Name: QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een Drug Resistance Gene te identificeren Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Leer QTL-mapping en CRISPR/Cas9-genoombewerking om een geneesmiddelresistentiegen in Toxoplasma gondii te identificeren. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van genetische mechanismen van resistentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag L. David Sibley en Asis Khan bedanken voor hun bijdrage aan de oorspronkelijke publicatie waarop deze protocollen zijn gebaseerd. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health subsidie ​​AI108721.

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Deze protocollen presenteren verschillende methoden die, wanneer gecombineerd, de identificatie van een geneesmiddelweerstandgen in T. gondii mogelijk maken . Twee in het bijzonder waren integraal voor het project, de relatief gekruide methode van QTL mapping en de recent ontwikkelde methode van CRISPR / Cas9 gen editing. Lander en Botstein publiceerden hun invloedrijke papier in 1989 en tonen QTL-mapping die genetische loci met fenotypen 36 correleren. Meer recent in 2012 beschreef Dounda en Charpentier het CRISPR / Cas9-bewerkingssysteem in Streptococcus pyogenes 22 die snel in verschillende modellen werd aangepast als een genetisch instrument, waaronder T. gondii 13 , 17 . Beide methoden waren hier nuttig, waar QTL-mapping de locus definieerde die de resistentiemutatie van de drug bevat die uiteindelijk werd geïdentificeerd met behulp van WGS-gebaseerde SNP-detectie, en CRISPR / Cas9-editing leverde mij de<html> Ans om te bevestigen dat SNR1 het genotype drug resistentie gen is. De ME49-FUDR r X VAND-SNF r kruis 8 werd oorspronkelijk ontwikkeld om een ​​virulentie fenotype 19 te ondervragen, maar de ouderlijke stammen bleken ook een additioneel fenotypisch verschil te hebben waarvoor het causaal gen niet bekend was, de ontstekingsweerstand in de VAND-ouder. Dit wijst op een voordeel van kruisen doordat ze opnieuw kunnen worden herhaald wanneer er extra fenotypische verschillen in de ouders worden waargenomen. Dit was het geval voor een ander Toxoplasma kruis, type 2 x type 3, waar meerdere genen betrokken bij virulentie werden gevonden door meerdere fenotypes 37 , 38 , 39 , 40 te mappen. Tot op heden zijn vier verschillende T. gondii crosses beschreven en gebruikt om genen die verantwoordelijk zijn voor fenotypen te plannenSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , die alle mogelijkheden hebben om opnieuw te gebruiken om nieuwe fenotypes te plannen waarvoor de genetische basis onbekend is. Langs deze lijnen zijn de genen voor 62 T. gondii stammen die de bekende wereldwijde genetische diversiteit vertegenwoordigen, gehersequentieerd 43 . Er kunnen nieuwe kruisingen worden gemaakt van dit zwembad voor stammen die verschillen in interessante fenotypen. Het hebben van de voordelen van QTL-mapping is uitgesproken, dat het genereren van een kruis geen kleine onderneming is. Er zijn andere methoden die kunnen worden gebruikt om causale genen te identificeren. Een krachtige techniek maakt gebruik van chemische mutagenese om mutanten te creëren die voor fenotypen kunnen worden gescreend. Om het causale gen te vinden kunnen mutanten complementair zijn met kosmide bibliotheken 44 of genoom resequencing methoden kunnen worden gebruikt om de causale mutatie 45 te vinden . Voor moZie hiervoor twee JoVE-artikelen van Coleman et al. En Walwyn et al. Dat beschrijven deze benaderingen 46 , 47 . Veel van de stappen die leiden tot de identificatie van de causale SNF r mutatie (Protocols 2 en 3) zijn gebaseerd op berekeningsmethoden die worden uitgevoerd met software die vrij beschikbaar is voor academisch gebruik. Gedetailleerde commando&#39;s voor elke stap worden verstrekt en als de run met de juiste bestanden wordt uitgevoerd, kan de gebruiker de datasets die nodig zijn om de causale SNF r SNP te vinden opnieuw maken. Houd er rekening mee dat sommige van de syntaxis in de commando&#39;s verwijzen naar bestandsnamen of directorystructuur ($ PATH) die kan worden aangepast aan de gebruikers voorkeur. Hoewel de commando&#39;s die hier gegeven worden, zeker niet uitwerken hoe u een kruis kunt analyseren met QTL-analyse en WGS-gebaseerde SNP-identificatie, zijn ze uitgebreid genoeg om het experiment te herhalen dat in dit artikel wordt beschreven en moet de gebruiker worden m<html> Erts bekend zijn met hoe deze benaderingen worden gebruikt in een stap voor stap mode. Hoewel QTL mapping en WGS sequentie gebaseerde SNP detectie voldoende waren om een ​​kandidaat SNF r gen te identificeren, zijn aanvullende experimenten nodig om zijn rol in drug resistentie te bevestigen. Dit kan overtuigend getoond worden door middel van genafbreking of knock-out technieken, die beide kunnen worden bereikt met behulp van CRISPR / Cas9 genbewerking. Gedetailleerde methoden voor het gebruik van CRISPR / Cas9 om indel mutaties te genereren of transgene constructen in een doelgen in T. gondii in te voeren, worden gegeven. De targeting specificiteit die CRISPR / Cas9 biedt, verhoogt de efficiëntie van genbewerking over traditionele methodes. Ook deze verhoogde efficiëntie heeft het mogelijk gemaakt om niet-laboratorium aangepaste stammen te gebruiken voor genetische studies die eerder moeilijk waren om 13 te wijzigen. Alhoewel CRISPR / Cas9 in zijn kinderschool al is gebruikt om genverstoringen te veroorzakenLass = &quot;xref&quot;&gt; 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , merk genen 17 en maak gene knockouts 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 in T. gondii , veelbelovend om een ​​handig hulpmiddel te zijn Voor veel andere studies in de toekomst. De ontdekking dat de SNR1- inactivatie leidt tot sinfungine resistentie maakt de SNR1 locus een veelbelovende plaats voor transgene insertie of genetische complementatie. Om het succes van het gebruik van CRISPR / Cas9 gemedieerde gen targeting te optimaliseren om de integratie van transgen in het SNR1 locus te leiden, dienen de volgende aspecten te worden overwogenRood tijdens het experimentele ontwerp. Ten eerste wordt een selectiemarkering aanbevolen om in het transgene constructie opgenomen te worden om de efficiëntie van de spanconstructie te verhogen. Als er een selectie marker is opgenomen, kunnen zowel positieve als negatieve selectie worden gebruikt, waardoor bijna 100% van de dubbel geselecteerde parasieten transgenic zijn met de GOI die op de SNR1 locus is geïntegreerd. Als het transgene construct echter geen aanvullende selecteerbare eigenschappen bevat en afhankelijk is van negatieve selectie op het SNR1 locus, hangt het efficiëntie van succesvolle transgenese grotendeels af van de efficiëntie van cotransfectie van het CRISPR-plasmide en het transgene construct. Ten tweede, hoewel CRISPR / Cas9 gemedieerde site-specifieke integratie van een niet-homologe DNA-fragment vaak gebruikt wordt voor complementatie en transgenese, moet opgemerkt worden dat de oriëntatie van insertie niet kan worden gewaarborgd in zulke gevallen als beide richtingen mogelijk zijn. Dit kan problemen veroorzakenMs voor sommige toepassingen. Bijvoorbeeld, om een ​​mutant aan te vullen met verschillende gen allelen, is het moeilijk om ervoor te zorgen dat alle allelen in dezelfde oriëntatie worden ingevoegd, en afwijkingen in oriëntatie kunnen expressieverschillen veroorzaken. Voor dit type applicatie worden DNA-constructies met sequenties die homologe zijn aan de SNR1 locus, aanbevolen, die de juiste integratie oriëntatie zullen aandrijven ( Figuur 6 ). Ten derde, tijdens transfectie, is de verhouding tussen het CRISPR-plasmide en het transgene DNA-molecuul kritisch voor succesvolle transgene stamconstructie. Deze verhouding moet worden aangepast volgens de selectie strategieën. De volgende richtlijnen worden aanbevolen: 1) Als het transgene construct een geneesmiddelbestendige merker bevat en het bijbehorende geneesmiddel is de enige selectie die wordt gebruikt om transgene parasieten te genereren, dwz sinfungine wordt niet gebruikt, wordt de voorgestelde molverhouding tussen het transgene construct en het CRISPR-plasmaId is 1: 5. Het gebruik van meer CRISPR-plasmide verhoogt in dit geval de kans dat parasieten die het transgene construct ontvangen, ook het CRISPR-plasmide ontvangen. Daarom zijn de medicijnbestendige parasieten waarschijnlijker de markering op de CRISPR-targeting site geplaatst. Als de verhouding omgekeerd wordt, krijgen de meeste parasieten die het transgene construct ontvangen, het CRISPR-plasmide niet. Als gevolg daarvan krijgen de overgrote meerderheid van geneesmiddelbestendige parasieten het transgene construct door willekeurige integratie die niet verband houdt met CRISPR / CAS9-gemedieerde plaatsspecifieke insertie. 2) Als het transgene construct een geneesmiddelbestendige merker bevat en het overeenkomstige geneesmiddel wordt gebruikt samen met sinfungine om transgene parasieten te selecteren, is de voorgestelde molverhouding tussen het transgene construct en het CRISPR-plasmide 1: 1. Deze strategie biedt de hoogste efficiëntie van transgene stamconstructie. 3) Als het transgene construct geen selecteerbare maker bevat, vertrouwt u op negatieve selectieDoor alleen sinfungine om transgene parasieten te verkrijgen, is de voorgestelde molverhouding tussen het transgene construct en het CRISPR-plasmide 5: 1. De reden voor dit ontwerp is hetzelfde als in de eerste richtlijn hierboven. Aangezien zowel pyrimethamine als sinfungine werden toegepast voor selectie in protocol 5, werd de verhouding tussen DHFR * mini-gen en het SNR1- targetende CRISPR-plasmide ingesteld op 1: 1. Samen hebben de hier beschreven methodes een detailniveau dat niet mogelijk was in de originele publicatie die SNR1 2 identificeerde. Deze protocollen; Specifiek, de syntax van de opdrachtregel, de opeenvolgende indeling van de gebruikte programma&#39;s en het gebruik van CRISPR / Cas9 dienen toekomstige inspanningen te helpen om nieuwe genen die verantwoordelijk zijn voor fenotypes te identificeren.

Gastheerbereik bepaalt de omvang van de prevalentie van een parasieten. Sommige parasieten hebben zeer specifieke gastheerbehoeften die het gebied beperken waaruit zij zijn gevonden, anderen zijn generalisten. Een dergelijke generalist is Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Deze parasiet is wereldwijd gevonden, omdat het alle zoogdieren en veel vogels kan infecteren. Mensen zijn ook vatbaar en er wordt geschat dat ongeveer 1/3 van de wereldwijde bevolking is geïnfecteerd. Gelukkig controleert een robuuste immuunrespons normaal gesproken op de groei van de parasiet, maar in situaties waar het immuunsysteem in gevaar komt, kan de parasiet ongemarkeerd groeien en ziekte veroorzaken, vaak encefalische. Ook kan deze parasiet aangeboren ziekten veroorzaken als vroeger ongeïnfecteerde vrouwen tijdens de zwangerschap geïnfecteerd zijn, omdat ze immuungeheugen hebben om de verspreiding van de parasiet snel te beperken. Bovendien is er een last van oculaire toxoplasmose die kan leiden tot visieverlies 1 . Voor deze reasoNs T. gondii is uitgegroeid tot een focus van studie, en door de vele moleculaire methodes die zijn ontwikkeld voor zijn studie, een model voor Apicomplexan parasieten. Twee methodes die hier worden besproken, zijn de kwantitatieve tract locus (QTL) mapping en clustered regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / Cas9 genbewerking. QTL mapping en CRISPR / Cas9 editing zijn respectievelijk voorwaartse en omgekeerde genetische benaderingen die in eerdere studies zijn gebruikt om T. gondii virulence genen te identificeren en / of te karakteriseren. Hier worden deze methoden gecombineerd om de functie van een SNF-gen, TgME49_290860, en zijn orthologen (geannoteerd als SNR1 ) 2 te identificeren en te bevestigen. Hoewel T. gondii een grote verscheidenheid aan intermediaire gastheren kan infecteren, moet het de darmepitheelcellen van een felid doorvoeren en infecteren om de levenscyclus te voltooien. Katten zijn de definitieve gastheren van de parasiet waar de sExieke fasen worden geproduceerd en genetische recombinatie vindt plaats via meiose. Om een ​​QTL studie uit te voeren moet men een genetisch kruis creëren, en in het geval van Toxoplasma betekent dit dat twee verschillende parasietstammen verschillen in een fenotypische eigenschap, de ouderlijke vlekken, door een kat om recombinante nakomelingen te produceren 3 . Voordat de katten worden gevoed, worden de ouderlijke stammen bestand tegen afzonderlijke geneesmiddelen, zodat een efficiëntere identificatie van recombinanten door middel van dubbele drugselectie van de nakomelingen 4 mogelijk is . Voor dit doel zijn drie drugs gebruikt in T. gondii ; Fluorodeoxyribose (FUDR) waarvoor uracil fosforibosyltransferase ( UPRT ) het resistentie gen 5 is , adenosine arabinoside (ARA) waarvoor Adenosine Kinase ( AK ) het resistentie-gen 6 is , en sinfungine (SNF) waarvoor het resistiemene onbekend was 7 . Verscheidene genetische kruisen zijn geweestGecreëerd voor T. gondii , maar alleen de 24 nakomelingen van het ME49-FUDR r X VAND-SNF r kruis werden genotypeerd met behulp van genoom sequentiebepaling (WGS) 8 . Dit heeft de mogelijkheid geopend om het SNF-resistentiegen te gebruiken door het kruis te identificeren en te identificeren, aangezien de VAND-ouder door middel van chemische mutagenese van de geneesmiddel gevoelige VAND (VAND-SNF s ) stam genotypeerd werd en het VAND-referentiegenoom werd sequentieerd onder toepassing van de VAND- SNF s- stam waardoor de identificatie van alle polymorfismen tussen het nageslacht WGS en het VAND-SNF &#39;s referentiegenoom mogelijk is, met inbegrip van de erfelijke VAND-SNF r mutatie die een deel van de nageslacht resistente afkomst heeft gemaakt. Om het causaal enkel nucleotide polymorfisme (SNP) in het SNF r- nageslacht te identificeren, kunnen verschillende computergebaseerde open bronbronnen worden gebruikt om de data te analyseren. Om de genetische kaart voor de ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross de REDHORSE software suite 9 is ontwikkeld die gebruik maakt van WGS-uitlijning van de ouders en de nakomelingen om de genomische posities van genetische crossovers nauwkeurig te detecteren. Deze mapping informatie kan dan gecombineerd worden met de fenotypische data (SNF r in de nageslacht) om een ​​dataset te vormen die compatibel is met het &#39;qtl&#39; ​​pakket 10 in de R statistische programmeersoftware waar een QTL scan kan worden uitgevoerd om significante loci te correleren met de fenotype. Om het causale SNP in het QTL locus te identificeren, kunnen de WGS-lezingen van de nageslacht individueel uitgelijnd worden aan het sinfungin-gevoelig VAND-genoom met behulp van het Bowtie 2-uitlijningsprogramma 11, waarvan SNP&#39;s kunnen worden genoemd met behulp van het VarScan mpileup2snp variant-oproepprogramma 12 . Met behulp van deze SNP&#39;s kan de QTL locus vervolgens worden gescand voor polymorfismen die aanwezig zijn in de SNF r, maar nietIn de nageslacht van de SNF. Met het causale SNP geïdentificeerd in het coderende gebied van een gen, kan genetische modificatie van het kandidaat SNF r gen uitgevoerd worden in een SNF s stam om de drug resistentie functie te verifiëren. Het CRISPR / Cas9 genoom bewerkingssysteem is onlangs opgericht in Toxoplasma 13 , die belangrijke instrumenten heeft toegevoegd voor de verkenning van de complexe biologie van deze parasiet, met name voor genetische studies in niet-laboratorium aangepaste stammen. Door de zeer actieve non-homologous End Joining (NHEJ) activiteit in WT Toxoplasma cellen, is gerichte genoom modificatie moeilijk te bereiken, aangezien exogent geïntroduceerd DNA willekeurig geïntegreerd is in het genoom bij extreem hoge frequentie 14 . Om de succesfrequentie van locus-specifieke modificatie te verhogen, zijn verschillende benaderingen toegepast om de efficiëntie van homologe recombinatie te verhogen en / of te verminderenE NHEJ activiteit 15 , 16 . Een van deze benaderingen is het CRISPR / Cas9-systeem. Vergeleken met andere methoden is het CRISPR / Cas9-systeem efficiënt om site-specifieke wijzigingen in te voeren en is het gemakkelijk om 13 , 17 , 18 te ontwerpen. Daarnaast kan het in elke Toxoplasma stam gebruikt worden zonder extra modificatie aan de parasiet 13 , 19 . Het CRISPR / Cas9-systeem is afkomstig van het adaptieve immuunsysteem van Streptococcus pyogenes , die het gebruikt om de invasie van mobiele genetische elementen zoals fages 20 , 21 , 22 te verdedigen. Dit systeem maakt gebruik van het RNA-geleid DNA-endonuclease-enzym Cas9 om dubbelstrengs DNA-breuk (DSB) in het doel te introduceren, dat vervolgens wordt herhaaldAfkomstig van de foutgevoelige NHEJ om doelgenen te inactiveren door korte indel mutaties, of door homologie gerichte recombinatie om de target locus precies zoals ontworpen 23 , 24 te wijzigen . De target specificiteit wordt bepaald door een klein RNA molecuul genaamd single guide RNA (gRNA), die een individueel ontworpen 20 nt sequentie bevat die 100% homologie heeft op het doel DNA 22 . Het gRNA-molecuul bevat ook handtekeningen die worden herkend door Cas9, die de nuclease naar de doelplaats leiden, die een speciaal Protospacer-aangrenzend motief bevat (PAM, sequentie is &#39;NGG&#39;) 25 , 26 . Daarom werken het gRNA-molecuul en de PAM-sequentie samen om de Cas9-splitsingsplaats in het genoom te bepalen. Men kan de gRNA-sequentie gemakkelijk veranderen om verschillende sites voor splitsing te targeten. Toen het CRISPR / Cas9-systeem voor het eerst in Toxop werd ontwikkeldLasma, een enkel plasmide dat het Cas9 nuclease uitdrukt en het gRNA molecuul werd gebruikt om DSB op de targeting site 13 , 17 te introduceren. Het is aangetoond dat het CRISPR / Cas9 systeem de efficiëntie van plaatsspecifieke genoommodificatie drastisch verhoogt, niet alleen door homologe recombinatie maar ook niet-homologe integratie van exogeen DNA 13 . Dit doet dit in wildtype stammen die NHEJ activiteit bevatten. Daarom kan dit systeem in hoofdzakelijk elke Toxoplasma- stam gebruikt worden voor efficiënte genoombewerking. In een typisch experiment worden het doelspecifieke CRISPR-plasmide en het DNA-fragment dat gebruikt wordt om het doel te wijzigen co-transfecteerd in parasieten. Als het DNA-fragment dat gebruikt wordt om het doel te wijzigen, homologe sequenties bevat aan de doellocus, kan homologe recombinatie worden gebruikt om de DSB, die door CRISPR / Cas9 is geïntroduceerd, te repareren om nauwkeurige modificatie van het doel toe te staan. Aan de andere kant, als de intGerukt DNA fragment bevat geen homologe sequentie, het kan nog steeds geïntegreerd worden in de CRISPR / Cas9 targeting site. Deze laatste wordt vaak gebruikt om genen te verstoren door invoeging van selecteerbare markers of complementatie van mutanten op loci die negatieve selectie mogelijk maken 13 . Hier dient de SNR1 locus als voorbeeld om te laten zien hoe CRISPR / Cas9 kan worden gebruikt voor genverstoring en de generatie van transgene parasieten.

```html
<table><tbody><tr><td>T25 flasks</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii ME49 strain</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiVAND strain</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (No Sodium Bicarbonate)</td><td>Life Sciences</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS) Premium Grade</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper for Flasks</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Blunt needles 22 G x 1"</td><td>BRICO Products</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore Filter 3.0 &micro;m, 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok Filter Holder 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>The R Foundation</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr><tr><td>J/qtl</td><td>The Churchill Group</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>John Hopkins University</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr><tr><td>VarScan</td><td>Washington University, St Louis</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>MUMmer</td><td>JCVI &amp; Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54467</td><td>T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #59855</td><td>T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene</td></tr><tr><td>pUPRT::DHFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>Template for DHFR* mini gene</td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triposhpate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathione (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Electroporation System</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvette&nbsp; 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>6-well TC plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC plate</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm round</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>96-well TC plate</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrimethamine</td><td>TCI AMERICA</td><td>P2037-1G</td><td>Gebruik voorzichtigheid bij het gebruik van pyrimethamine-resistente parasieten - zie Protocol</td></tr></tbody></table>
```

qtl mapping en crispr / cas9 editing om een ​​drug resistance gene te identificeren<em&gt; toxoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Wetenschappelijke kennis is intrinsiek verbonden aan beschikbare technologieën en methoden. In dit artikel worden twee methoden gegeven die toelaten voor het identificeren en verifiëren van een geneesmiddel resistentie gen in de Apicomplexan parasiet Toxoplasma gondii , de methode van kwantitatieve trait locus (QTL) mapping met behulp van een genoomkaart met een hele genoom sequentie (WGS) en de methode Van clusterde regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / Cas9-gebaseerde genbewerking. De aanpak van QTL mapping maakt het mogelijk om te testen of er een correlatie bestaat tussen een genomische regio (en) en een fenotype. Er zijn twee datasets nodig om een ​​QTL scan te kunnen uitvoeren, een genetische kaart gebaseerd op de nageslacht van een recombinant kruis en een kwantificeerbaar fenotype dat wordt beoordeeld in elk van de nakomelingen van dat kruis. Deze datasets worden dan geformatteerd om compatibel te zijn met R / qtl software die een QTL scan genereert om significante loci te identificeren die gecorreleerd is met het fenotype. Hoewel dit de zoekopdracht aanzienlijk kan verkleinenInkomst van mogelijke kandidaten, QTL&#39;s strekken zich over regio&#39;s die een aantal genen bevatten waaruit het causaal gen moet worden geïdentificeerd. Het hebben van WGS van de nakomelingen was van cruciaal belang om de causale drug resistentie mutatie op het genniveau te identificeren. Eenmaal geïdentificeerd kan de kandidaat mutatie worden gecontroleerd door genetische manipulatie van geneesmiddelen gevoelige parasieten. De meest eenvoudige en efficiënte methode om T. gondii genetisch te wijzigen is het CRISPR / Cas9-systeem. Dit systeem bestaat uit slechts 2 componenten die beide zijn gecodeerd op een enkel plasmide, een enkelvoudig geleidingsRNA (gRNA) dat een 20 bp sequentie bevat die complementair is aan het genomische doel en het Cas9 endonuclease dat een dubbelstrengs DNA-breuk (DSB) op het doel opwekt, Reparatie van die het mogelijk maakt om sequenties in de pauze plaats in te voeren of te verwijderen. Dit artikel bevat gedetailleerde protocollen om CRISPR / Cas9 gebaseerde genoom bewerkingshulpmiddelen te gebruiken om het gen dat verantwoordelijk is voor sinfungine resistentie te verifiëren en transgene parasieten te bouwen.

Dit artikel schetst in detail verschillende methoden die achtereenvolgens gebruikt kunnen worden om een ​​gen dat verantwoordelijk is voor resistentie tegen resistentie ( figuur 1 ) te identificeren. De 24 nageslacht van het ME49-FUDR r X VAND-SNF r kruis werd beoordeeld op resistentie tegen de drugseinfungin zoals beschreven in Protocol 1. Met behulp van de genetische kaart en het SNF r fenotype van de nakomelingen werd een QTL scan uitgevoerd in R / Qtl - Protocol 2 ( Figuur 2 ). Dit resulteerde in een significante piek op chromosoom IX dat ongeveer 1 Mbp bedroeg. Het is in deze regio dat het causale mutatie zich bevindt. Om de causale mutatie te identificeren, leest WGS van de nakomelingen die zijn afgestemd op het referentiegenoom van het VAND-SNF met Bowtie2 - Protocol 3.1, werden SNPs genaamd VarScan mpileup2snp - Protocol 3.2 en de QTL locus in het VAND genoom werd geïdentificeerd met behulp van MUMmer - ProtocOl 3.3. Nageslacht SNP&#39;s binnen de QTL locus werden geëxtraheerd en gescand voor een patroon waar de SNF r nageslacht een SNP heeft en de SNF &#39;s niet, wat haalbaar is omdat nageslacht SNP&#39;s werden verkregen in vergelijking met het referentiegenoom van het VAND-SNF s ( Figuur 3 ) . Slechts één SNP komt overeen met dit patroon dat resulteert in een vroegtijdige codon in een vermoedelijk aminozuurtransportgener gen genaamd SNR1 . Bevestiging dat SNR1 het SNF r weerstand gen is, werd uitgevoerd met behulp van het CRISPR / Cas9 systeem. Een nieuw CRISPR / Cas9 plasmide dat is ontworpen voor T. gondii genbewerking werd gemaakt met een gRNA dat het SNR1- gen richtte in de buurt van de SNF r- mutatie die in de nakomelingen werd geïdentificeerd - Protocol 4 ( Figuur 4A ). Het SNR1- targetende CRISPR / Cas9 plasmide werd geëproporeerd in een SNF s WT parasiet stam en resistente mutanten werden verkregen wanneer cultusGewijd in 0,3 μM sinfungine. Er werden geen SNF r parasieten verkregen bij elektroporatie met het UPRT targeting CRISPR / Cas9 plasmide. Verscheidene SNF r CRISPR mutanten werden gekloneerd en de regio rond het SNR1 gRNA doel werd sequentiebepalkt. Elke mutant had een indel dat de coderende sequentie van het SNR1- gen verstoorde ( Figuur 4B ). Deze methode kan ook gebruikt worden om een ​​targeting construct in de SNR1 locus te plaatsen via NHEJ ( Figuur 5), of door HR ( Figuur 6 ) - Aanvullend Bestand 2 . <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Figuur 1: Schematische werkstroom voor experimenten in de protocollen. De belangrijkste stappen bij het identificeren en bevestigen van het SNF r- gen met behulp van het ME49-FUDR r X VAND-SNF r kruis worden getoond met verwijzing naar de desbetreffende protocollen die zijn omschreven in tZijn artikel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Figuur 2: R / qtl Commando&#39;s om QTL Scan op het SNF r Phenotype uit te voeren. De opdrachten zoals beschreven in Protocol 2 werden uitgevoerd in R met behulp van het qtl-pakket. Representatieve opdrachten en plot worden getoond. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Figuur 3: Plaatsing van het oorzakelijk SNP. De nakomelingen die WGS leest, werden afgestemd op het referentiegenoom van het VAND-SNF met Bowtie 2, SNPs werden met VarScan genaamd en de corresponderende<html> Ing VAND QTL locus geïdentificeerd met MUMmer. SNP&#39;s in de QTL locus werden geïmporteerd in een spreadsheet en het causale SNP werd geïdentificeerd. SNF r nageslacht (geel), SNF &#39;s nageslacht (groen), SNF r SNP (rood) (zie Gegevensbestand 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Figuur 4: Bevestiging van SNR1 als SNF gen met CRISPR / Cas9. ( A ) CRISPR / Cas9 geïnduceerde indel mutaties (groen) in de SNR1 locus. ( B ) Representatieve indelen in SNR1 veroorzaakt door twee verschillende SNR1 specifieke CRISPR plasmiden (respectievelijk C5 en C6). RH is de WT stam en C5 en C6 zijn SNF r mutanten. (B is uit referentie genomenS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Figuur 5. Insertieve Mutagenese met behulp van CRISPR / Cas9. ( A ) Invoeging van complementaire of transgene genen in het SNR1 locus door CRISPR / Cas9 gemedieerde site-specifieke integratie. Twee mogelijke oriëntaties van het ingevoegde DHFR * mini-gen en de primers gebruikt voor identificatie, F1 / 2 en R1 / 2 vertegenwoordigen de primingplaatsen van oligo&#39;s die in diagnostische PCR&#39;s worden gebruikt. ( B ) Diagnostische PCR&#39;s van een snr1 :: DHFR * kloon, RH wordt gebruikt als een WT controle. PCR van de GRA1p is opgenomen als een controle die de kwaliteit van genomisch DNA controleert als sjablonen. Sterretjes geven rijstroken aan met onspecifieke banden (figuur 5B is uit verwijzing genomenCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Figuur 6: Gene Knockout met CRISPR / Cas9. Een klassiek ontwerp voor CRISPR / Cas9 gemedieerde homologe genvervanging in T. gondii . De oriëntatie van ingevoegd transgeen is in dit geval opgelost. F1 / R1, F2 / R2 en F3 / R3 vertegenwoordigen de primingplaatsen van oligo&#39;s die in diagnostische PCR&#39;s worden gebruikt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Gegevensbestand 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Kruisbestand fOf gebruik in R / qtl, &quot;csv&quot; Format. Een .csv-bestand dat in R / qtl kan worden geladen met de optie = &quot;csv&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Gegevensbestand 2: (ctrl txt, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt en phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r Kruisbestanden voor gebruik in R / qtl, &quot;gary&quot; Format. Zes .txt bestanden die kunnen worden geladen in R / qtl met de optie = &quot;gary&quot; optie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Gegevensbestand 3. Spreadsheet met nageslacht SNP&#39;s over de SNF r <stronG&gt; QTL Locus. Bevat één werkblad met de nageslacht SNPs, en een tweede werkblad met de fenotypische gegevens van de ouders en nageslacht van het kruis. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Aanvullend Bestand 1: Aanvullende Protocol Details. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Aanvullend Bestand 2: Protocol 5 - Gebruik van Negatieve Selectie op de SNR1 Locus voor Genetische Complementatie of Transgene Stamconstructie . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a></a>

Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een ​​drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Het algemene doel van deze methodologie voor quantitative trait locus mapping en CRISPR/Cas9 genoomredigering is het identificeren en vervolgens verifiëren van een gen dat betrokken is bij sinefungine-resistentie in Toxoplasma. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de parasitologie, zoals de genetische basis voor varianten, pathogenese en drugresistentie. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is het gebruik van whole genome sequencing-data voor een precieze QTL-analyse en CRISPR/Cas9 genoomredigering voor efficiënte genetische manipulatie in Toxoplasma.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Robin Powell, een onderzoeker uit mijn laboratorium. De Toxoplasma gondii-parasieten worden gekweekt in confluente humane voorhuidfibroblasten of HFF-cellen, uitgezaaid in T25-flessen met D10-medium. Om individuele nakomelingenclonen op resistentie tegen sinefungine te testen, wordt elke kloon gekweekt tot een hoge parasitendichtheid, totdat de meerderheid van de parasieten de gastheercellen begint te lyseren.Nadat de parasietenoplossing is voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruikt u een pipetteerhulpmiddel om 2,5 x 10⁵ parasieten over te brengen naar een nieuwe T25 HFF-kweekfles met D10-medium, met een werkconcentratie van 0,3 µM van het geneesmiddel sinefungine. Kweek de parasieten bij 37 °C en 5% CO2 gedurende zeven tot 10 dagen. Observeer de HFF-cellaag onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop en score de nakomelingen op het groeifenotype bij blootstelling aan het geneesmiddel sinefungine.Ken bijvoorbeeld een score van nul toe bij geen groei en een score van één bij groei en lysis van de monolaag. Zodra alle nakomelingen zijn gescoord, worden de gegevens gebruikt als een binair fenotype voor quantitative trait locus of QTL-mapping. Om de causale mutatie te identificeren, worden whole genome sequencing reads van de nakomelingen uitgelijnd op het referentiegenoom van de sinefungin-gevoelige van strand, worden SNP's bepaald en wordt de QTL-locus gescand op een SNP die geassocieerd is met sinefungin-resistentie.De bevestiging dat SNR1 het sinefungine-resistentiegen is, zal worden uitgevoerd door SNR1 te inactiveren in een wild-type sinefungine-gevoelige achtergrond met behulp van door CRISPR/Cas9 geïnduceerde indel-mutaties. Om het SNR1-specifieke CRISPR-plasmide te construeren, wordt het UPRT-targeting CRISPR-plasmide gebruikt als template in PCR-gebaseerde site-directed mutagenese met specifiek ontworpen primers. De mutageneseproducten die de gen-specifieke CRISPR-plasmiden van interesse bevatten, worden getransformeerd in E.Coli-cellen.Individuele klonen worden vervolgens gepickt en gekweekt in LB-medium, waarna de geëxtraheerde plasmiden via DNA-gelelektroforese worden geanalyseerd om hun grootte te controleren. De plasmiden worden vervolgens gesequenced om de doelsequentie van het guide RNA te bevestigen. Wanneer het CRISPR-plasmide dat specifiek voor het doelwit is, in een Toxoplasma-cel wordt geïntroduceerd, stuurt het guide RNA het Cas9-nuclease naar het doelwit om een dubbelstrengse DNA-breuk op een specifieke locus in het doelwit te veroorzaken.De DNA-breuk wordt vervolgens hersteld door foutgevoelige, niet-homologe eindverbindingactiviteit, wat leidt tot indel-mutaties in het doelgen. Voeg twee tot drie dagen vóór de transvectie van parasieten met het SNR1-specifieke CRISPR-plasmide voldoende parasieten toe aan een T25-fles met een confluente HFF-cellenmonolaag om binnen twee tot drie dagen een lysis van 70% tot 80% van de HFF-cellen te bereiken. Controleer de cultuur onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop om te bevestigen dat de HFF-monolaag voor 70% tot 80% is gelyseerd door de parasieten.Verwijder voorzichtig het medium met een pipet en was de cellen van het oppervlak van de kolf met vijf milliliter cytomix-buffer. Breng de parasietenoplossing over naar een conische buis van 15 milliliter. Duw de parasietenoplossing twee tot drie keer door een spuit van 10 milliliter met een stompe naald van 22 gauge.Om HFF-cellen en cellulair debris te verwijderen, wordt de parasietenoplossing door een membraan met een poriegrootte van drie micron in een nieuwe conische buis gefilterd. Pelleteer de gefilterde parasieten door centrifugatie bij 400 ×g gedurende 10 minuten. Giet het supernatant af en resuspendeer de gepelletteerde parasieten met 10 milliliters cytomix-buffer.Neem een aliquot van 10 µL om de parasietconcentratie met een hemocytometer te bepalen. Pelleteer de rest van de suspensie opnieuw door centrifugatie bij 400 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in de mixbuffer om een dichtheid van 4 × 10⁷ parasieten per ml te verkrijgen.Meng in een cuvet met een tussenruimte van vier milliliter 250 tot 300 µL van de parasietenoplossing met 7,5 µg CRISPR-plasmide, zes µL ATP en zes µL glutathion. Elektroporeer de parasieten volgens een standaardprocedure voor T gondii-transfectie. Voer een aparte elektroporatie uit als negatieve controle, waarbij een CRISPR-plasmide elders target.Kweek de geëlektroporeerde parasieten in een T25-kolf, gezaaid met HFF-cellen bij 37 °C gedurende twee dagen. Om de procedure voor het onderzoeken van de geïnduceerde mutaties te starten, vervangt u eerst het medium in de kolf door vijf milliliter D10, houdend 0,3 µM sinefungine. Houd de parasieten en het selectiemedium gedurende ten minste drie passages vast totdat de resistente pool stabiel wordt.Zoals aangetoond door de afwezigheid van parasietengroei in de negatieve controlegroep, maar een robuuste parasietengroei in de experimentele groep. Subcloneer de sinefungine-resistente pool om koloniale lijnen te verkrijgen. Verzamel vers uitgetreden parasieten, zuiver deze door filtratie via een drie micron membraan en subcloneer ze in 96-wellsplaten, gezaaid met confluente HFF-cellen in 150 µL D10-medium.Kweek de subcloningsculturen in een CO2-incubator bij 37 degree celsius gedurende zeven tot 10 dagen, zonder de platen te verstoren. Controleer de 96-wellplaten na zeven tot 10 dagen onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Zoek naar wells die slechts één plaque bevatten en markeer deze wells.Breng de cellen van elke put over naar 24-wells platen, waarin HFF-cellen zijn gezaaid. Incubeer bij 37 °C. Wanneer de parasieten de monoclaag beginnen te lyseren, brengt u 50 µL van de parasietenoplossing over naar een nieuwe put om de stam te behouden, en oogst de rest voor isolatie van genomisch DNA.Centrifuge de rest van de parasietenoplossing bij 1000 ×g gedurende 10 minuten. Was de gecentrifugeerde parasieten met PBS en centrifugeer ze opnieuw. Isoleer genomisch DNA uit de gecentrifugeerde cellen met behulp van een commerciële kit of door middel van koken en resuspendeer de parasieten in 50 tot 100 µL PBS.Voer tot slot de PCR uit zoals beschreven in het tekstprotocol om een fragment van het SNR1-gen voor sequencing te verkrijgen. De nakomelingen van de kruising, verkregen met de ouderlijke FUDR-resistente ME49- en sinefungine-resistente van-stammen, werden geanalyseerd op resistentie tegen het geneesmiddel sinefungine, wat werd aangegeven door de groei en lyse van de HFF-monolaag. Een QTL-scan resulteerde in één significante piek op chromosoom negen, over een gebied van ongeveer één MBP.De causale mutatie bevindt zich in deze regio. Volledige genoomsequencing leidde tot de identificatie van de mutatie. SNP's van de nakomelingen binnen de QTL-locus werden geïmporteerd in een spreadsheet en gescand op een patroon waarbij de sinefungine-resistente nakomelingen, in het geel weergegeven, een SNP hebben en de sinefungine-gevoelige nakomelingen, in het groen weergegeven, dit niet hebben.Slechts één SNP, in het rood aangegeven, kwam overeen met dit patroon dat resulteert in een vroegtijdig stopcodon in een vermeend aminozuurtransportgen genaamd SNR1. Wanneer het CRISPR-Cas9-plasmide gericht op SNR1 werd geëlectroporeerd in een sinefungine-gevoelige wildtype parasietenstam, werden resistente mutanten verkregen bij kweek in sinefungine. In tegenstelling hiermee werden er geen sinefungine-resistente parasieten verkregen met een CRISPR-plasmide dat elders gericht was.Verschillende sinefungine-resistente CRISPR-mutanten werden gekloond in de regio rond het SNR1 guide RNA-target en vervolgens gesequentieerd. Representatieve resultaten van de RH wildtype-stam en de C5- en C6 sinefungine-resistente mutanten laten zien dat elke mutant een indel had die de coderende sequentie van het SNR1-gen verstoorde. Vergeet niet dat werken met Toxoplasma gondii gevaarlijk kan zijn, aangezien het infectieus is voor mensen.Tijdens deze procedure moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het correct hanteren van scherpe voorwerpen die in contact kunnen komen met de parasiet. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals CRISPR/Cas9-gemedieerde site-specifieke exogene geninsertie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals genetische complementatie of de constructie van transgene parasieten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de moleculaire parasitologie om de complexe biologie en de pathogenese-mechanismen van Toxoplasma gondii te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u QTL-analyse uitvoert met behulp van genoomsequencing-gegevens, evenals de genetische metabulatie van Toxoplasma gondii met behulp van CRISPR/Cas9-genbewerking.

qtl-mapping-crisprcas9-editing-to-identify-drug-resistance-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Beschrijven we een methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in Plasmodium falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken.

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Hier beschrijven we een protocol om een gen knock-out in de extracellulaire amastigote van Trypanosoma cruzi te introduceren, met behulp van het crispr/Cas9-systeem. De groei fenotype kan worden opgevolgd door de celtelling van de Axenische amastigote cultuur of door proliferatie van intracellulaire amastigotes na de invasie van de cel van de host.

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Hier gepresenteerd is een protocol om de remming werkzaamheid van chemische verbindingen te evalueren tegen in vitro intracellulaire groei van Toxoplasma gondii met behulp van een luciferase-gebaseerde groei test. De techniek wordt gebruikt om remmingsspecificiteit te bevestigen door genetische verwijdering van het overeenkomstige doelgen. De remming van LHVS tegen TgCPL protease wordt als voorbeeld geëvalueerd.

Bepaling van de chemische remmer efficiëntie tegen intracellulaire Toxoplasma Gondii Groei met behulp van een Luciferase-Based Growth Assay

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

Hier presenteren we een protocol om Toxoplasma gondii-stammen snel te identificeren en te genotypen met behulp van draagbare nanopore-sequencing van geselecteerde genetische markers, waardoor schaalbare, gerichte stamidentificatie in laboratoriumonderhouden isolaten mogelijk is met mogelijke toekomstige toepassing in surveillance-omgevingen.

Multi-locus sequencing voor stamtypering van Toxoplasma gondii

Leer QTL-mapping en CRISPR/Cas9-genoombewerking om een geneesmiddelresistentiegen in Toxoplasma gondii te identificeren. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van genetische mechanismen van resistentie.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren

Meer video's verkennen

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een Drug Resistance Gene te identificeren