeerde BSI-lectine en incubeer onder standaard kweekomstandigheden gedurende 30 min. Was weefsels tweemaal met lectine-vrije media. BSI-lectine vlek zichtbaar blijven op het mesenterium weefsel tot 3 dagen in kweek. </li><li> Breng de plaat naar een microscoop podium. Identificeer bloed- en lymfevaten basis van hun morfologie en netwerkstructuur. </li><li> Zoek een gewenste netwerk gebied op elk weefsel en foto&#39;s te nemen. Let op de imagingplaats naar dezelfde regio te waarborgen zullen worden vastgelegd voor de volgende beelden. Bij gebruik van een gemotoriseerde podium, het document van de coördinaten. </li><li> Terug weefsels naar de incubator en blijven om de cultuur tot de gewenste eindpunt. Herhaal stap 4,1-4,3 indien nodig afhankelijk van de gewenste experimentele tijdstippen. </li></ol> 5. Tissue immunokleuring <ol><li> BSI-lectine Labeling <ol><li> Incubeer weefsels gedurende 30 min bij 37 ° C met 1:40 FITC-geconjugeerd lectine in media (2,5 ml antilichaamoplossing per putje in 6-well plaat) gevolgd door twee spoelingen met media. Voor spoelingen, voeg media en dan meteen vervangen. </li></ol></li><li> Live / Dead Labeling <ol><li> Incubeer weefsels gedurende 10 min bij 37 ° C met 1: 500 2 mM ethidium homodimeer-1 en 1: 500 1 mM calceïne AM in media (2,5 ml antilichaamoplossing per putje in 6-well plaat) gevolgd door twee spoelingen met media. </li></ol></li><li> BSI-lectine / NG2 Labeling <ol><li> Spread weefsels op een microscoop gleede (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden. </li><li> Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min). </li><li> Voor primaire antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 konijn polyklonaal antilichaam NG2 en 5% normaal geit serum (NGS). Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min). </li><li> Voor secundair antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 geit anti-konijn CY2-geconjugeerd antilichaam (GAR-CY2) en 5% NGS. Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min). </li><li> Incubeer weefsels gedurende 30 min bij kamertemperatuur met FITC-geconjugeerd 01:40 lectine in PBS, gevolgd door twee spoelingen met PBS. Voor spoelen, voeg PBS en dan meteen vervangen. </li><li> Om de dia&#39;s te monteren, te dekken weefsels met 50:50 PBS en glycerol-oplossing en plaats dekglaasje op de top. Dicht de dia randen met behulp van nagellak. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM Labeling<ol><li> Verspreid weefsels op een microscoopglaasje (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden. </li><li> Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Voor primaire antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 200 monoklonaal gebiotinyleerd CD31 antilichaam en 1: 100 konijn polyklonaal LYVE-1 antilichaam in PBS + 0,1% saponine + 2% runderserumalbumine (BSA) + 5% NGS . Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Voor secundair antilichaam labeling, incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 500 Cy3 geconjugeerd streptavidine antilichaam en 1: 100 GAR-CY2 in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Als u dia&#39;s, cover weefsels monteren met 50:50 PBS en glycerol oplossing en plaats een dekglaasje op de top. Dicht de dia randen met behulp van nagellak. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lectine Labeling <ol><li> Voeg 1 mg / ml BrdU media en vervang weefsel media met BrdU oplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Verspreid weefsels op een microscoopglaasje (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden. </li><li> Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min). </li><li> Denatureren weefsel DNA in 2 M HCl gedurende 1 uur bij 37 ° C. Wassen weefsels in PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Voor primaire antilichaam labeling, incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 monoklonale muizen anti-BrdU in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Voor secundair antilichaam labeling, incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 geit anti-muis Cy3-geconjugeerd antilichaam (GAM-Cy3) in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li&gt; Incubeer weefsels gedurende 30 min bij kamertemperatuur met FITC-geconjugeerd 01:40 lectine in PBS, gevolgd door twee spoelingen met PBS. </li><li> Als u dia&#39;s, cover weefsels met 50:50 PBS en glycerol-oplossing en plaats dekglaasje op de top te monteren. Dicht de dia randen met behulp van nagellak. </li></ol></li><li> BSI-lectine / CD11b etikettering <ol><li> Verspreid weefsels op een microscoopglaasje (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden. </li><li> Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Voor primaire antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 muizen anti-rat CD11b in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Voor secundair antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 GAM-Cy3 in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen met PBS weefsels+ 0,1% saponine (3 x 10 min). </li><li> Incubeer weefsels gedurende 30 min bij kamertemperatuur met FITC-geconjugeerd 01:40 lectine in PBS, gevolgd door twee spoelingen met PBS. </li><li> Als u dia&#39;s, cover weefsels met 50:50 PBS en glycerol-oplossing en plaats dekglaasje op de top te monteren. Dicht de dia randen met behulp van nagellak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+forces+control+endothelial+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li>
<li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582(2012).</li>
<li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li>
<li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li>
<li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).</li>
<li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16989723">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108(2013).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7(2012).</li>
<li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li>
<li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shear+stress%2C+angiogenesis%2C+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li>
<li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol documenteert een methode voor het gebruik van de rat mesenterium cultuur model als een ex vivo tool voor time-lapse beeldvorming van de groei microvasculaire netwerk. Contract in ons laboratorium is het gebruik van onze model 1) angiogenese 8, 2) lymfangiogenese 8, 3) pericyte-endotheelcelinteracties 8 en 4) anti-angiogene drug testen 9 ingesteld. De mogelijkheid voor het afbeelden gekweekte rat mesenter...

Microvasculaire netwerk groei en hermodellering gemeenschappelijke kenmerken voor weefselfunctie, wondgenezing en meerdere pathologieën en een sleutelproces is angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe bloedvaten uit bestaande 1, 2. Voor tissue engineering van nieuwe vaten of ontwerpen angiogene therapieën, het begrijpen van het belang van de cellulaire dynamiek betrokken bij angiogenese cruciaal. Dit proces is complex. Het kan variëren op specifieke locaties binnen een microvasculaire netwerk en omvat meerdere celtypen (bijvoorbeeld endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, macrofagen, stamcellen) en meerdere systemen (lymfatische netwerken en neurale netwerken). Hoewel in vitro modellen enorm hebben bijgedragen aan onderzoek naar het verband tussen de verschillende cellen die betrokken zijn bij angiogenese 3, kunnen hun fysiologische relevantie worden ondermijnd als gevolg van thei<html> r beperkte complexiteit en het feit dat zij niet nauw weerspiegelen een in vivo scenario. Om deze beperkingen driedimensionale kweek te overwinnen 3, ex vivo weefselmodellen 4, microfluïdische systemen 5, 6 en 7 rekenmodellen ontwikkeld en in de afgelopen jaren. Er is echter nog steeds behoefte aan een model met time-lapse vermogen om angiogenese in intacte microvasculaire netwerken ex vivo te onderzoeken. De oprichting van de nieuwe time-lapse modellen voor angiogenese studies met dat niveau van complexiteit zal een waardevol instrument om de onderliggende mechanismen tot regeling van angiogenese te begrijpen en om therapieën te verbeteren. Een potentiële model dat de ex vivo onderzoek naar angiogenese over een intacte microvasculaire netwerk mogelijk maakt is de rat mesenterium cultuur model&gt; 8. In recent werk, hebben we aangetoond dat bloed en lymfestelsel microvasculaire netwerken levensvatbaar na cultuur blijven. Wat nog belangrijker is, kan de rat mesenterium cultuur model gebruikt worden om functionele pericyte-endotheliale cel interacties, het bloed en lymfatische endotheelcellen verbindingen, en time-lapse imaging onderzoeken. Het doel van dit document is ons protocol voor de time-lapse imaging werkwijze. De representatieve resultaten documenteren de verschillende celtypen die levensvatbaar blijft na stimulatie van angiogenese met serum en bieden voorbeelden van deze methode voor het kwantificeren weefselspecifieke angiogene responsen en endotheelcel tracking studies.

<table><tbody><tr><td>Drape</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12&rdquo; x 12&rdquo; Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-9843</td><td>Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length</td></tr><tr><td>Sterile Surgical Blade</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Stainless Steel; Size 10</td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (curved tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (straight tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5130</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length</td></tr><tr><td>Noyes Micro Scissor</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length</td></tr><tr><td>Gauze Pads</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply</td></tr><tr><td>Cotton-Tippled Applicators</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only</td></tr><tr><td>6-Well Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic</td></tr><tr><td>Sterile Syring 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>Sterile Bowl</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use</td></tr><tr><td>6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6-Well Plate Inserts; Non-Sterile</td></tr><tr><td>Polycarbonate Filter Membrane</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0&nbsp;&micro;m, 47&nbsp;mm, White Plain</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Besteld bij MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Actief ingrediënt: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital natrium, 50 mg fenytoïne natrium&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Fort Dodge Animal Health (Besteld bij MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (Besteld bij MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Jodium</td><td>Operand</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd Lectine</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Chondroitinesulfaatproteoglycaan Antilichaam</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Antilichaam</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Cy2-geconjugeerd Antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Cy3-geconjugeerd Antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine Cy3-geconjugeerd Antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viabiliteit/Cytotoxiciteit Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Normaal Geitenserum&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaal Muis Anti-Bromodeoxyuridine&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Clone Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Muis Anti-Rat CD11b&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

een<em&gt; ex vivo</em&gt; methode voor time-lapse imaging van gekweekte rat mesenteriale microvasculaire networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande vaten, omvat endotheelcellen, pericyten, gladde spiercellen, immuuncellen en de coördinatie met lymfevaten en zenuwen. De meercellige, multi-gebruikersinvoer noodzakelijk het onderzoek naar angiogenese in een fysiologisch relevante omgeving. Terwijl dus het gebruik van in vitro celcultuur modellen mechanistische inzichten verschaft een gemeenschappelijke kritiek is dat ze niet de complexiteit geassocieerd met microvasculaire netwerk recapituleren. Het doel van dit protocol is de mogelijkheid om time-lapse vergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken voor en na angiogenese stimuleren in gekweekte rat mesenterium weefsels aangetoond. Gekweekte weefsels bevatten microvasculaire netwerken die hun hiërarchie te handhaven. Immunohistochemische labeling bevestigt de aanwezigheid van endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, bloedvaten en lymfevaten. In eenddition, het labelen van weefsels met BSI-lectine maakt time-lapse vergelijking van lokale netwerk regio&#39;s voor en na het serum of groeifactor stimulatie gekenmerkt door verhoogde capillaire kiemen en vaatdichtheid. In vergelijking met gewone celcultuur modellen, deze methode biedt een instrument voor endotheelcellen lineage studies en weefsel specifieke angiogene evaluatie drug in fysiologisch relevante microvasculaire netwerken.

Na 3 dagen kweek werden weefsels gelabeld met een levende / dode levensvatbaarheid / cytotoxiciteit kit om de levensvatbaarheid van de microvasculatuur in de rat mesenterium cultuurmodel (Figuur 2A) tonen. De meeste cellen aanwezig in het mesenterium stand bleef in de cultuur waar endotheelcellen werden geïdentificeerd op basis van hun locatie in microvasculaire segmenten. Endotheliale celproliferatie werd ook bevestigd door lectine / BrdU labeling (Figuur 2D).</...

Angiogenese omvat interacties tussen meerdere cellen en systemen die onderzocht moeten worden in een fysiologisch relevante omgeving. Het doel van deze studie is om de capaciteit van het kweekmodel van de rat mesenterium te demonstreren om tijdsverloopvergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken tijdens angiogenesis te maken.

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Het algemene doel van dit experiment is om het gebruik van het mesenteriële cultuurmodel van de rat te demonstreren voor time-lapse onderzoek naar de ex vivo remodellering van het microvasculaire netwerk, om interacties tussen parasieten en endotheelcellen, verbindingen tussen bloed- en lymfatische endotheelcellen, of de effecten van anti-angiogene geneesmiddelen te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van microvasculaire remodellering, waaronder hoe microvasculaturen weten waar ze moeten groeien en wat het lot is van endotheelcelsegmenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat echte, intacte microvasculaire netwerken ex vivo vóór en na de groei kunnen worden afgebeeld.De procedure wordt gedemonstreerd door Sadegh Azimi, een promovendus in ons laboratorium die de methode heeft ontwikkeld. Begin met het plaatsen van een met ethanol gesteriliseerd plexiglasplatform op een steriel, absorberend onderlegdoek en plaats een geanestheseerde volwassen mannelijke rat op het platform. Desinfecteer het geschoren buikgebied van de rat met twee wipes met 70% isopropylalcohol, gevolgd door povidonjodium.Maak met een scalpel, beginnend ongeveer 2,5 cm onder het borstbeen, een incisie van 2 tot 3 cm in de darm door de huid, het bindweefsel en de spieren. Plaats vervolgens een afdekdoek met een voorgesneden gat over het dier en plaats een chirurgisch plateau over de afdekdoek, waarbij u erop let dat de openingen in beide materialen zijn uitgelijnd met de incisie. Trek met steriele wattenstaafjes het ileum samen met zes tot acht mesenteriale vensters door de opening van het chirurgisch plateau.Gebruik een steriele spuit om indien nodig steriele zoutoplossing van 37 °C op de blootgestelde weefsels te druppelen. Wanneer alle vensters naar buiten zijn gebracht, gebruik dan een pincet om een vetkussentje vast te pakken en een schaar om de vensters te oogsten, waarbij een vetrand van twee millimeter rond elk mesenteriaal weefsel wordt gelaten. Let erop dat de pincet de mesenteriale vensters niet raakt door uitsluitend de omliggende vetranden aan te raken.Was elk venster eenmaal in PBS bij 37 °C en eenmaal in medium bij 37 °C terwijl deze worden verzameld. Plaats het ileum terug in de buikholte nadat alle vensters zijn geïsoleerd. Gebruik in een steriele laminaire flowkast een pincet om elk stuk mesenteriaal weefsel bij de vetrand over te brengen naar het polycarbonaatfiltermembraan van een celkweekplaat-insert.Gebruik het vetkussentje om de weefselmonsters snel uit te spreiden, waarbij u er op let dat de vensters niet worden aangeraakt. Keer vervolgens de insert om en plaats deze in één put van een zes-wellplaat, zodat het weefsel plat op de bodem van de put ligt. Bedek het weefsel met drie millimeter medium en breng de overige vensters op dezelfde wijze over naar de plaat.Kweek vervolgens de mesenteriële vensters onder standaardcondities in een weefselkweekincubator gedurende maximaal vijf dagen. Voeg op de dag van beeldvorming geconjugeerd BSI-lectine toe aan de culturen en plaats de plaat terug in de incubator. Was de monsters na 30 minuten twee keer met lectinevrij medium en breng de plaat over naar de tafel van een fluorescentiemicroscoop.Identificeer de bloed- en lymfevaten op basis van hun morfologie en netwerkstructuren. Lokaliseer vervolgens een netwerkregio van belang op elk weefsel om beelden te verkrijgen, waarbij u de locatie noteert om ervoor te zorgen dat dezelfde regio in opeenvolgende beelden wordt vastgelegd. Wanneer alle beelden zijn verkregen, plaatst u de monsters terug in de incubator tot de volgende imaging-sessie of het betreffende experimentele eindpunt.Na drie dagen in cultuur zijn de meeste cellen in het mesenterium levensvatbaar, waarbij de aanwezigheid van endotheelcellen is bevestigd door hun locatie in de microvasculaire segmenten. Endotheelcelproliferatie kan daarnaast worden bevestigd via lectine/BrdU-labeling, terwijl de aanwezigheid van gladde spiercellen en parasieten langs de vaten kan worden bevestigd met NG2-labeling. Labeling van het vertakkende lymfatische en bloed-microvasculaire netwerk bevestigt verder het behoud van het lymfatische cel-fenotype in het gecultiveerde weefsel.Aanvulling van het kweekmedium voor weefselcultuur in het mesenteriaalvenster met 10% serum gedurende drie dagen induceert een robuuste angiogene respons, waarbij nieuwe vaatsegmenten en capillaire uitlopers worden geïdentificeerd na vijf dagen stimulatie. Time-lapse imaging maakt kwantificatie mogelijk van het aantal vaten per vasculair gebied en het aantal capillaire uitlopers per vasculair gebied op basis van één 4x-beeld per weefsel. Time-lapse vergelijkingen van netwerkregio's maken daarnaast het volgen van endotheelcelsegmenten en de identificatie van afwijkende patroonvorming van bloed- en lymfevaten mogelijk.Verder bevestigt lectine- en Cd11b-labeling aanvullend de aanwezigheid van interstitiële residente macrofagen in de remodelleringsnetwerken. Eenmaal onder de knie, zou deze techniek in minder dan vier uur voltooid kunnen worden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u rattenmesenteriaal weefsel oogst, kweekt en via time-lapse imaging in beeld brengt.

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

Dit artikel beschrijft een eenvoudig model voor het stimuleren angiogenese in de rat mesenterium. Het model produceert dramatische toename in capillaire kiemen, vasculaire gebied en vasculaire dichtheid over een relatief korte tijd cursus in een weefsel die het mogelijk maakt en face visualisatie van hele microvasculaire netwerken tot in de enkele cel niveau.

Rat mesenterium uittreding: een model voor het onderzoeken van de Cellular Dynamics betrokken bij het Angiogenese

Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

De gemodificeerde Landis-techniek maakt gepaarde meting mogelijk van de hydraulische geleidbaarheid van individuele microvaten in de mesenterium van normale en genetisch gemodificeerde ratten onder controle- en testomstandigheden met behulp van microperfusietechnieken. Het biedt een handige methode om mechanismen te evalueren die de doorlaatbaarheid van microvaten en transvasculair uitwisseling onder fysiologische omstandigheden reguleren.

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.

In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen

Dit protocol presenteert een methode voor het induceren van mesenteriale ischemie-reperfusieschade en het visualiseren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in mesenteriale venulen met behulp van intravitale microscopie. De bloedstroom in de superieure mesenteriale slagader werd gedurende 1 uur beperkt, gevolgd door reperfusie, waardoor directe kwantificering van leukocytenadhesie en NETosis mogelijk was.

Visualisatie van extracellulaire neutrofiele vallen in mesenteriale venulen na mesenteriale ischemie-reperfusieschade via intravitale microscopie

Leer een ex vivo methode voor time-lapse imaging van rattenmesenterium om microvasculaire netwerkremodellering en endotheelcelinteracties te bestuderen. Deze techniek maakt real-time observatie van intacte bloedvaten mogelijk.

Een

Meer video's verkennen