Voorbereiding en evaluatie van ^99m Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry

Het algemene doel van deze procedure is om technetium-99m gelabelde tetrazines te produceren voor pre-targeted imaging met behulp van bioorthogonale chemie met trans-cycloocteengemodificeerde biomoleculen als targetvectoren. Deze methode biedt een belangrijk nieuw platform voor de ontwikkeling van nieuwe radiofarmaca. Door middel van pre-targeting kunnen de hier beschreven technetiumcomplexen worden gebruikt om een breed scala aan organen, weefsels en bio-markers te visualiseren.

Deze techniek is voordelig omdat het een robuuste stapsgewijze methode biedt om tetrazines radioactief te labelen met technetium-99m, het meest gebruikte medische isotoop in de diagnostische geneeskunde. Deze techniek kan worden gebruikt met verschillende targetvectoren, waaronder kleine moleculen en antilichamen. Het kan ook worden gebruikt voor radiotherapie door technetium te vervangen door bèta-emitterende isotopen van renium.

Nancy Janzen, biologietechnicus in ons lab, zal een deel van de dierprocedures demonstreren. Om de radiolabelingprocedure te beginnen, combineert u in een magnetronbuisje acht milligram kaliumboranocabonaat, 15 milligram natriumcarbonaat, 20 milligram natriumtetraboraat decahydraat en 25 milligram kaliumnatriumtartraattetrahydraat. Zuiver het buisje gedurende 10 minuten met argongas.

Voeg vervolgens vier milliliter technetium-99m pertechnetaat in 0,9%zoutoplossing toe met een activiteit van 1.110 megabecquerel aan het buisje. Laad het reactiemengsel in een magnetronreactor en roer gedurende 10 seconden. Verwarm vervolgens het mengsel gedurende 3,5 minuten op 110 graden Celsius om het triaqua tricarbonyl technetium-99m-kation te verkrijgen.

Voeg ongeveer 400 microliter een molair zoutzuur toe om de pH van de oplossing aan te passen tot 3,5 tot vier. Vervolgens, voor elke tetrazineligande, lost u twee milligram ligand op in 250 microliter methanol. Voeg 250 microliter van het technetium-99m complex toe met een activiteit van 74 megabecquerel aan elke ligandoplossing.

Verwarm het mengsel in een magnetronreactor gedurende 20 minuten op 60 graden Celsius. Voor tetrazineliganden met t-Butyl beschermende groepen, brengt u de oplossing over van een magnetronbuisje naar een 20-milliliter scintillatiebuisje en vervolgens, verdampt u het oplosmiddel en lost u elk complex opnieuw op in één milliliter van een een-op-een oplossing in volume van dichloromethaan en trifluorazijnzuur. Breng vervolgens de oplossing over naar een magnetronbuisje en verwarm die complexen in een magnetronreactor gedurende zes tot 10 minuten op 60 graden Celsius om de liganden te ontdoen van hun bescherming.

Koel de complexen af tot kamertemperatuur en verdampt vervolgens het oplosmiddel. Los de residuen opnieuw op in 500 microliter van een een-op-een waterige oplossing van acetonitril of methanol en water voordat u verder gaat met HPLC-zuivering. Gebruik C18 omgekeerde fase HPLC om elk radioactief gelabeld tetrazinecomplex te zuiveren met een elutiegradiënt van 30 tot 70 tot 40 tot 60 acetonitril tot water gedurende 20 minuten met 0,1% trifluorazijnzuur in het eluent gedurende de gehele procedure.

Verzamel het gezuiverde product wanneer het in de gamma-tracering eludeert. Injecteer vervolgens elk gelabeld complex samen met een oplossing van 0,125 milligram van het corresponderende radium-tetrazinecomplex in 20% methanol in water. Vergelijk de retentietijden van de reniumcomplexpiek in de UV-tracering en de technetiumcomplexpiek in de gamma-tracering om de identiteit van de gammapiek te verifiëren.

Verwijder het oplosmiddel uit elk gezuiverd technetium-tetrazinecomplex. Formuleer elk complex tot een concentratie van 7,4 kilobecquerel per microliter in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,5% runderalbumine en 0,01% polysorbaat 80. Trek voor elk muisonderwerp 100 microliter van een oplossing van vijf microgram per microliter van de TCOPB-afgeleide in zoutoplossing op in een spuit om een dosis van 20 milligram per kilogram voor te bereiden.

Verbind een 30-gauge naald aan de doseerspuit. Plaats het muisonderwerp in een fysiek beveiligingsapparaat. Identificeer de aderen op het laterale oppervlak van de staart ongeveer twee centimeter vanaf het uiteinde van de staart en veeg het gebied af met een alcoholdoekje.

Steek de naald van de spuit in een flauwe hoek parallel aan de ader. Injecteer langzaam de TCOBP-afgeleide. Verwijder de naald en breng een schone gaaszwam met lichte druk aan op de injectieplaats totdat het bloeden stopt.

Een uur na injectie van de TCOBP-afgeleide, toedien je een dosis van 100 microliter van het gewenste technetium-99m tetrazinecomplex met een activiteit van ongeveer 0,74 megabecquerel via injectie in de staartader. Gebruik een dosiscalibrator om de activiteit van een 100 microliter testmonster van het technetiumcomplex op het moment van injectie te meten. Bewaar het testmonster voor latere metingen.

Anesthesiseer de muis zes uur na injectie met een mengsel van 3% isofluraangas en 2% zuurstofgas. Plaats de muis op zijn rug met zijn neus in de neuskoker voor aanhoudende anesthesie en lokaliseer het xifoïdproces. Verbind een 25-gauge naald aan een spuit die voorbehandeld is met heparine.

Steek de naald onder een hoek van 20 graden in onder het xifoïdproces, iets naar links van de middenlijn. Zodra de naald volledig is ingebracht, trekt u langzaam de plunjer terug om te controleren op bloed in de naaldhuid, wat een succesvolle hartpunctie bevestigt. Pas de naald indien nodig aan.

Zodra het hart is gepunct, trek je langzaam één milliliter bloed in de spuit. Breng het bloedmonster over naar een vooraf gewogen meetbuisje. Euthanasie de muis door middel van cervicale dislocatie terwijl deze onder anesthesie is.

Plaats het geëuthaniseerde dier in een plastic zak en meet de activiteit van het hele lichaam met een dosiscalibrator. Verzamel vervolgens de knie- en schouderbotten, de galblaas, de nieren, de lever, de schildklier en luchtpijp,